Este protocolo describe un método para medir sensitivamente la tasa de transporte nucleocitoplasmático dentro de las neuronas motoras NSC-34 células mediante la cuantificación del cambio en tiempo real en la importación nuclear de una proteína NLS-NES-GFP.
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Artículo de método
Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras
En este artículo
Resumen
Resumen
El transporte nucleocitoplasmático se refiere a la importación y exportación de grandes moléculas del núcleo celular. Recientemente, varios estudios han demostrado una conexión entre la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las alteraciones en la vía nucleocitoplasmática. ALS es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las neuronas motoras y resulta en parálisis y en última instancia en la muerte, en 2-5 años en promedio. La mayoría de los casos de ELA son esporádicos, carecen de cualquier vínculo genético aparente, pero el 10% se hereda de manera dominante. Recientemente, se identificaron las expansiones de repetición de hexanucleótidos (HREs) en el gen del gen 72 de lectura abierta del cromosoma 9 (C9orf72) como una causa genética de ALS y demencia frontotemporal (FTD). Es importante destacar que diferentes grupos han propuesto recientemente que estos mutantes afectan el transporte nucleocitoplasmático. Estos estudios han demostrado principalmente el resultado final y las manifestaciones causadas por HREs en el transporte nucleocytoplasmic, pero no demuestran disfunción de transporte nuclear entiempo real. Como resultado, sólo se puede determinar una deficiencia severa de transporte nucleocitoplasmático, principalmente debido a una alta sobreexpresión o inserción de proteínas exógenas.
Este protocolo describe un nuevo y muy sensible ensayo para evaluar y cuantificar la disfunción nucleocitoplasmática de transporte en tiempo real. La tasa de importación de una proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) se puede cuantificar en tiempo real usando microscopía fluorescente. Esto se realiza usando un inhibidor de la exportación, permitiendo así que la GFP de la lanzadera sólo entre en el núcleo. Para validar el ensayo, se usaron las repeticiones de dipéptido traducido HRE de C9orf72, poli (GR) y poli (PR), que se han mostrado anteriormente para interrumpir el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando el ensayo descrito, se observó una disminución del 50% en la tasa de importación nuclear en comparación con el control. Usando este sistema, se pueden examinar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático y la capacidad de diferentes factores para rescatar (incluso parcialmente)Se puede determinar el defecto de soporte.
Introducción
El complejo de poros nucleares (NPC) controla la importación y exportación de moléculas grandes dentro y fuera del núcleo celular. En contraste con las moléculas pequeñas, que pueden entrar en el núcleo sin la regulación 1 , el transporte de moléculas más grandes es fuertemente controlado por el NPC. Estas moléculas grandes, como las proteínas y el ARN, se asocian con factores de transporte, incluyendo importaciones y exportaciones, para ser importados y exportados desde el núcleo 2 . Para ser importados, las proteínas deben contener un pequeño motivo peptídico, generalmente llamado una....
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Protocolo
1. Preparación de la Línea Celular
- Descongele aproximadamente 1.000.000 de células de médula espinal de neuroblastoma de ratón (células NSC-34) que se almacenaron en un recipiente de nitrógeno líquido. Utilice una incubadora de agua a 37 ° C hasta que las células estén completamente descongeladas.
- Se añade medio fresco y caliente (medio DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de L-glutamina y 1% de antibióticos pen-strep).
- Centrifugar las células descongeladas (SL16R) a 500 xg durante 5 min, formando un sedimento celular. Deseche el medio y agregue 1 ml de nuevo medio para la resuspensión celular.
- Coloque las cél....
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Resultados
Usando el procedimiento presentado aquí, las neuronas motrices-NSC-34 células fueron transfectadas con un NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) de proteínas. Esta proteína, que tiene secuencias de señales NLS y NES ( Figura 1 ), puede transferirse entre el núcleo y el citoplasma. GFP genérico puede entrar o salir del núcleo en la ausencia de cualquier etiqueta de señal de localización sólo por difusión y por lo tanto, distribuido uniformemente entre el núcleo y el citoplasma (
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Discusión
Este protocolo demuestra un nuevo ensayo altamente sensible y cuantitativo para evaluar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando este sistema, es posible observar y medir el transporte nucleocitoplasmático y su disfunción en tiempo real, no sólo grandes defectos que resultan en cambios dramáticos en la distribución de proteínas. Este ensayo no sólo tiene una ventaja de sensibilidad, sino que también requiere poca preparación, es barato y es un ensayo muy fácil y de bajo compromiso.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio de AI por sus útiles comentarios y sugerencias. Nos gustaría agradecer al Prof. Mark Hipp (Instituto Max Planck de Bioquímica) por brindarnos el vector shuttle-GFP. Este trabajo fue apoyado por las concesiones de la fundación israelí de la ciencia (ISF # 124/14), de la fundación binacional de la ciencia (BSF # 2013325), de la concesión de la integración de carrera de Marie Curie FP7 (CIG # 333794), y del instituto nacional para Psychobiology en Israel NIPI # b133 - 14/15).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Motor de ratón Línea celular híbrida similar a una neurona (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g / L L-glucosa | Industrias Biológicas 01-055-1A | ||
| FBS Industrias Biológicas de Grado Europeo | 04-007-1A | ||
| SL 16R Centrífuga | Termo Científica | 75004030 | |
| Termo Forma Serie II Camisa de CO2 Incubadora | Thermo Scientific | 3111 | |
| Cubreobjetos de 12 mm de diámetro, 0,13-0,17 mm de espesor | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect Reactivo de transfección | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 microscopio invertido | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomicina B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Homogeneizador motor/control/mandril/abrazadera de 90 grados | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R Centrífuga, refrigerada | Thermo Scientific | 75002455 |
Referencias
- Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E.
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Reimpresiones y permisos
