Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Resumen

Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.

Resumen

Las plaquetas de la sangre son actores esenciales en la hemostasia, la formación de trombos para sellar las brechas vasculares. También están implicados en la trombosis, la formación de trombos que ocluyen la vasculatura y lesionan los órganos, con consecuencias potencialmente mortales. Esto motiva la investigación científica sobre la función de las plaquetas y el desarrollo de métodos para rastrear los procesos celulares y biológicos a medida que se producen en condiciones de flujo.

Una variedad de modelos de flujo están disponibles para el estudio de la adhesión de las plaquetas y la agregación, dos fenómenos clave en la biología de plaquetas. Este trabajo describe un método para estudiar la desgranulación de plaquetas en tiempo real bajo flujo durante la activación. El método hace uso de una cámara de flujo acoplada a una instalación de bomba de jeringa que se coloca bajo un microscopio de fluorescencia de LED de gran campo, invertido. La configuración descrita aquí permite la excitación simultánea de múltiples fluoróforos que son suministrados por anticuerpos marcados fluorescentemente o fluorescentesColorantes. Después de experimentos de formación de imágenes de células vivas, los vidrios de cubierta se pueden procesar y analizar posteriormente usando microscopía estática ( es decir, microscopía confocal o microscopía electrónica de barrido).

Introducción

Las plaquetas son células anucleadas que circulan en el torrente sanguíneo. Su función principal es sellar las brechas vasculares en los sitios de lesión y prevenir la pérdida de sangre. En estos sitios de lesión, las fibras de colágeno subendoteliales quedan expuestas y son posteriormente cubiertas por la proteína multimérica, el factor de von Willebrand (VWF). VWF interactúa con las plaquetas en circulación en un mecanismo que depende de la glicoproteína Ibα-IX-V complejo en la superficie celular ¹ , ralentizar la velocidad de las plaquetas. Esto es particularmente importante a altas velocidades de cizallamiento. Las plaquetas sufren posteri....

Protocolo

El comité médico ético local del centro médico de la universidad Utrecht aprobó el drenaje de la sangre para los propósitos ex vivo de la investigación, incluyendo los de este estudio.

1. Preparación de la solución

1. Preparar un tampón de Tyrode del ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) disolviendo HEPES 10 mM, Na2HPO4 0,5 mM, NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgSO $ ₄ $ 1 mM y D5- Glucosa en agua destilada.
   1. Hacer dos variantes de la memoria intermedia: establecer los niveles de pH en 6,5 y en 7,4, respectivamente. Hacer buffer fresco para cada día de experimentos. Suplemento con 10 ....

Resultados

La figura 1 muestra imágenes de la cámara de flujo y disposición experimental; La posición y dimensiones de la lámina de silicio; Y conexiones de tubería. La figura 2 proporciona detalles sobre las dimensiones de la cámara de flujo. La Figura 3 y la Pelıcula 1 muestran una serie cronológica de imágenes de adhesión y esparcimiento de plaquetas sobre VWF inmovilizado. CD63 es una prot.......

Discusión

En todo el mundo, la trombosis es una causa principal de muerte y morbilidad, y las plaquetas juegan un papel central en su desarrollo. Este trabajo describe un método para la obtención de imágenes de células vivas de la desgranulación plaquetaria bajo flujo. Generalmente se supone que, cuando las plaquetas se activan, todos los contenidos granulares se liberan directamente en la solución. Los resultados que acompañan sugieren que esto no es necesariamente el caso. Durante la adhesión y la desgranulación, las plaquetas .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES)	VWR	441476L
Na2HPO4	Sigma	S-0876
NaCl	Sigma	31434
KCl	Sigma	31248
MgSO4	Merck KGaA	1.05886
D-glucosa	Merck KGaA	1.04074
Prostaciclina	Cayman Chemical	18220
Citrato trisódico	Merck KGaA	1.06448
Ácido cítrico	Merck KGaA	1.00244
Cubreobjetos	Menzel-Glä ser	BBAD02400500#A	24 x 50 mm, Nº 1 = 0,13 - 0,16 mm de espesor.
Ácido cromosulfúrico (2% CrO3)	Riedel de Haen	07404	CAS [65272-70-0].
Factor de Von Willebrand (VWF)	purificado
		FIB3L
Plato de 4 pocillos, sin tratar	Thermo Scientific	267061
Fracción de albúmina sérica humana V	Haem Technologies Inc.
Tubos de extracción de sangre, 9 mL, 9NC Citrato de sodio para la coagulación 3,2%	455322		Greiner Bio-One
		de hematología CELL-DYN	Abbott Diagnostics
Paraformaldehído	Sigma	30525-89-4
Bomba de jeringa	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Harvard apparatus 22
Jeringa de 10 mL con 14,5 mm de diámetro	BD biosciences	305959	Luer-Lok jeringa
Anti-CD63-biotin	Abcam
Anti-CD62P-biotina	R& D Systems	Dy137
4',6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)	Polysciences Inc.	9224
Estreptavidina, Alexa Fluor 488 conjugado	Thermo Scientific	S11223
Aceite de inmersión	Zeiss	444963-0000-000
Solución detergente	Unilever, Biotex
Glycine	Sigma	56-40-6
Alcohol polivinílico	Sigma	9002-89-5	Mowiol 40-88.
Clorhidrato de Tris	Sigma	1185-53-1
1,4-diazabicíciclo[2.2.2]octano (DABCO)	Sigma	280-57-9
Ovejas Anti-hVWF pAb	Abcam	AB9378
Alexa fluor 488-NHS	Thermo Scientific	A20000
Glicerol	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
Película Parafinn	Bemis	PM-996	4 pulgadas x 125 pies Rollo.
Lámina de silicona no reforzada	Nagor	NA 500-1	200 mm x 150 mm x 0,125 mm.
Lámina de silicona cortada a medida con canales de perfusión y vacío	de fabricación		Fabricado en lámina de silicona no reforzada (Nagor, NA 500-1)
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf AG	T9661-1000AE
Microscopio fluorescente	Zeiss Observer Z1		Equipado con luces LED de excitación.
Software de microscopio	Zeiss ZEN 2	edición
Aguja de 18 G (18 G x 1 1/2")	BD biosciences	305196
NaCl	Riedel de Haen	31248375
Tris	Roche	10708976
Pipeta pasteur de plástico	VWR	612-1681	7 mL no estériles, graduados hasta 3 mL.
Tubo de silicona	VWR	228-0656	Diámetro interior. x Diámetro exterior x Espesor de pared = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.
Portaobjetos de microscopio	Thermo Scientific	ABAA000001##12E	76 x 26 x 1 mm, bordes rectificados 45 °, extremo esmerilado.

Laboratorio de investigación de enzimas de fibrinógeno internamente823022Analizador de células de Analizador de AB134331 propia azul