Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .
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Artículo de método
Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria
En este artículo
Resumen
Resumen
Los vasos sanguíneos suministran oxígeno y nutrientes en todo el cuerpo, y la formación de la red vascular está bajo un estricto control del desarrollo. La visualización in vivo eficaz de los vasos sanguíneos y la cuantificación confiable de su complejidad son fundamentales para comprender la biología y la enfermedad de la red vascular. Aquí, proporcionamos un método detallado para visualizar los vasos sanguíneos con un colorante fluorescente comercialmente disponible, plasma humano acetilado de lipoproteína de baja densidad DiI complejo (DiI-AcLDL), y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden ser etiquetados mediante una simple inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un embrión y los vasos sanguíneos de todo el embrión se pueden visualizar en embriones vivos o fijos. Combinada con la perturbación génica por la microinyección dirigida de ácidos nucleicos y / o la aplicación en el baño de reactivos farmacológicos, las funciones de un gen o de una vía de señalización sobre el desarrollo vascular pueden ser inveEstigmatizados en una semana sin recurrir a sofisticados animales modificados genéticamente. Debido al sistema venoso bien definido de Xenopus y su angiogénesis estereotípica, el brote de vasos preexistentes, la complejidad de los vasos pueden ser cuantificados eficientemente después de experimentos de perturbación. Este protocolo relativamente simple debe servir como una herramienta de fácil acceso en diversos campos de la investigación cardiovascular.
Introducción
La vasculogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos de células endoteliales recién nacidas y la angiogénesis, la formación de nuevos vasos de vasos preexistentes, son dos procesos distintos que configuran la vasculatura embrionaria 1 . Cualquier desregulación en estos procesos da como resultado varias enfermedades del corazón y anomalías estructurales de los vasos. Además, el crecimiento tumoral está asociado con un crecimiento descontrolado de vasos. Como tal, los mecanismos moleculares subyacentes a la vasculogénesis y la angiogénesis son objeto de intensa investigación [ 2] .
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Protocolo
Todos los experimentos cumplieron con los protocolos aprobados por el Colegio Universitario de Medicina de la Universidad de Medicina Institucional Cuidado de Animales y Comités de Uso.
1. Preparación de los embriones de Xenopus tropicalis
NOTA: Los embriones de Xenopus tropicalis se produjeron como se describió anteriormente 10 , con ligeras modificaciones. Xenopus tropicalis embriones se realizaron de acuerdo con las tablas de Nieuwkoop y Faber [ 11] .
- Inducción de la ovulación
- Para inyectar la gonadotropina coriónica ....
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Resultados
Cronología de los experimentos (Figuras 1 y 2)
Poco después de la fecundación, la microinyección dirigida se puede realizar para modular la expresión génica. Por ejemplo, se puede inyectar un MO antisentido que se une específicamente al codón de iniciación del ARNm de Tie2 endógeno, inhibiendo la traducción del mRNA diana de Tie2 por impedimento estérico. Un MO puede conjugarse con fluoresceína para el fácil rastreo visual de emb.......
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Discusión
El protocolo presentado aquí fue desarrollado por Ali H. Brivanlou y sus colegas para investigar eventos de desarrollo durante la formación vascular en Xenopus laevis 4 , pero, como se muestra en este manuscrito, se puede aplicar a otros animales pequeños. La inyección de colorante en el corazón es simple de realizar, y toda la red vascular puede ser visualizada bajo un microscopio de disección de fluorescencia, así como un microscopio confocal. Si el colorante se inyecta en el corazón d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio se inspiró en el trabajo de Levine et al. , Que describió este método experimental y proporcionó una descripción completa del desarrollo vascular en Xenopus laevis. Damos las gracias a los miembros de nuestro laboratorio por su aporte. Este estudio fue apoyado por la Iniciativa de Investigación Futura de la Universidad de Yonsei de 2015 (2015-22-0095) y el Programa de Desarrollo de Tecnología Biológica y Médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el ministerio de Ciencia, TIC y Planificación del Futuro NRF - 2013M3A9D5072551)
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de Petri de 35 mm | SPL | 10035 | Marco de molde Sylgard Placa |
| Petri de 60 mm | SPL | 10060 | Bandeja de cría de embriones |
| Vidrio de borosilicato | Instrumento Sutter | B100-50-10 | Aguja inyectable |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Reactivo de recubrimiento |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reactivo | 0.1x MBS componente | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | Para imagen confocal |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Solución de tinción |
| recipientes FBS | Hyclone | SH.30919.02 | Para el almacenamiento de testículos |
| Iluminador de fibra óptica | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Tampón de inyección |
| Tirador de micropipetas aplanado/marrón | Instrumento Sutter | P-97 | Tirador de aguja de inyección |
| Pinza | Fine Science Tool | 11255-20 | Para la eclosión de embriones y corte de la punta de la aguja |
| Plato con fondo de vidrio | SPL | 100350 | Para imágenes confocales |
| hCG | MNS Korea | Para el cebado de ranas | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Agente amortiguador |
| Incubadora | Lab. Companion | ILP-02 | Para la cría de embriones |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS componente |
| L15 medio | Gibco | 11415-114 | Para el almacenamiento de testículos |
| L-cisteína | Sigma | 168149-100G | Reactivo desgelatinizante |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtubo | Axygen | MCT-175-C-S | Para el almacenamiento de testículos |
| MS222 | Sigma | E10521 | Polvo anestésico |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS componente |
| NaOH | Sigma | S-0899 | Reactivo de ajuste de pH |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | Fijadores |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Tampón para la imagen |
| papel pH | Sigma | P4536-100EA | Para confirmar |
| pH INYECTOR DE PICOLITROS | Waner instruments | PLI-100A | Para inyección |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | Para incisión |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | Para incisión |
| Microscopio binocular de precisión con zoom estéreo | World Instrumentos de precisión | PZMIII | para el cribado visual |
| Micromanipulador de control manual estándar | Instrumentos Waner | W4 64-0056 | Para microinyección |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | Para inyección de DiI | |
| transferencia | Korea Ace Scientific Co. | Ym. B78-400 | Para la recolección de óvulos y embriones |
Referencias
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascu....
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Reimpresiones y permisos
