Ensayos de Retardo de Gel de ARNt de Proteína-ARNt para el Análisis del<emN</em<sup6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Resumen

Se presenta un protocolo para la producción de tRNA (UUU) y el análisis de tRNA (UUU) en complejo con la enzima TcdA mediante ensayos de retardo de gel de agarosa.

Resumen

Demostramos métodos para la expresión y purificación de tRNA (UUU) en Escherichia coli y el análisis por ensayos de retardo de gel de la unión de tRNA (UUU) a TcdA, una N6-treonilcarbamoilandenosina (t6A) deshidratasa, que cicla el treonilcarbamoil Cadena lateral unida a A37 en el lazo del vástago anticodon (ASL) de tRNAs a t ⁶ A cíclico (ct ⁶ A). La transcripción del gen sintético que codifica el ARNt (UUU) se induce en E. coli con 1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y las células que contienen ARNt se recogen 24 h después de la inducción. La fracción de ARN se purifica utilizando el método de extracción con fenol ácido. El ARNt puro se obtiene mediante una cromatografía de filtración en gel que separa eficientemente las moléculas de tRNA de tamaño pequeño de ácidos nucleicos más grandes o intactos o fragmentados. Para analizar TcdA vinculante a tRNA (UUU), TcdA se mezcla con tRNA (UUU) y se separó en un nativo gel de agarosa a 4 ° C.El tRNA libre (UUU) migra más rápidamente, mientras que los complejos TcdA-tRNA (UUU) experimentan un retraso de la movilidad que se puede observar al teñir el gel. Se demuestra que TcdA es un tRNA (UUU) de unión a la enzima. Este ensayo de retardo de gel puede usarse para estudiar los mutantes de TcdA y los efectos de los aditivos y otras proteínas en la unión.

Introducción

El ensayo de retraso del gel ¹ (también conocido como ensayo de cambio de movilidad electroforética, EMSA) es un método electroforético diseñado para estudiar y caracterizar las interacciones proteína-ácido nucleico. Permite el análisis de las interacciones proteína-ADN, así como proteína-ARN y en particular, las interacciones entre las proteínas de unión a tRNA y ARNt, utilizando componentes purificados o mezclas complejas de proteínas ( por ejemplo , lisados ​​celulares) o ácidos nucleicos ( por ejemplo , ARNt quinielas). Hemos aplicado ensayos de retardo de gel al estudio de la interacción entre tRNA purificado (UUU) y TcdA, una N6-treonilcarbamoyladenosina (t ⁶ A) deshidratasa, que cicla la cadena lateral de treonilcarbamoilo unida a A37 en el bucle anticodon del tallo (ASL) De tRNAs a t ⁶ cíclico (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA es también conocido como CsdL ^{3 ,}El gen tcdA / csdL forma un grupo con los genes csdA y csdE ⁵ , que codifican la cisteína desulfurasa y el aceptor de azufre del sistema de cysteine ​​sulfinase desulfinate (CSD) y se requiere para sostener la función TcdA in vivo [ ^3] .

La razón detrás de los ensayos de retardación de gel es que, mientras que las moléculas de ácidos nucleicos libres migran rápidamente al frente de geles de acrilamida o agarosa en virtud de su gran carga negativa, la movilidad electroforética de complejos de proteínas de los mismos ácidos nucleicos se reduce drásticamente. La reducción de la movilidad se visualiza como un "cambio" en los complejos ácido nucleico-proteína, que se resuelven como bandas discretas. El complejo de ácido nucleico-proteína con carga positiva y mayor muestra un mayor cambio o reducción en la movilidad en un gel.

Dado que la neutralización de carga del complejo es un fenómeno universalPara complejos proteína-ácido nucleico, el ensayo de retardo de gel se puede aplicar a una amplia gama de complejos y tipos de ácidos nucleicos. El método es simple, económico y se puede realizar en laboratorios con un equipo mínimo. Requiere sólo pequeñas cantidades de proteínas y tRNA. Esta es una ventaja sobre las técnicas biofísicas alternativas, que usualmente consumen mayores cantidades de muestra.

El ensayo de retardo de gel ha sido ampliamente utilizado para el estudio de factores de transcripción. El ensayo se ha utilizado para analizar la cinética de unión, la resistencia y la especificidad de los factores de transcripción para muchas secuencias de ADN diferentes. Fue precisamente en este campo que se desarrolló por primera vez la EMSA ^{6 , 7} . También se han utilizado ensayos de retardo de gel con moléculas de ARN ^{8 , 9 , 10 , 11} y tRNA en la investigación de ribosomasY analizar, como aquí, las enzimas que modifican nucleósidos de tRNA post-transcripcional.

Muchos parámetros diferentes afectan el resultado de un ensayo de retardo de gel, tal como la temperatura, la calidad de la proteína y la muestra de ARNt, y la resistencia de la unión. La planificación cuidadosa y la ejecución del experimento son cruciales para la interpretación de los resultados del ácido nucleico libre y de las especies ligadas a proteínas. Aquí, se utilizó el gen sintético que codifica tRNA (UUU) clonado en un vector de expresión cuyo promotor carece de la Shine-Dalgarno ribosoma sitio de unión, lo que conduce a la síntesis de grandes cantidades de tRNA ² . Este protocolo detallado pretende proporcionar una guía clara para realizar experimentos de retardo de gel tRNA mientras se evitan errores comunes.

Protocolo

Precaución: Antes de usar, consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) pertinentes. Varios de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y corrosivos. Utilice las prácticas apropiadas al realizar la extracción de ARNt usando fenol, incluyendo el uso de una campana extractora de humos y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados, etc. ). Este protocolo utiliza una tinción de ácido nucleico no tóxica. El uso de manchas alternativas puede requerir precauciones adicionales y eliminación especial del agente de tinción si es tóxico y / o carcinógeno ( por ejemplo , bromuro de etidio).

1. Preparación del gel de agarosa

1. Se pesan 2 g de agarosa y se añade a una botella de vidrio para preparar un gel de agarosa al 2% p / v.
2. Añadir 100 ml de solución tampón de tris-borato-etilendiaminotetraacético (EDTA) (TBE) 1x a la botella que contiene agarosa. Derretir por el calentamiento en un microondas. A intervalos de 30 s, agitar el contenido para mezclarY repita este paso hasta que la agarosa se disuelva completamente. Deje que la solución de agarosa se enfríe a aproximadamente 50-60ºC.
3. Cinta los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde, coloque un peine adecuado para crear los pozos y echar la agarosa fundida en ella. Evitar la formación de burbujas y dejar que se solidifique a temperatura ambiente.
4. Una vez solidificado, coloque la bandeja de gel en una unidad de electroforesis y llénela con tampón TBE hasta que el gel esté completamente cubierto.

2. Preparación del ARNt

1. Express tRNA (UUU) en E. coli
   1. Por la mañana, use un vial de E. coli BL21 congelado (DE3) transformado con el vector de expresión pET23d-EcUUU ² (contiene el gen que codifica el ARNt de E. coli (UUU)), para cortar un caldo de Luria de baja sal (LB) Placa suplementada con 100 μg / ml de ampicilina. Invertir la placa y colocarla en un incubador a 37 ° C hasta que aparezcan colonias (finales de la tardeOon).
   2. Inocular una sola colonia, bien cultivada, en 5 mL LB más 100 μg / mL de ampicilina y crecer durante la noche a 220 rpm a 37 ° C.
   3. A la mañana siguiente, sedimentar las células (6.500 xg durante 10 min a 4 ° C), reemplazar el medio con 5 ml de LB fresco más 100 μg / ml de ampicilina y resuspender. Utilice esta suspensión para inocular 200 ml de LB más 100 μg / ml de ampicilina. Crecer durante 5 h a 220 rpm a 37 ° C.
   4. Cuando la densidad óptica del cultivo a 590 nm (DO ₅₉₀ ) ha alcanzado 0,6 - 0,8, añadir IPTG 1 mM al cultivo para activar la expresión del gen tRNA (UUU). Incubar a 37 ° C durante 3 h.
   5. La cosecha de las células por centrifugación del cultivo a 6.500 xg durante 10 min a 4 ° C.
2. Lisis y extracción
   1. Resuspender el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis (acetato sódico 0,3 M, EDTA 10 mM). A partir de este momento, se usaron tampones autoclavados y se conservaron todas las muestras que contenían ARNt a 4ºC para evitar queDegradación del ARN.
   2. Añadir 1 volumen de fenol ácido (pH 4,3) al sedimento celular resuspendido en la campana extractora. Mezclar durante 1 min por inversión para lisar las células y centrifugar a 10.000 xg (10 min, 4 ° C).
   3. Recoger la fase acuosa superior que contiene el tRNA soluble (UUU) (y concentraciones más pequeñas de los otros grupos de tRNA) usando una pipeta teniendo cuidado de no aspirar la fase orgánica (inferior). Deseche la capa inferior y el sedimento, que consiste en la fase orgánica y los residuos celulares, en un recipiente adecuado.
   4. Precipitar el ARNt mezclando a fondo la fase soluble (acuosa) con 2,5 volúmenes de etanol al 100% v / v por inversión durante 1 h a 4ºC. Centrifugar la mezcla a 15.000 xg (30 min, 4 ° C).
   5. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento rico en ARNt en 4 ml de tampón de filtración en gel (fosfato de sodio 20 mM o fosfato de potasio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Ejecutar 5 μ l del grupo de tRNA resuspendido en un gel de agarosa al 2% p / v.
      NOTA:El tRNA de buena calidad aparece como una sola banda (tamaño molecular entre 50-100 pb).
3. La purificación de tRNA (UUU)
   1. Siguiendo la práctica cromatográfica estándar ¹² , cargar el ARNt resuspendido (UUU) sobre una columna de gel de preparación preparativa de alta resolución (dimensiones: 16 x 600 mm, volumen de lecho: 120 ml, rango de resolución: 1.000-70.000 Da) previamente equilibrada en tampón de filtración en gel (fase móvil). Ajuste el caudal a 1 mL / min para eluir las muestras.
      NOTA: El pico de ARNt (UUU) se eluye aproximadamente a 75,5 ml. Típicamente, se puede obtener un rendimiento de 0,5 - 1,0 mg / L de ARNt de cultivo.
   2. Analizar las muestras a volúmenes de elución representativos mediante electroforesis de 5 - 10 μl de cada muestra en un gel de agarosa al 2% p / v.

3. Preparación de la muestra

1. Expresar y purificar TcdA según López-Estepa et al . ² .
   NOTA: Hasta 250 μMTcdA se puede utilizar para el estudio.
2. Pipetear la cantidad correspondiente de TcdA según la Tabla 1 en tubos de centrífuga de 1,5 mL debidamente etiquetados. Añadir 1,6 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (concentración final) y mezclar suavemente con una pipeta. Cerrar la tapa e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Añadir 10 μM de adenosina trifosfato (ATP) y 50 mM MgCl ₂ (concentraciones finales). Mezclar con una pipeta e incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Añadir tRNA purificado (UUU) (sección 2.3) según la tabla 1 , mezclar con una pipeta e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
5. Añadir solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta 100 μl de volumen final. Mezclar adecuadamente y añadir glicerol hasta una concentración final de 10% v / v.
6. Vórtice la muestra y centrifugue brevemente el contenido del tubo (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Carga de gel y desarrollo de electroforesis

1. Colocar la unidad de electroforesis en una bandeja llena de hielo triturado para mantener la cámara a 4 ° C durante la ejecución de la electroforesis.
2. Cuidadosamente, pipetee 5 μL de cada muestra en el pocillo correspondiente. Añadir un marcador de tamaño de ADN adecuado.
3. Enchufe los electrodos en las ranuras correspondientes de la fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 100 V y haga funcionar el gel durante 90 min.

5. Tinción con gel para observar la interacción ARNt-Proteína

1. Preparar la solución de tinción mezclando 50 ml de TBE con 1x de una tinción de ADN adecuada. Evite exponer la solución de tinción a la luz solar cubriendo el contenedor de tinción con papel de aluminio.
   NOTA: Las manchas de ADN se almacenan normalmente en 10.000 o 20.000x de existencias concentradas.
2. Después de 90 minutos de electroforesis, retire cuidadosamente el gel de la bandeja y colóquelo en un recipiente con solución de tinción. Colóquelo sobre un balancín a baja velocidad de oscilación a temperatura ambienteUre durante 30 min.
3. Retire el gel de agarosa del recipiente de tinción, tóquelo cuidadosamente en un trozo de papel de celulosa o papel de filtro para eliminar el exceso de líquido y colóquelo directamente sobre un transiluminador. Encienda la luz UV para visualizar las bandas que contienen tRNA. Tome una fotografía del gel.
4. Tinción de proteínas (opcional).
   1. Deseche la solución de tinción de ADN de forma segura (de acuerdo con los procedimientos de seguridad) y sustitúyala con 50 ml de solución de Coomassie Brilliant Blue (CBB). Colocar la bandeja sobre un balancín a temperatura ambiente y teñir durante la noche (> 12 h). Deseche la solución de tinción CBB y reemplácela con 50 ml de PBS para eliminar el exceso de colorante. Destainar por 1 h en un balancín.
5. Visualizar los complejos de ARNt que contienen proteínas en un transiluminador ligero y tomar fotografías del gel para comparar con la imagen de gel UV de tRNA.

Resultados

Se pueden obtener grandes cantidades de ARNt (UUU) expresando el gen tRNA en E. coli bajo el control de un fuerte promotor T7 inducible. El tRNA expresado (UUU) se acumula en el citoplasma y se enriquece sobre el conjunto de tRNAs naturalmente abundantes. Se utilizó un proceso de purificación en dos etapas que consistía en una etapa de captura / extracción y un paso de filtración / pulido en gel para obtener tRNA de calidad EMSA. El paso de captura / extracción utiliza pH 4,3 fe...

Discusión

El ensayo de retardo de gel de proteína-ARNt-agarosa descrito en el presente documento puede modificarse de varias maneras. En primer lugar, el porcentaje de agarosa en el gel puede reducirse para permitir la separación y visualización de complejos proteína-ARNt significativamente mayores que el analizado aquí (120 kDa). En segundo lugar, si la proteína diana es termolábil, se deben tomar precauciones adicionales para asegurar que la temperatura se mantiene por debajo de la temperatura máxima aceptable moviendo el apara...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E. coli BL21(DE3)	Novagen	70235	El lisógeno DE3 contiene T7 polimerasa tras la inducción de IPTG.
pET23d	Novagen	69748-3	pET23d confiere resistencia a la ampicilina; Promotor T7.
caldo LB, bajo en sal (caldo Lennox L), caldo granulado	Melford	GL1703	LB convencional, alto en sal.
Ampicilina	Sigma-Aldrich	10419313
Incubadora Agitadora (Termostatizada)	NBS	Excella E24	Se puede utilizar cualquier incubadora agitadora con control de temperatura.
Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), >=99%	Acros Organics	BP1755
Acetato de sodio, anhidro, >99%	Melford	B4017
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sal disódica, >99%	Acros Organics	AC327205000	Nocivo si se inhala.
Centrífuga (refrigerada)	Eppendorf	5430
Rotor centrífuga (refrigerada)	Eppendorf	5430/5430P
Centrífuga	Sorvall	RC5C
Rotor centrífuga	Sorvall	SLA-3000
Solución de fenol, saturada con tampón de citrato 0,1 M, pH 4,3 ± 0,2	Sigma-Aldrich	P4682	Toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación), corrosivo
Absoluto de etanol para análisis, 100% v/v	Merck Millipore	100983
Fosfato de sodio dibásico dihidratado, Na2HPO4, >=99%	Sigma-Aldrich	71643
Fosfato de dihidrógeno potásico, KH2PO4	Merck	48.730.250
HiLoad 16/60 Superdex 75	GE Healthcare	28989333
Agarosa	Melford	MB1200
Tris [Tris (hidroximetil) aminometano HCl]	Melford	T1513
Ácido bórico	Melford	B0503
Microondas	Haier	HDA-2070M
TCEP [Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina]	Sigma-Aldrich	C4706	Corrosivo para los metales y la piel.
ATP [Adenosina 5′-trifosfato hidrato de sal disódica], Grado I, >=99%	Sigma-Aldrich	A2383
Cloruro de magnesio (MgCl2), anhidro, >=98%	Sigma-Aldrich	M8266
Cloruro de sodio (NaCl), >99%	Fisher Bioreagents	BP358
Cloruro de potasio (KCl), >99%	Melford	P0515
NZYDNA Ladder VI	NZYtech	MB8901
Fuente de alimentación	Consort	EV261
Unidad de electroforesis	Real Laboratory	RELSMINI10
Real Safe tinción de ácidos nucleicos	Laboratory Real Laboratory	RBMSAFE	20,000X stock
Transiluminador UV (G:Box/EF)	Syngene	2216498
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich	B0770
Rocker (Gyro-Rocker)	Stuart	SSL3
Mezclador Vortex	Marca Fisher	13214789

También se puede utilizar Real