Determinación de alta afinidad anticuerpo-antígeno Cinética de unión usando cuatro plataformas Biosensor

Summary

Se describe aquí protocolos para la medición de antígeno-anticuerpo de afinidad y la cinética utilizando cuatro plataformas de biosensores de uso común vinculante.

Abstract

biosensores ópticos etiqueta libre son poderosas herramientas en el descubrimiento de fármacos para la caracterización de interacciones biomoleculares. En este estudio, se describe el uso de cuatro plataformas de biosensores utilizados rutinariamente en nuestro laboratorio para evaluar la afinidad de unión y la cinética de diez anticuerpos de alta afinidad monoclonales (mAbs) contra proproteína convertasa subtilisina humana Kexin tipo 9 (PCSK9). Mientras tanto Biacore T100 y ProteOn XPR36 se derivan de la Resonancia bien establecida Plasmon Superficie tecnología (SPR), el primero tiene cuatro células de flujo conectados por la configuración de flujo en serie, mientras que el último presenta 36 puntos de reacción en paralelo a través de una improvisada 6 x 6 entrecruzado configuración de los canales de microfluidos. El IBIS MX96 también opera basado en la tecnología de sensor SPR, con una función de proyección de imagen adicional que proporciona la detección en la orientación espacial. Esta técnica de detección acoplada con el flujo Microspotter continuo (CFM) se expande el rendimiento significativamente por correonabling impresión array multiplex y la detección de 96 deportes de reacción simultáneamente. En contraste, el Octeto RED384 se basa en el principio óptico biocapa Interferometría (BLI), con sondas de fibra óptica que actúa como el biosensor para detectar patrón de interferencia cambia en las interacciones de unión en la superficie de la punta. A diferencia de las plataformas basadas en SPR, el sistema de BLI no se basa en fluidos de flujo continuo; en cambio, las puntas de los sensores recogen lecturas mientras están sumergidos en soluciones de analito de una microplaca de 384 pocillos durante la agitación orbital.

Cada una de estas plataformas de biosensores tiene sus propias ventajas y desventajas. Para proporcionar una comparación directa de la capacidad de estos instrumentos para proporcionar datos cinéticos de calidad, los protocolos descritos ilustran experimentos que utilizan el mismo formato de ensayo y los mismos reactivos de alta calidad para caracterizar la cinética de anticuerpo-antígeno que se ajustan a la sencilla 1: modelo de interacción molecular 1 .

Introduction

La adquisición de parámetros cinéticos fiables para caracterizar las interacciones anticuerpo-antígeno es un componente esencial del proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos¹. Los biosensores de resonancia óptica de plasmón de superficie (SPR), el "estándar de oro" para la detección en tiempo real de estas interacciones, se han utilizado durante aproximadamente dos décadas para permitir la selección temprana de candidatos a anticuerpos terapéuticos que cumplan con los criterios^2,3. Además de proporcionar una clasificación de afinidad de los candidatos a anticuerpos mediante el cribado rápido de unión de sobrenadantes crudos⁴, y rigurosas determinaciones de constantes cinéticas de preparaciones purificadas⁵, los biosensores pueden diferenciar aún más la actividad funcional de los candidatos principales a través de estudios de agrupación de epítopos^6,7.

Para satisfacer la creciente demanda de productos basados en anticuerpos para diversas indicaciones terapéuticas⁸, en los últimos años se han desarrollado una amplia variedad de innovadores instrumentos biosensores que aumentan la eficiencia de la identificación y caracterización de candidatos^9,10. Estos instrumentos difieren en el diseño de la configuración de los canales microfluídicos y/o en los principios ópticos implicados en la detección de interacciones biomoleculares. En concreto, el Octet RED384¹¹, ProteOn XPR36¹² e IBIS MX96⁷ han ampliado el número de interacciones medidas en un solo ciclo de enlace a 16, 36 y 96 respectivamente, lo que representa mejoras significativas en el rendimiento con respecto a la plataforma Biacore tradicional. Aunque todas estas plataformas de biosensores proporcionan datos cinéticos esenciales para caracterizar las interacciones anticuerpo-antígeno, difieren en la configuración experimental y los procedimientos operativos debido a las variaciones en las configuraciones instrumentales. Por ejemplo, en la plataforma de matriz de imágenes SPR del IBIS MX96, el paso de inmovilización del ligando multiplex se realiza en modo fuera de línea en un dispositivo de impresión externo separado del detector^7,13; Por el contrario, las otras tres plataformas de biosensores utilizan una configuración "todo en uno", en la que la adición de un componente a la superficie del sensor, ya sea el reactivo de activación, el ligando o el analito, se registra en tiempo real y a través de comandos preprogramados en orden secuencial. En el Octet RED384, una característica única de esta plataforma basada en interferometría de biocapa (BLI) es la disponibilidad de biosensores de fibra óptica prerrevestidos para uso inmediato de "inmersión y lectura¹⁴, lo que elimina la necesidad de preparación de la superficie del ligando y pasos de iniciación/acondicionamiento, que a menudo se requieren para los chips sensores en plataformas basadas en SPR. El diseño libre de fluidos de este instrumento también simplifica la mecánica y evita problemas de obstrucción y contaminación cuando se trata de muestras crudas. Con el novedoso diseño fluídico entrecruzado de 6 x 6 en el ProteOn XPR36, se puede implementar un enfoque cinético de "un solo disparo" cambiando los canales de flujo entre direcciones horizontales y verticales para crear 36 puntos de interacción¹⁵. En lugar de evaluar la cinética de unión de un ligando o concentración de analito a la vez, como se hace en la plataforma Biacore T100 de flujo en serie tradicional, este enfoque ofrece la capacidad de monitorear hasta 36 interacciones diferentes simultáneamente en un solo ciclo de unión.

A pesar de sus diferencias, estas cuatro plataformas de biosensores son ampliamente utilizadas por muchos laboratorios en todo el mundo. Para los nuevos usuarios con poca experiencia práctica en biosensores, decidir qué instrumento usar puede ser una tarea desafiante dadas las diferencias en el diseño del instrumento. Para determinar el instrumento más apropiado para sus propósitos de investigación, factores como la calidad de los datos, la consistencia del rendimiento, el rendimiento, la facilidad de operación y el consumo de materiales deben considerarse colectivamente. Si bien varios estudios de referencia han explorado la variabilidad de las constantes de velocidad cinética obtenidas de múltiples laboratorios y biosensores^5,16, un estudio comparativo cara a cara publicado recientemente aborda aún más los factores sistemáticos que influyen en la fiabilidad de los datos desde el punto de vista del rendimiento instrumental^17,18. Los protocolos suministrados en este video se centran en la configuración experimental y los procedimientos en detalle, y se acompañan del artículo de investigación titulado, "Comparación de plataformas de biosensores en la evaluación de cinéticas de unión de antígeno anticuerpo de alta afinidad"¹⁷. Estos protocolos están destinados no solo a ayudar a los nuevos usuarios de biosensores a implementar estos instrumentos para sus fines de investigación, sino también a proporcionar información adicional para los usuarios actuales de biosensores con respecto a los desafíos técnicos y las consideraciones en los diseños experimentales para evaluar las interacciones anticuerpo-antígeno de alta afinidad.

Protocol

1. Las proteínas y anticuerpos

1. Producir y purificar la subtilisina proproteína convertasa humano Kexin tipo 9 (PCSK9) y diez mAbs anti-PCSK9 derivadas de ratón como se ha descrito previamente ^17.
2. Evaluar la pureza de los productos purificados mediante la inyección secuencial 10 g de cada muestra en una columna de exclusión por tamaño analítica (SEC) usando un sistema de UPLC ^19.

2. Las mediciones cinéticas en el Biacore T100

1. Instrumento y Preparación de los reactivos
   1. Equilibrar el chip sensor CM5 a temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Descongelar dos partes alícuotas de 200 l de hidrocloruro 200 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y dos partes alícuotas de 200 l de 50 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS) a temperatura ambiente.
   3. Preparar una botella de 1 L de 1x HBS-EP (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y 0,005% v / v de polisorbato P20) tampón de ejecución por dicementación una solución 10x HBS-EP + madre en agua.
   4. Preparar 1 ml de proteína A / G en 30 mg / ml en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5) y 500! L de cada muestra de mAb a 0,063 g / ml en el tampón de ejecución HBS-EP. Descongelar un vial congelado de PCSK9 humano en hielo.
   5. En el software de control, haga clic en "Herramientas | Expulsar Chip", coloque el chip sensor en la vaina y cerrar. Haga clic en "Herramientas | Ajuste de la temperatura", escriba "25" ° C como temperatura de análisis y "10" ° C como la temperatura del compartimiento.
2. La inmovilización de superficie
   1. En el software de control, haga clic en "Archivo | Nueva plantilla Asistente Abrir /" y seleccione "inmovilización" de la lista en el panel de la izquierda.
   2. Haga clic en "Nuevo" para entrar en la ventana de configuración de la inmovilización. Elija "CM5" como el tipo de chip y seleccionar "1" celda de flujo por ciclo.
   3. Marque la casilla junto a cada "célula de flujo Inmovilizar 1/2/3/4" a Activate La opciones. Seleccionar "Objetivo de nivel inmovilizado" y "Amina" como método para todas las celdas de flujo.
   4. Enter "30 mg / mL ProA / G" como ligando, asegúrese de que el nivel objetivo se establece en "10000" unidades de respuesta (RU) para todas las células de flujo.
   5. Marque "Primer antes de correr", y haga clic en "Siguiente". Seleccionar "Reactivo Estante 2", a definir la ubicación de los reactivos y la pipeta en viales de muestra individuales en consecuencia. Introduzca la rejilla de nuevo en el instrumento, a continuación, haga clic en "Inicio" y escriba un nombre experimento para ser guardado para iniciar la carrera.
3. Analito y ciclos de regeneración
   1. Haga clic en "Archivo | Nuevo método abierto /", seleccionar "20140812 hu anti-IgG de PCSK9 unión a Hu PCSK9" y abrir el método. Revisar los parámetros del método.
   2. En "Ensayo de pasos", aseguran hay 10 ciclos en los que "hu PCSK9" es el nombre con "muestra" seleccionado en "Purpose". El número de duplicados se establece en '1'.
   3. En "Tipos de ciclos", ajuste el tiempo de contacto a "220" s para la captura 1 más de trayectoria de flujo de "2", "110" s para Capture 2 más de trayectoria de flujo de "3", y "55" s para la captura 3 más de trayectoria de flujo "4". La velocidad de flujo es "10" l / min para todos los ciclos de captura.
   4. Seleccionar "Muestra 1", marque "Solución de muestra", como variable. Ajuste el tiempo de contacto a "600" s y el tiempo de disociación a "2700" s más de trayecto de flujo "1, 2, 3, 4". La velocidad de flujo se establece en "30" l / min.
   5. Seleccionar "Regeneración 1", introduzca "glicina-HCl pH 1,5" en el campo solución y ajustar el tiempo de contacto a "20" s más de trayecto de flujo "1, 2, 3, 4".
   6. En "variables de configuración", introduzca 2 veces titulando concentraciones de "100 nM - 6,25 nM" para el ciclo 1-3, "50 nM - 3,12 nM" para el ciclo 4-8, y "5 nM - 0,323 nM" fo Ciclo 9-10.
   7. En "Configuración de ejecución", elegir el camino de flujo de detección "2-1, 3-1, 4-1", haga clic en "Siguiente", marque "Primer antes de correr", y haga clic en "Siguiente".
   8. Seleccionar "de muestra y reactivo del estante 1", defina la ubicación de los reactivos y la pipeta en viales de muestra individuales en consecuencia. Introduzca la rejilla en el instrumento, a continuación, haga clic en "Inicio" y escriba un nombre experimento para ser guardado para iniciar la carrera.
4. Análisis de datos mediante BIAevaluation
   1. Haga clic en "Cinética / Affinity | unido a la superficie", elija Fc "2-1", "3-1", o "4-1" por separado y se les presentarán todas las curvas mostradas de las diversas concentraciones de analitos, así como el "cero" blanco concentración.
   2. Haga clic en "Siguiente" para obtener el búfer en blanco curvas sustraídas. A continuación, haga clic en "Cinética", elegir el: modelo "1 1 Encuadernación" y haga clic en "Fit" para obtener el paráme cinética equipadatros.
   3. Para el ajuste global de múltiples superficies de mAb, haga clic en "Múltiple R _max" en la parte inferior y añadir las curvas de unión de los otros FCS durante el mismo mAb a la lista.
   4. Haga clic en "Siguiente" para obtener todos los búfer en blanco curvas de unión sustraídas. Entonces haga clic en "Kinetics," seleccionar "1: 1 Encuadernación" modelo, y elija "encaja local" para cada R _max en los parámetros para obtener los parámetros cinéticos a nivel mundial armarios.

3. Las mediciones cinéticas en la XPR36 ProteOn

1. Instrumento y Preparación de los reactivos
   1. Equilibrar un chip sensor GLM y una botella de 2 L de PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% de Tween-20, y 3 mM de EDTA) tampón a temperatura ambiente corriente durante 15 min.
   2. En el software de control, haga clic en "Expulsar" y luego insertar el chip GLM. Establecer la temperatura del chip a "25" ° C y la temperatura del inyector automático a "10" ° C.Haga clic en "Glicerol inicialización" y siga las instrucciones que se le pida que inicializar el chip.
   3. Haga clic en "Archivo | Abrir" un protocolo de pre-acondicionamiento de la lista, preparar soluciones en una placa de 96 pocillos. A continuación, haga clic en "Ejecutar", seleccionar el protocolo y haga clic en "Inicio".
   4. Descongelar una alícuota de 1 ml de EDC 400 mM y una alícuota 1 ml de 100 mM N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) a temperatura ambiente.
   5. Preparar 2 ml de proteína A / G en 60 mg / ml en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5) y 500! L de cada muestra de mAb a 0,25 g / ml, 0,125 mg / ml, y 0,063 g / ml en el PBS-T EDTA tampón de ejecución. Descongelar un vial congelado de PCSK9 humano en hielo.
2. Inmovilización, analito y Regeneración
   1. Haga clic en "Archivo | Nuevo | Nuevo Protocolo". En "Configuración", introduzca el nombre del experimento, de selección de chip "GLM", seleccione "Microplacas", y escriba "2,2" ml de volumen.
   2. Seleccionar"Protocolos | muestras", definen "EDC / sulfo-NHS" como "activador" en pocillos H1-H6, "Protein A / G" como "ligando" en G1-G6 "etanolamina" como "Desactivador" en F1-F6 , "glicina" como "regenerador" en E1-E6, PBS-T-EDTA "como "blanco" en D1-D6, "muestra X mAb" como "ligando" en C1-C6, y "PCSK9 humano" como" analito en pocillos H1-H6 en una segunda placa de 96 pocillos.
   3. Seleccionar "Pasos", haga clic doble "inmovilización" en el "Editor Protocolo", los pasos incluyen tres inyecciones posteriores horizontales de EDC / sulfo-NHS, proteína A / G, y 1 M etanolamina cada uno a una velocidad de flujo de "30" l / min y un tiempo de contacto de "300" s.
   4. Haga clic en "Regenerar", inyectar tres "18" -s pulsos de glicina (pH 1,5) a "100" l / min tanto en las direcciones horizontal y vertical, seguido por dos "60" -s pulsos de PBS-T-EDTA a "25" l / mintambién en ambas direcciones.
   5. Haga clic en "Ligando", inyectar mAb 1 mAb 2 en la dirección vertical usando una tasa de flujo de "25" l / min y un tiempo de contacto de "160" s.
   6. Haga clic en "analito", inyectar cinco concentraciones de PCSK9 humano (100 nM a 6,25 nM en 2 veces diluciones en serie) y un blanco de tampón más de 6 canales horizontales simultáneamente, por "40" l / min para "600" s de tiempo de asociación seguido por "2700" s de tiempo de disociación.
   7. Haga clic en "Regenerar", inyecte dos "18" -s pulsos de glicina (pH 1,5) a "100" l / min en las direcciones horizontal y vertical.
   8. Repita los pasos anteriores después de cada ciclo de unión para los mAb restantes.
      NOTA: Además de la 100 nM - 6,25 nM serie de concentración PCSK9 humano, 25 nM - 1,56 nM y 5 nM - se utilizan 0,313 serie de concentración nM.
   9. Preparar las muestras y reactivos en dos placas de 96 pocillos de acuerdo con las posiciones de reactivosdefinida en el paso 3.2.2, a continuación, haga clic en la pestaña "Ejecutar", seleccione el protocolo / experimento y haga clic en "Inicio".
3. Análisis de datos mediante el Administrador de ProteOn
   1. Haga clic en "Panel de Tipo" y seleccione "analito". A continuación, haga clic en "Protocolo de Paso" y seleccionar todas las curvas de unión en la lista.
   2. Haga clic en "Proceso automático", y haga clic en "Proceso | canal de referencia | Interspot". A continuación, haga clic en "Proceso | Referencia Doble | Fila | A6".
   3. Haga clic en "Crear conjunto de datos" para guardar conjuntos de datos individuales para cada mAb en las tres superficies para el análisis cinético.
   4. Haga clic en "Análisis del conjunto de datos", resalte cada conjunto de datos mAb y haga clic en "Análisis | cinético". Elegir el modelo "Langmuir" y "simultánea ka / kd" y haga clic en "Siguiente".
   5. Destacar tanto la asociación y disociación rango de ajuste, seleccione "local" _Rmax, y haga clic en "Siguiente" para realizar el ajuste para obtenerlos parámetros cinéticos empotrados.
   6. Repetir el paso anterior pero elegir "agrupados" R _max para la instalación para obtener los valores R _max experimentales para el cálculo de la actividad superficial de ligando.

4. Las mediciones cinéticas en el Octeto RED384

1. Reactivo y Preparación de placa de la muestra
   1. Preparar 50 ml de 1x KB (Kinetic tampón que contiene PBS pH [7,4], 0,02% de Tween-20, 0,1% de albúmina, y 0,05% de azida de sodio) por dilución de una solución 10 veces en PBS.
   2. Dispensar el 1x KB en una placa de 96 pocillos a 200 l por pocillo. Hidrato consejos biosensores 48 de captura anti-humana (AHC) en estos pozos individuales para al menos 10 min.
   3. Preparar cada muestra mAb a 20 mg / ml, 10 mg / ml, y 5 mg / ml en 1X KB, así como PCSK9 humano a los 7 concentraciones valoradas de 100 nM a 1,56 nM en 2 veces diluciones seriadas.
   4. Cargar las muestras de mAb en una microplaca de 384 pocillos inclinada-inferior (referred como la placa de reactivo) y las soluciones PCSK9 humanos en otra microplaca de 384 pocillos (referido como la placa de muestra) a 90! l por pocillo.
   5. serie de carga de 1x KB y glicina (pH 1,5) soluciones en los pozos dentro de la placa de muestra.
      NOTA: Estos pozos KB 1x se utilizan para el acondicionamiento previo de chip, la estabilización de la línea de base, y la disociación del analito. La solución de glicina se utiliza para la regeneración.
2. Configuración Método Experimental
   1. En el software de adquisición de datos, haga clic en "Experimento | Nuevo Asistente Experimento | Nueva Cinética Experimento | Cinética básicos".
   2. En "Placa Definición", siga los siguientes pasos para definir los tipos de muestra y posiciones.
      1. Seleccionar canales "16" y el formato "384 pozos".
      2. Definir las ubicaciones de muestra y reactivo en la pantalla placa manteniendo pulsada la tecla de Mayúsculas mientras clic izquierdo en el pozo para resaltar 16 pocillos a la vez.
      3. Haz clic derecho en ellos pocillos que contienen las muestras de mAb y seleccionar "Load" para significar el paso en el que se cargan los mAbs (o capturados) en los sensores AHC. Introduzca los nombres y las concentraciones de mAb en la tabla en el lado derecho.
      4. Clic derecho en los pocillos que contienen el PCSK9 humano y seleccionar "muestra" para indicar el paso en el que se sumergen los sensores capturados-mAb y se miden las interacciones de unión. Introduzca las concentraciones molares correspondientes en la tabla en el lado derecho.
      5. Definir los pocillos que contienen 1x KB como "tampón" o "neutralización", y los pocillos que contienen glicina como "regeneración".
   3. En "definición de ensayo", siga los siguientes pasos para definir la configuración experimental:
      1. Haga clic en "Añadir" y seleccione "Regeneración" "Equilibrado" "Carga" "línea de base",,,, "Asociación", y "pasos" de disociación a la lista con tiempos de "30" s, "30" s "18" s "200" s, "500" s, y "1800" s, respectivamente. La velocidad de batido es "" RPM 1000.
      2. Para agregar los pasos para "Lista de ensayo Pasos", primero haga clic en un paso, a continuación, haga clic en los pozos ubicados en cualquiera de la muestra o la placa de reactivos. Los pasos son los siguientes:
         1. La equilibración-Regeneración: condición previa los sensores AHC por tres ciclos de "15" -s caídas en glicina (pH 1,5), alternando con "15" -s dips en 1X KB.
         2. Carga: capturar las muestras de mAb sobre los sensores de AHC para "200" s.
         3. Línea de base: establecer la señal de BLI de "60" s antes del paso de la asociación.
         4. Asociación: DIP los sensores en los pocillos que contienen concentraciones variables de PCSK9 humano durante un período de asociación "500" -s.
         5. Disociación: sumergir los sensores PCSK9-atado en nuevos pozos de 1x KB para un período de disociación -s "1800".
         6. Regeneración: sumergir el MAB-PCSK9 Bound sensores en los pocillos de glicina (pH 1.5) con dos "18" -s impulsos entre cada ciclo de unión.
   4. En experimentos "Opinión", deslizarse a través de los pasos y hacer los cambios necesarios, volviendo a las pestañas anteriores.
   5. En "Experimentos RUN", introducir un tiempo de "60" s de retardo y agitar la placa de muestra mientras espera. Establecer la temperatura de la placa a "25" ° C y pulse "IR".
3. Análisis de los datos utilizando software de análisis de datos de ForteBio
   1. Haga clic en "Selección de datos | datos cargados | | Cinética anticuerpos PCSK9 unión a PCSK9 23/07/14"
   2. En "Processing", procesar los datos como sigue:
      1. En el Paso 1: haga clic en "Selección del sensor" para poner de relieve los sensores en H1-H6, haga clic derecho sobre ellos y haga clic en "Cambiar tipo de sensor | referencia del sensor."
      2. En el paso 2, marque "sustracción" y seleccione "Sensores Promedio de referencia"; para restar cada sensor muestra activa de la media de los 6 sensores blanco de tampón.
      3. En el Paso 3, haga clic en "Align Eje Y" y seleccionar "de referencia" para alinear todas las curvas de unión a la fase de línea de base antes de la asociación.
      4. En el paso 5, marque "Savitsky-Golay Filtering" para suavizar las curvas de unión mediante el aumento de la relación señal-ruido, y haga clic en "Proceso de Datos".
      5. En el Paso 6, haga clic en "resultados procesados" para ver las curvas de unión procesados.
      6. En el paso 7, revise los cuatro paneles de la derecha muestra las curvas de unión después de cada paso del proceso, y haga clic en "Guardar los datos procesados".
   3. En "Análisis", marque "asociación y disociación" y elija: modelo "1 1".
   4. Resaltar las curvas de unión para "Global (completo)" en forma y agruparlos por "color". Use "R _max ligado" para llevar a cabo el grupo de montaje en los sensores revestidos con el mismo mConcentración Ab para obtener los valores R _max experimentales para el cálculo de la actividad superficial de ligando, y "R _max desvinculado por el sensor" para realizar ajuste global sobre sensores recubiertos con múltiples concentraciones de mAb.
   5. Haga clic en "ajuste de curvas" para obtener los parámetros cinéticos de armarios. Guardar los resultados al final de cada análisis apropiado.

5. Las mediciones cinéticas en el IBIS MX96

1. Instrumento y Preparación de los reactivos
   1. Equilibrar un chip COOH-G a temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Preparar una botella de 1 L de tampón de fórmula de sistema (PBS [pH 7,4], 0,01% de Tween-20) (acetato de sodio 10 mM [pH 5,0], 0,01% de Tween-20) y el tampón de inmovilización.
   3. Prepare cada mAb a partir de 20 mg / ml a 0,16 g / ml mediante diluciones en serie de 2 veces en tanto la memoria intermedia de sistema que ejecuta y el acetato de sodio (pH 5,0) tampón de inmovilización.
   4. Dispensar las muestras de mAb en dos septiembrearate placas de 96 pocillos en la que cada mAb ocupa 8 pozos verticales en las concentraciones de titulación en 200 l por pocillo.
   5. alícuotas Descongelar de EDC 400 mM y 100 mM sulfo-NHS a temperatura ambiente.
   6. Preparar 300 l de proteína A / G en 50 mg / ml en el acetato de sodio (pH 5,0) tampón de inmovilización y la pipeta en un vial.
   7. Preparar 200 l de PCSK9 humano de 100 nM a 0,39 nM mediante diluciones en serie de 2 veces en el sistema tampón de ejecución. Pipeta de ellos en viales separados.
2. La cinética de ciclo Multi con arrays de anticuerpos de amina acoplados
   1. Mezclar el alícuotas EDC / sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) y dispensar la mezcla en la parte superior 48 pocillos de una nueva placa de 96 pocillos en 200! L por pocillo.
   2. Colocar la placa mAb fuente (diluido en acetato de sodio [pH 5,0]) en la posición 2 y la placa de reactivo EDC / sulfo-NHS en la posición 1 en el interior de la impresora.
   3. Instalar el chip sensor en el CFM. Abra la "CFM 2.0" software, a continuación, haga clic en "Configuración de carga | 96 Amina parejas". La matriz de 10 x 8 anticuerpo se crea de la siguiente forma:
      1. Entregar la EDC / sulfo-NHS en la mitad superior de la placa de reactivo al sensor mediante 48 microcanales, y ellos ciclo sobre la superficie del sensor para "5" min.
      2. Entregar las muestras de mAb en la mitad superior de la placa de fuente al sensor y el ciclo de ellos a través de las superficies activadas por "10" min.
      3. Entregar el tampón de inmovilización de un tubo cónico de 50 ml sobre la superficie anticuerpo para "5" min.
      4. Repita los procedimientos anteriores para las muestras de mAb que quedan en la mitad inferior de la placa de fuente.
   4. Acople el chip sensor impreso en el instrumento. En el software de control, haga clic en "Archivo | Conectar | Medición abierto | Medición existente" y seleccione "08/15/2014".
   5. En "General", seleccione "G - Sistema primer" bajo "script del sistema completo". A continuación, seleccione "G - QuEnch" para desactivar las superficies de mAb mediante la inyección de 150 l 1 M etanolamina.
   6. Haga clic en "Cámara" para visualizar las matrices MAB y ajustar el contraste si es necesario. Coloque las cajas cuadradas de color rojo para rodear los puntos de mAb, y mover las cajas cuadradas de color verde para los interspots situados entre los puntos de mAb activos para hacer referencia.
   7. En "Análisis del ciclo", seleccione "A - AP estándar Ejecutar" en "Scripts" IBIS. Conjunto 1,0 min para la línea de base, 10,0 min para la asociación, y 90 pasos para la disociación a la velocidad de 8 l / s.
   8. Dentro de los "ciclos", inyectar PCSK9 humano una concentración en un momento después de cinco inyecciones de tampón. Regenerar las superficies de mAb con glicina pH 2,0 entre cada ciclo de unión.
3. La cinética de ciclo único con arrays de anticuerpos Fc-capturado
   1. Instalar un nuevo chip sensor en el CFM. Repetir los pasos 5.2.3 a 5.2.5 mediante la sustitución de las muestras de mAb con proteína A / G.
   2. Eliminar elchip sensor de la MX96 e insertarla de nuevo en la impresora CFM.
   3. Entregar los mAb en la mitad superior de la placa a la / G superficie del sensor proteína A usando 48 microcanales, y los de ciclo a través de la superficie usando flujo bidireccional para 10 min.
   4. Repita el paso anterior para las muestras de mAb que quedan en la mitad inferior de la placa.
   5. Acople el chip sensor impreso en el instrumento MX96. En el software de adquisición de datos, haga clic en "Archivo | Conectar | Medición abierto | medición existentes | Siguiente" y seleccione "proteína A + G kinetic7.30.14 vinculante".
   6. Haga clic en "cámara" para visualizar las matrices MAB y ajustar el contraste si es necesario. Coloque las cajas cuadradas de color rojo para rodear los puntos de mAb, y mover las cajas cuadradas de color verde para los interspots situados entre los puntos de mAb activos para hacer referencia.
   7. En "Análisis del ciclo", seleccione "A - AP estándar Ejecutar" en "Scripts" IBIS. Ajuste "1,0 min" para la línea de base, "10.0min" para la asociación, y '' pasos para la disociación en '10 velocidad de 8 l / seg'.
   8. Dentro de los "ciclos", inyectar PCSK9 humano una concentración en un momento después de cinco inyecciones de tampón. No regeneración se lleva a cabo entre cada inyección analito.
4. Análisis de datos con Sprint y lavador de gases
   1. En el SprintX descargas, haga clic en "Archivo | Abrir Triángulo Archivo", seleccione todas las inyecciones de muestra en la lista, y marca "Guardar archivo SprintX", "calibración" y "determinación RLL" antes de hacer clic en "Analizar".
      NOTA: Los valores RLL se refieren a los niveles inmovilizados / capturados de mAb sobre la superficie del sensor.
   2. Marque "Hacer referencia a" y seleccione "local" para usar los puntos de referencia adyacentes. También puedes ver "Align" en la primera inyección y después haga clic en "Inicio de automatización."
   3. En la pestaña de serie, seleccione "Mostrar reglas en la barra de herramientas," ajustarlospara seleccionar una pequeña región de la línea de base inmediatamente antes de la primera inyección de la muestra, y seleccione "cero".
   4. Generar un archivo .IBMX para el análisis en el depurador mediante la opción "Exportar a iBMX archivo" y haga clic en "Inicio de automatización."
   5. Lanzar depurador y cargar el archivo .IBMX. Enter "100n" como la "de la conc" y "2" como el "Factor de dilución".
   6. datos recortar, eliminar toda la línea de base antes del comienzo de la inyección, y se alinean las curvas de unión en el inicio de asociación.
      NOTA: Para el experimento de cinética de un solo ciclo, no se alinean las curvas.
   7. Ir a la pestaña "Cinética", ajustar la regla para el tiempo final de la inyección, seleccione _"Kd" y en forma, a continuación, "arreglo k _d". Seleccione "k _a k _d" y montarlo de nuevo.
   8. Flotador la columna de la k _d y ajustarse de nuevo para perfeccionar el ajuste.
      NOTA: Para el ajuste de curvas de unión de un solo ciclo, Haga clic en "opta" y desactive "sustraer", a continuación, seleccione "independiente" y flotar la columna "Comenzar Iny" para adaptarse a los perfiles de asociación de nuevo a un origen de línea de base teórica.
   9. Revisar los parámetros cinéticos empotrados en la pestaña Resultados.

Results

La Figura 1 muestra la imagen matriz de anticuerpos de la los niveles de mAb manchado CFM y por los dos métodos de inmovilización, y la Figura 2 muestra los sensogramas de unión correspondientes generados en el MX96 desde el ciclo de múltiples cinética y mediciones cinéticas la de ciclo único en estas matrices de mAb . La unión y las curvas cinéticamente empotrados desde múltiples superficies recubiertas de anticuerpos generados en las cuatro plataformas de biosensores en tiempo real se muestra en las Figuras 3 - 6. La Figura 7 muestra la comparación de las tasas de cinética final y constantes de unión de equilibrio obtenidos del análisis global de estas curvas de unión. La asociación individual (k _a), la disociación (k _d), y el equilibrio (K _D) las constantes de unión se presentan en la Tabla 1. Para demostrar la variabilidad de los conjuntos de datos generados dentro del mismo instrumento, k _a, k _d, y K _D a diferentes densidades de superficie mAb, y la Figura 9 compara además las actividades de unión calculados de las superficies de mAb a través de las plataformas de biosensor.

Figura 1. Multiplex Ligando Arrays de amina acoplada-(A) y Fc-capturado (B) Anticuerpo Superficies de CFM de impresión en el IBIS MX96. Las imágenes de las matrices impresas se muestran en los paneles de la izquierda, donde las zonas grises cerrados por cuadrados rojos indican la presencia de anticuerpos. Los interspots más oscuros situados entre los puntos de anticuerpos activos se utilizan para la resta de referencia. Cada columna contiene un anticuerpo impreso a las concentraciones de titulación se identifican a continuación y a la izquierda de la imagen. Las cantidades de los anticuerpos impresos cuantificados mediante el cálculo de la diferenc en turnos a granel entre los lugares activos y de referencia se muestran en los paneles de la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Comparación de tiempo real Encuadernación sensogramas de Multi-ciclo (A) y un solo ciclo (B) Los experimentos cinéticos en el IBIS MX96. Las inyecciones secuenciales de PCSK9 humano a concentraciones crecientes a través de las matrices de 10 x 8 de anticuerpos se observan por encima de cada segmento sensograma correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

superiores), mediano (paneles medios), y (paneles inferiores) de bajos superficies densidad. Las líneas negras lisas superpuestas representan el ajuste cinética de las señales de respuesta de unión a diferentes concentraciones PCSK9 humanos (líneas de color) a un 1: modelo de interacción 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 cinéticos de ajuste del modelo de superposiciones en la ProteOn XPR36: Figura 4. sensogramas de los anticuerpos capturados Interactuar con PCSK9 humano y 1 Encuadernación. Las interacciones se evalúan sobre alto (paneles superiores), medium- (paneles medios), y (paneles inferiores) de bajos superficies densidad. Las líneas negras lisas superpuestas representan el ajuste cinética de las señales de respuesta de unión a diferentes concentraciones PCSK9 humanos (líneas de color) a un 1: modelo de interacción 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 cinéticos de ajuste del modelo de superposiciones en el Octeto RED384: Figura 5. sensogramas de los anticuerpos capturados Interactuar con PCSK9 humano y 1 Encuadernación. Las interacciones se evalúan sobre alto (paneles superiores), mediano (paneles medios), y (paneles inferiores) de bajos superficies densidad. Las líneas rojas superpuestas representan el ajuste cinética de las señales de respuesta de unión a diferentes concentraciones PCSK9 humano (líneas de color) a un 1: 1 modelo de interacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 cinéticos de ajuste del modelo de superposiciones en el IBIS MX96: Figura 6. sensogramas de los anticuerpos de amina acoplados a (A) y capturados-Fc (B) que interactúa con PCSK9 humano y 1 Encuadernación. Los perfiles de unión están organizados como 10 x 8 paneles que siguen el mapa de placa de matriz en la Figura 1. Las líneas negras representan las señales de respuesta de unión registrados a diferentes concentraciones PCSK9 humanos, y las líneas rojas superpuestas representan las curvas ajustadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

gura 7" src = "/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Figura 7. Comparación de la Asociación k _a (A), la disociación k _d (B), y Equilibrio K _D (C) constantes de unión generados por las plataformas Four biosensor. Los parámetros cinéticos se derivan de análisis global de las curvas de unión de las Figuras 3 - 6. Los instrumentos están representados como sigue: Biacore T100 (azul), ProteOn XPR36 (verde), el octeto RED384 (rojo), IBIS MX96, amina acoplada (púrpura), y IBIS MX96, Fc-capturados (naranja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Comparación de la consistencia de las constantes cinéticas a través de múltiples densidades de superficie anticuerpo en la Biak mineral de T100 (A), ProteOn XPR36 (B), el octeto RED384 (C), IBIS MX96, amina acoplados a (D), y IBIS MX96, Fc-capturado (E). Los parámetros cinéticos k _A (arriba sub-paneles), k _d (sub-paneles medios), y K _D (inferiores sub-paneles) se derivan de análisis de grupo a una densidad de superficie de anticuerpo individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9. actividades de unión de las superficies de anticuerpos y sus desviaciones estándar (barras de error) en las cuatro plataformas de biosensor. Los valores se calculan utilizando las ecuaciones descritas en los artículos de investigación ^17.large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	k a	k d	KD
	(M -1 s -1)	(s -1)	(Nuevo Méjico)
1 mAb	11,7 (7,8) x 10 5	4,89 (4,18) x 10 -5	0,052 (0,05)
2 mAb	1,53 (0,28) x 10 5	1,30 (1,54) x 10 -5	0,092 (0,12)
mAb 3	11,4 (8,3) x 10 5	27,6 (11,0) x 10 -5	0,333 (0,20)
4 mAb	3,61 (1,6) x 10 5	20,1 (12,3) x 10 -5	0,659 (0,54)
mAb 5	0,59 (0,21) x 10 5	3,46 (2,50) x 10 -5	0,663 (0,46)
6 mAb	1,19 (0,78) x 10 5	7,21 (3,83) x 10 -5	0,894 (0,64)
mAb 7	1,29 (0,53) x 10 5	16,4 (5,63) x 10 -5	1,57 (1,02)
mAb 8	4,02 (2,23) x 10 5	22,8 (10,7) x 10 -5	0,768 (0,68)
mAb 9	4,20 (2,13) x 10 5	6,67 (4,3) x 10 -5	0,197 (0,16)
mAb 10	1,20 (0,49) x 10 5	12,5 (7,64) x 10 -5	1,27 (0,80)

Tabla 1: Modelo de Interacción 1: Precios cinéticos y constantes de equilibrio de 10 mAb obtuvieron ajustando global de las curvas de unión de cuatro instrumentos biosensores para el 1 de unión.

Discussion

Nuestro estudio comparación cabeza a cabeza muestra que cada plataforma biosensor tiene sus propias fortalezas y debilidades. A pesar de que los perfiles de unión de los anticuerpos son similares por comparación visual (Figuras 3 - 6), y el orden de rango de las constantes de velocidad cinética adquirida son altamente consistentes a través de los instrumentos (Figura 7), nuestros resultados muestran que los instrumentos SPR-basa con fluidos de flujo continuo) son mejores en la resolución de interacciones de alta afinidad con velocidades de disociación lentas. Deriva hacia arriba durante la fase de disociación se observa en conjuntos de datos (por ejemplo, mAb 2, mAb 5, y mAb 9; Figura 5) generado por el BLI instrumento-fluídica libres. Este hallazgo puede atribuirse en gran parte a la evaporación de la muestra con el tiempo en la microplaca, lo que es una limitación principal del sistema. Con esta limitación inherente, el tiempo experimental también se limita a menos de 12 h; por lo tanto, los experimentos se programan con shveces Örter (Asociación 500 s y 30 min de disociación) en comparación con los de las otras plataformas (asociación 10 min y 45 min de disociación). Sin embargo, la reducción del tiempo experimental no parece mitigar el impacto de la evaporación en la calidad de datos / consistencia, ya que las constantes de velocidad generados por el instrumento basado en el BLI muestran menos linealidad como resultado de las fluctuaciones en algunas de las velocidades de disociación (Figura 8C ). Además de la evaporación de la muestra, las diferencias en los reactivos de captura utilizados pueden también han contribuido a las diferencias en los resultados obtenidos. Mientras que la proteína A / G se usó en las tres plataformas de SPR basados ​​en fluídicos, los sensores AHC se utilizaron en la plataforma BLI no-fluídica. Dado que la proteína A / G es probable que tenga una afinidad más débil para los mAbs que lo hace el AHC, una superficie biosensor basado en anticuerpos, las velocidades de disociación del complejo mAb-antígeno de la / las superficies de proteína A G puede aparecer artificialmente más rápido que aquellos obtenido a partir de la superficie AHC. Esta posibilidad es apoyada by los datos experimentales que muestran que los valores fuera de la tasa generados por la plataforma BLI fueron consistentemente inferiores a los obtenidos a partir de los otros instrumentos (Figura 7, línea roja). Sin embargo, la plataforma BLI tiene diferentes ventajas sobre las otras plataformas. Por ejemplo, es muy flexible con respecto a la elección del sensor y configuración de ensayo debido a los diversos sensores de pre-revestido para su uso inmediato. En nuestros experimentos, el uso de los sensores de AHC eliminó la necesidad de pasos ligando de inmovilización, reduciendo el tiempo de preparación. Además, la plataforma de BLI requiere mucho menos mantenimiento en comparación con las otras plataformas de fluidos SPR, que cuentan con configuraciones de tubos y conmutador de valor complicados. Esta característica es una ventaja para los experimentos que implicaban muestras crudas que pueden causar problemas de obstrucción y de contaminación.

Como la demanda de la identificación eficiente, rápida y precisa de candidatos terapéuticos aumenta, la necesidad de birendimiento osensor también está aumentando. Entre las cuatro plataformas de biosensores, el rendimiento del biosensor capaz de 96-ligando de impresión de matriz es el más alto, seguido por el biosensor acoplada a un entrecruzándose formato de 36-ligando y el biosensor basado en BLI con lectura simultánea de 16 canales, que en última instancia aumentar el número de interacciones medidos en un único ciclo de unión a 96, 36 y 16, respectivamente. Estas capacidades de rendimiento son significativamente más altas que la de la plataforma de SPR tradicional, que está limitado por tener sólo cuatro células de flujo conectados por un único flujo en serie. Desde nuestros experimentos incluyeron un conjunto relativamente pequeño de la muestra de 10 mAb evaluados en varias densidades de superficie con tiempos largos de disociación, los rendimientos instrumentales jugaron un papel moderado en la determinación de la eficiencia de los experimentos. No hubo diferencias significativas en los tiempos experimentales de las tres plataformas de alto rendimiento, y en todos los casos se realizaron los experimentos en un día. Por otra parte, los experimentos tradicionales SPR de flujo en serie requieren 3 días para completar, a pesar de la automatización del walk-away de adquisición de datos después de la instalación. En otros estudios que implican un gran número de muestras (es decir, en los cientos o miles), para los propósitos de clasificación de disociación / detección cinética o de agrupación de epítopos, el rendimiento se convierte en un factor crítico.

Aunque el rendimiento en el IBIS MX96 es órdenes de magnitud más alta que la de los otros biosensores y por lo tanto es una elección óptima para estos propósitos, tiene una serie de deficiencias. En particular, la matriz de impresión por el CFM muestra grandes inconsistencias de superficie (Figura 1) y la reducción de reproducibilidad de datos (Figura 8D y 8E). Para mediciones cinéticas exactas, la cantidad de ligando en la superficie biosensor es un parámetro crítico que debe ser controlado para asegurar que las respuestas de unión no se vean perturbadas por factores secundarios, tales comola transferencia de masa o impedimento estérico. Para el Biacore T100 y ProteOn XPR36, los niveles óptimos R _L se determinaron sobre la base del cálculo estándar de los valores _max conjunto R como se describe en el artículo de investigación ^17. Por otro lado, para las plataformas Octeto RED384 y IBIS MX96, los niveles de mAb de captura se alcanzaron empíricamente usando una serie de anticuerpos de 2 veces diluidas en serie a veces constantes. La falta de conocimiento o el control de la etapa de captura resultó en una superficie de alta densidad y las señales de alta unión de respuesta (Figura 2) que puede haber comprometido la exactitud de las constantes cinéticas de velocidad. Además, la separación de la impresora desde el detector SPR también presenta un desafío cuando se realizan varias mediciones de ciclo de unión que implican regeneraciones. La única manera de realizar la configuración de la cinética de multi-ciclo fue a través de acoplamiento de aminas directa de los mAbs, en contraposición a capturar a través del mAb Fc por la proteína inmovilizada A / Gsuperficie en las otras tres plataformas biosensor. Como resultado, se requiere un experimento regeneración de exploración adicional para determinar las condiciones óptimas de regeneración. El resultado de esta configuración se relacionó con un 90% menor actividad superficial observada ~ en comparación con el método de captura de Fc (Figura 9), además de un tiempo de experimentación más tiempo. Para ejecutar el método de captura de Fc, se adoptó un enfoque cinética de un solo ciclo alternativo. Este enfoque implica la inyección secuencial de analito a concentraciones crecientes sin regeneración entre cada inyección (Figura 2). Este enfoque altamente conveniente, pero menos comúnmente aplicado no sólo acorta el tiempo experimental y redujo el consumo de reactivos, sino que también produjo constantes cinéticas muy similares a las de los otros biosensores (Figura 7). Por lo tanto, la aplicación de este enfoque cinética de ciclo único supera la limitación de configuración inherente del instrumento y presenta unaoportunidad para la obtención de alta resolución constantes de velocidad cinética en una forma de alto rendimiento.

A pesar del rendimiento de ser una limitación importante en el Biacore T100, nuestros resultados muestran colectivamente que generó los datos más consistentes con la más alta calidad. Esto fue seguido por la ProteOn XPR36, que tiene ~ 10 veces mayor rendimiento. Su capacidad para generar datos de alta calidad se convierte en una ventaja cuando la caracterización de las interacciones anticuerpo-antígeno de alta afinidad que pueden ser técnicamente difícil cuando se alcanzan los límites de detección de los instrumentos. Si bien las limitaciones sistemáticas en la instrumentación del octeto RED384 obstaculizan la medición precisa de las constantes de velocidad de disociación (es decir, por debajo de la sensibilidad para resolver suficiente degradación de señal para lenta fuera de tarifas), tanto el Biacore T100 y ProteOn XPR36 puede proporcionar sensible y fiable detección para la diferenciación.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema Biacore T100	GE Healthcare	28975001	El sistema T100 se ha actualizado a T200
CM5 Sensor Chip	GE Healthcare	BR100012
BIAevaluación	GE Healthcare		versión 4.1
Software de control Biacore T100	GE Healthcare		El software de control T100 se ha actualizado a T200
Kit de acoplamiento de amina	GE Healthcare	BR100050	Contiene: 750 mg de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 115 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS), 10,5 mL 1,0 M etanolamina-HCl pH 8,5
Búfer HBS-EP+ 10 veces;	GE Healthcare	BR100669	Solución madre concentrada
Viales de plástico, diámetro exterior 7 mm	GE Healthcare	BR100212
Tapones de goma, tipo 3	GE Healthcare	BR100502
Viales y tapones de plástico, diámetro exterior 11 mm	GE Healthcare	BR100214
Sistema de matriz de interacción de proteínas ProteOn XPR36	Bio-Rad	1760100
Software ProteOn Manager	Bio-Rad	1760200	Versión 3.1.0.6
GLM Chip de sensor	Bio-Rad	1765012
Kit de acoplamiento de aminas	Bio-Rad 1762410		Incluye EDAC (EDC), sulfo-NHS, etanolamina HCl
Kit de Regeneración y Acondicionamiento y Tampones	Bio-Rad	1762210	Incluye 1 tampón de glicina (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), y NaOH, SDS, HCl, ácido fosfórico, NaCl; 50 mL cada solución
Tampón PBS/Tween/EDTA de 2 L	Bio-Rad	1762730	Incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA
Octeto RED384 Sistema	Forté
Software de análisis de datos	Forté		versión 9.0.0.4
Inmersión y lectura Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensores	Forté Bio	18-5060	Una bandeja de 96 biosensores
Placa inferior inclinada de 384 pocillos	Forté Bio	18-5080
Dispensador Biosensor Fort	é Bio	18-5016
Tampón Kinetics 10x	Forté Bio	18-1092	10x concentración. Contiene ProClin 300.
Sistema IBIS MX96 SPRi	Wasatch Microfluidics
Microfluídica Microfluídica Impresora de Microspotter de Flujo Continuo (CFM)	Wasatch Microfluidics		Versión 2.0
Chip SensEye COOH-G	Wasatch Microfluidics		1-09-04-004
Software de análisis de datos	Wasatch Microfluidics		versión 6.19.3.17
Software	de análisis de datos SPRintWasatch Microfluidics		versión 6.15.2.1
Depurador 2	Software		versión 2
Proteína recombinante Pierce A/G	ThermoFisher Scientific	21186