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Artículo de método

Actuador basado en las células musculares cardíacas y auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

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DOI:

10.3791/55643

9 de mayo de 2017

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este estudio, un actuador biológico y un biorobot de natación autoestabilizante con brazos cantilever funcionalizados elastoméricos se siembran con cardiomiocitos, se cultivan y se caracterizan por sus propiedades bioquímicas y biomecánicas a lo largo del tiempo.

Resumen

En los últimos años se han desarrollado dispositivos híbridos que consisten en una célula viva o un componente de tejido integrado con una columna vertebral mecánica sintética. Estos dispositivos, llamados biorobots, son accionados únicamente por la fuerza generada por la actividad contráctil del componente vivo y, debido a sus muchas ventajas inherentes, podrían ser una alternativa a los robots convencionales totalmente artificiales. Aquí describimos los métodos para sembrar y caracterizar un actuador biológico y un biorobot que fue diseñado, fabricado y funcionalizado en la primera parte de este artículo en dos partes. El actuador biológico fabricado y los dispositivos biorobot compuestos de una base de polidimetilsiloxano (PDMS) y un cantilever de película delgada se funcionalizaron para la fijación celular con fibronectina. Después de la funcionalización, los cardiomiocitos neonatales de rata se sembraron en el brazo en voladizo PDMS a una alta densidad, dando como resultado una hoja de células confluentes. Los dispositivos se visualizaron todos los días y el movimiento del cantiSe analizaron los brazos de palanca. El segundo día después de la siembra observamos la flexión de los brazos en voladizo debido a las fuerzas ejercidas por las células durante las contracciones espontáneas. Tras el análisis cuantitativo de la flexión en voladizo, se observó un aumento gradual en el estrés superficial ejercido por las células a medida que maduraban con el tiempo. Del mismo modo, se observó el movimiento del biorobot debido a la actuación del brazo en voladizo PDMS, que actuó como una aleta. Tras la cuantificación de los perfiles de natación de los dispositivos, se observaron varios modos de propulsión, que fueron influenciados por el ángulo de reposo de la aleta. La dirección del movimiento y la frecuencia de golpeo también fueron determinadas por el ángulo de reposo de la aleta, y se observó una velocidad de nadada máxima de 142 μm / s. En este manuscrito, se describe el procedimiento para poblar los dispositivos fabricados con cardiomiocitos, así como para la evaluación del actuador biológico y la actividad biorobot.

Introducción

Los biorobots son dispositivos basados ​​en células vivas que se incorporan dentro de una columna vertebral mecánica que normalmente está compuesta de materiales blandos y elásticos, tales como PDMS o hidrogeles 1 . Las células sufren contracciones rítmicas, espontáneamente o en respuesta a estímulos, y por lo tanto funcionan como un actuador. La energía generada por la contracción celular impulsa a varios biorobots. Las células del corazón de los mamíferos (cardiomiocitos) y las células del músculo esquelético se usan a menudo para el accionamiento del biorobot debido a sus propiedades contráctiles. Aparte de los cardiomiocitos y las células ....

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos aquí se han llevado a cabo usando un protocolo aprobado y de acuerdo con las regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Notre Dame.

1. Cultivo y siembra de células

  1. Antes de comenzar, preparar los artículos requeridos: un pequeño embudo, pipetas, y medio de Eagle modificado de Dulbecco caliente (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibiótico de penicilina (DMEM completo).
  2. Tome los frascos T-25 junto con el dispositivo funcionalizado (actuador biológico o el biorobot) dentro de él. Consulte la sección 4 de la Part....

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Resultados

El actuador biológico constituido por un ligero voladizo PDMS (25 μm de espesor) y cardiomiocitos constituye el núcleo del biorobot de natación, como se muestra en el esquema y captura de pantalla de los dispositivos de la Figura 1 . Las células comienzan a mostrar contracciones después de 24 h en cultivo, y la flexión de los brazos en voladizo se observó el día 2. El perfil lateral del dispositivo se registró todos los días y el esfuerzo superficial se cuantificó a part.......

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Discusión

El procedimiento descrito aquí describe un método de siembra exitoso para actuadores basados ​​en PDMS y biorobots, lo que facilita la unión de cardiomiocitos. Además, se describió el proceso de adquisición de imágenes y el posterior análisis que caracteriza el comportamiento de las células y el rendimiento de los dispositivos.

Observamos la contracción espontánea de las células en los brazos en voladizo después de 24 h; La intensidad de las contracciones continuó aumentando de manera consta.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

MT Holley es apoyado por el programa Graduate Fellows de la Junta de Regentes de Louisiana, y C. Danielson es apoyado por el Programa de Profesores del Instituto Médico Howard Hughes. Este estudio es apoyado por NSF Grant No: 1530884.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Productos químicos y reactivos
Cardiomiocitos (células cardíacas primarias)Charles RiverNAAislado de ratas Sprague Dawley neonatales de 2 días de edad
Dulbecco' Es un águila modificada' s media (DMEM)Hyclone Laboratories16750-074con 4500 mg/L de glucosa, 4,0 mM de L-glutamina y 110 mg/L de piruvato de sodio
Suero Fetalclone IIIHyclone industries, GE16777-240Suero fetal bovin (FBS)
Dulbecco' tampón de fosfato (PBS)Sigma-AldrichD1408-100ML
Sal sódica de penicilina-GSigma-AldrichP3032
Suero de cabraSigma-AldrichG9023
4,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocoluro en polvo (DAPI)Sigma-AldrichD9542
Fibronectina de plasma bovinoSigma-AldrichF1141Solución (1 mg/ ml)
Kit de calceína-AM y homodímero-1 de etidio (Ensayo vivo/muerto)Sondas molecularesL3224
Sonda molecularcalcio fluo-4, AMF14217colorante indicador de calcio
Solución salina de TyrodesSigma-AldrichT2397solución tampón
Sondas molecularesPlurónicas F-127P3000MPsolución de surfactante no iónico-20 % en dimetilsiloxano (DMSO)
16% ParafomaldehídoMicroscopía electrónica15710Precaución: Irritante y combustible
Triton x-100Sigma-AldrichX-100 100 mLde lisis celular detergente, (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol, t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol terc-octilfenil éter)
ProLong gold reactivo antidecoloraciónSondas molecularesP10144Agente de montaje
Alexa Fluor 594Sondas molecularesA12381Marcador de filamento de actina
Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594 conjugadoSondas molecularesA-11012
phaSondas molecularesA-11001
Anti-conexina 43 AnticuerpoAbcamab11370Marcador de unión gap
Anti-troponina I cardíaca anticuerpoAbcamab10231Proteína contráctil
16% Solución de paraformaldehído de grado EMMicroscopía electrónica100503-916
Polidimetilsiloxano (PDMS)ElsevierSylgard 184
Materiales y equipos
CámaraThor LabsDCC1545M
Luz LED tiraNANACualquier LED blanco sin emisión de espectro
Microscopio confocalNikkon C2NAMicroscopio confocal con juego de tres filtros.
Lente de zoomInfinityModel# 252120
Software
MatlabMathworksNAutilizado en la sección 4) para el análisis de actuadores biológicos.
Imagen JInstituto Nacional de Salud NASoftware de procesamiento de imágenes basado en Java. Utilizado en la Sección 5) para el análisis de biorobots.
Software gratuito de procesamiento y análisis de imágenes en java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor CamThor LabsNASoftware operativo de la cámara
de de faloidina

Referencias

  1. Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
  2. Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274(2012).
  3. Herr, H....

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Siembra de cardiomiocitosdispositivos microfabricadosvoladizo de PDMSadhesión celularactuación de biorrobotsvelocidad de nataciónanálisis de imágenesestrés estáticoestrés dinámicofuerza de tracción celular