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Artículo de método

Conexiones de Fibra del Área de Motor Suplementario Revisited: Metodología de la Dissección de Fibra, DTI, y Documentación Tridimensional

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DOI:

10.3791/55681

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23 de mayo de 2017

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1Department of Neurosurgery, University of Minnesota, 2Department of Neurosurgery, Barrow Neurological Institute, St. Josephs Hospital and Medical Center, 3Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Radiology, University of Minnesota, 5Department of Neurosurgery, Tepecik Training and Research Hospital, 6Department of Neurosurgery, Cerrahpasa Medical School, University of Istanbul

En este artículo

Resumen

El propósito de este estudio es mostrar cada paso de la técnica de disección de fibra sobre el cerebro de cadáver humano, la documentación en 3D de estas disecciones y la imagen de tensor de difusión de las vías de fibras anatómicamente disecadas.

Resumen

El objetivo de este estudio es mostrar la metodología para el examen de las conexiones de materia blanca del complejo de área motora suplementaria (SMA y SMA) utilizando una combinación de técnicas de disección de fibra sobre especímenes de cadáveres y resonancia magnética (MR ) Tractografía. El protocolo también describirá el procedimiento para una disección de la sustancia blanca de un cerebro humano, una tractografía de tensor de difusión y una documentación tridimensional. Las disecciones de fibra en el cerebro humano y la documentación en 3D se realizaron en la Universidad de Minnesota, Microcirugía y Neuroanatomía del Departamento de Neurocirugía. Se prepararon cinco especímenes de cerebro humano postmortem y dos cabezas enteras de acuerdo con el método de Klingler. Los hemisferios cerebrales fueron disecados paso a paso de lateral a medial y medial a lateral bajo un microscopio de funcionamiento, y las imágenes 3D fueron capturadas en cada etapa. Todos los resultados de la disección fueron apoyados por tensor de difusiónImágenes Las investigaciones sobre las conexiones en línea con la clasificación de las fibras de Meynert, incluidas las fibras de asociación (fascículo corto superior, fascículo superior superior I y tracto frontal aslante), fibras de proyección (corticospinal, claustrocortical, cingulum y tracto frontostriatal) y fibras comisurales También realizado.

Introducción

Entre las 14 áreas frontales delimitadas por Brodmann, el área premotora y prefrontal que se encuentra frente a la corteza motora precentral ha sido considerada como un módulo silencioso, a pesar de que el lóbulo frontal desempeña un papel importante en la cognición, el comportamiento, el aprendizaje, Y procesamiento del habla. Además del complejo de área motora suplementaria (SMA), que consiste en el pre-SMA y el SMA propiamente dicho (área de Brodmann, BA 6) que se extiende medialmente, el módulo pre-motor / frontal incluye el prefrontal dorsolateral (BA 46,8, Y 9), frontopolar (BA 10), ventrolateral prefrontal (BA 47), así como parte de la corteza orbitofrontal (BA 11) en la superficie lateral del cerebro 1 , 2 .

El complejo SMA es un área anatómica significativa que se define por sus funciones y sus conexiones. La resección y el daño de esta región causa deficiencias clínicas significativas conocidas como SMAsíndrome. El síndrome de SMA es una condición clínica importante que se observa particularmente en los casos de glioma frontal que contienen el complejo SMA 3 . El complejo SMA tiene conexiones con el sistema límbico, los ganglios basales, cerebelo, tálamo, SMA contralateral, lóbulo parietal superior y porciones de los lóbulos frontales a través de los tractos de fibra. El efecto clínico del daño a estas conexiones de la sustancia blanca puede ser más severo que a la corteza. Esto se debe a que las consecuencias de la lesión de la corteza se pueden mejorar con el tiempo debido a la alta plasticidad cortical 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ,. Por lo tanto, la anatomía regional SMA y las vías de la materia blanca debe ser deeplY entendido, en particular para la cirugía de glioma.

Una comprensión integral de la anatomía de las vías de la materia blanca es importante para el tratamiento de amplio espectro de lesiones neuroquirúrgicas. Recientes estudios de la documentación tridimensional de los resultados anatómicos que se obtuvieron en microcirugía se utilizaron para obtener una mejor comprensión de la anatomía topográfica y la interrelación de las vías de la sustancia blanca del cerebro [ 13 , 14] . Por lo tanto, el propósito de este estudio fue examinar las conexiones de la sustancia blanca del complejo SMA (pre-SMA y SMA propiamente dicho) utilizando una combinación de técnicas de disección de fibra sobre especímenes de cadáveres y tractografía por resonancia magnética (MRI) y explicar todos los métodos Y los principios de ambas técnicas y su documentación detallada.

Planificación y Estrategia de Estudio

Antes de realizar los experimentos, un litroLos procedimientos que deben aplicarse a los especímenes antes y durante las disecciones, y todas las conexiones entre las regiones SMA que se han revelado con disección y DTI. Se revisaron los estudios previos sobre localización y separación anatómica de las regiones pre-SMA y SMA-propias y sobre la anatomía topográfica de sus conexiones.

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Protocolo

Los difuntos se incluyen aquí como una población, aunque las personas fallecidas no son técnicamente sujetos humanos; Los sujetos humanos son definidos por 45 CF 46 como "seres humanos vivos 15 , 16 ".

1. Preparación de muestras

  1. Examinar 5 cerebros fijos en formalina (10 hemisferios) y 2 cabezas humanas enteras.
  2. Fijar los especímenes en una solución de formalina al 10% durante al menos 2 meses según el método de Klingler 17 .
  3. Congele todas las muestras a -16 ˚C durante 2 semanas de acuerdo con el método de Klinger 17 .
  4. Descongele los especímenes bajo el agua del grifo.
  5. Realizar una craneotomía frontotemporal extendida en la cabeza cadavérica para exponer el cerebro.
    1. Coloque la cabeza del cadáver en una abrazadera del cráneo del tres-perno ( tabla del material ).
    2. Haga una incisión frontotemporal con un bisturí.
    3. Retire la piel y los músculos con un escalpelo, fórceps y tijeras.
    4. Hacer uno o más orificios de perforación en el cráneo hasta que se alcance la duramadre; Utilice un taladro con un reductor de velocidad compacto y un accesorio de perforador craneal de 14 mm a 79.000 rpm ( tabla de materiales).
    5. Corte la tapa del hueso y abra el cráneo con un router acanalado de 2 mm x 15,6 mm con un accesorio de rebabas de 2,1 mm en forma de clavija a una velocidad de perforación de 80.000 rpm ( tabla de materiales).
  6. Retire la duramadre, la aracnoides y la pia-madre y disecar usando un microdisector bajo un microscopio a una ampliación de 6X a 40X 5 , 18 ( tabla de materiales).

2. Técnica de la disección de la fibra

NOTA: Realice todas las disecciones bajo una ampliación de 6X a 40X en un microscopio quirúrgico.

  1. Realizar las disecciones de fibra de una manera escalonada en cada hemisfemaRe, de lateral a medial y medial a lateral.
    1. Decorar la corteza cerebral utilizando un disector de panfield ( Tabla de Materiales) y eliminar todos los tejidos corticales frontales para exponer los tramos de fibras de asociación cortos, que son fibras U o fibras intergriales que interconectan los giros vecinos 5 , 13 .
    2. Retire las fibras de asociación cortas con un disector de panfield y un micro gancho quirúrgico recortando suavemente bajo el microscopio ( Tabla de Materiales) para alcanzar y exponer las fibras de asociación largas que interconectan áreas distantes en el mismo hemisferio.
    3. Ir profundamente en las fibras largas de la asociación para quitar las fibras superficiales de la asociación usando un micro gancho quirúrgico y un disector del panfield; Retire cada haz de fibras bajo un microscopio ( tabla de materiales) para exponer las fibras comisurales de la proyección.
    4. Ver cada una de las conexiones del complejo SMASegún la anatomía topográfica previamente definida en la literatura 2 , 8 , 18 , 19 , 20 , 21 .
  2. Mantenga todos los especímenes (cabezas enteras y cerebros) que se utilizaron durante las disecciones en una solución de formaldehído al 10% ( tabla de materiales) entre los períodos de disección.

3. Técnica de fotografía 3D

  1. Utilice una plataforma de color negro durante la fotografía de los especímenes.
  2. Sigue una técnica de fotografía 3D 22 .
    1. Coloque cada espécimen en una plataforma de color negro diseñada.
    2. Seleccione una escena con una vista frontal completa de la muestra y realice una toma enfocando la cámara en cualquier punto de la muestra cerca del punto central de la pantalla de la cámara (pestaña del instrumentoLe). Utilice un objetivo SLR de 18 a 55 mm f / 3.5-5.6 o una lente macro de 100 mm f / 2.8L y ajuste la abertura a F29, ISO 100.
    3. Gire la cámara ligeramente hacia la izquierda hasta que el punto más a la derecha en la pantalla de la cámara sea el mismo que el punto de enfoque anterior. Deslice la cámara hacia la derecha hasta que el punto medio de la pantalla se superponga al punto de enfoque original de la muestra. Enfoque la cámara en este punto y tome otra foto.
    4. Mantenga la distancia y el eje de la cámara a la muestra fotografiada a valores constantes.
  3. Cree una imagen 3D utilizando un programa de generador de imágenes en 3D (tabla de materiales).
    1. Abra el programa de software 3D.
    2. Elija "Abrir imágenes estéreo de archivo".
    3. Seleccione las dos imágenes (izquierda y derecha) y asegúrese de que la imagen izquierda esté en la ranura izquierda y la imagen derecha esté en la ranura derecha.
    4. Seleccione la opción "Half color anaglyph RL / 2" y genere el anaglifo en formato jpeg.

4. Técnica DTI

  1. Adquirir datos de difusión pre-procesados ​​utilizando los datos de difusión del Proyecto Connectome Humano 23 descargándolos del sitio web referenciado.
    Se obtuvieron los datos de difusión en voluntarios normales utilizando un dispositivo modificado de resonancia magnética 3 T (tabla de instrumentos) que utilizaba una secuencia de imágenes planas de eco eco-eco (EPI) Aceleración de imagen de banda 24 , 25 , 26 , 27 , 28 . Los parámetros de secuencia relevantes incluyen: TR = 5,520 ms; TE = 89,5 ms; FOV = 210 x 180 mm; Matriz = 168 x 144; Grosor de rebanada = 1,25 mm (tamaño de vóxel 1,25 x 1,25 x 1,25 mm); Factor multibanda = 3; Y valores de b = 1.000 s / mm2 (95 direcciones), 2.000 s / mm2 (96 direcciones) y 3.000 s / mm2 (97 direcciones). Los datos se procesaron utilizando FreeSurfer 29 y FSL 30 ; El proceso incluyó corrección de corrientes parásitas, corrección de movimiento, normalización de intensidad b0, corrección de distorsión de susceptibilidad y corrección de gradiente-no linealidad 28 , 31 , 32 , 33 . Las imágenes MP-RAGE T1 también se incluyen en el paquete de descarga. Los procedimientos se documentan en el manual de procedimientos del Proyecto Connectome Humano 23 .
  2. Post-procesar los datos de difusión utilizando Diffusion Spectrum Imaging (DSI) Studio 34 para generar una función estimada de distribución de orientación por difusión en voxel (ODF) empleando un algoritmo de generalización de imágenes de muestreo q (GQI) 35 .
    1. Cargue el dataset descargado en el software por selEctando "STEP1: Open source images" y seleccionando el archivo data.nii.gz.
    2. Seleccione el botón "STEP2: Reconstruction". Después de verificar la máscara cerebral, proceda con el "Paso 2" y seleccione "GQI" como método de reconstrucción. Seleccione "ponderación r ^ 2" con una "relación de longitud" de "1.0". Deje las selecciones restantes como predeterminadas.
    3. Seleccione "Ejecutar reconstrucción".
  3. Coloque las semillas apropiadas para las regiones de interés para agilizar el seguimiento de la fibra.
    1. En la "Ventana de Región", haga clic en el botón "Atlas" para colocar las semillas para el fascículo longitudinal superior (SLF) I. Seleccione "Brodmann" y agregue "Región 6" y "Región 7." En la ventana de región, establezca el tipo "Región 6" como "semilla" y el tipo "Región 7" en "región de inclusiones" (ROI).
      1. Seleccione "Nueva región" en la ventana de región y dibuje manualmente un ROIEn el aspecto más posterior del giro frontal superior en el plano coronal. Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    2. Coloque las semillas para SLF II de manera similar usando "New Region" en la ventana de la región y dibujando la región "seed" en el aspecto posterior de la materia blanca del gyrus frontal medio en el plano coronal. Elija un ROI usando "Atlas" (como en el paso 4.3.1) y las regiones Brodmann 9, 10, 46, 39 y 19. Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    3. Coloque las semillas para SLF III con una región "semilla", usando "Atlas" (como en el paso 4.3.1) en la ventana de región y eligiendo "Región 40" del Atlas de Brodmann y el ROI de "Atlas ..." en "Región 40 "Y" Región 44 ". Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    4. Colocar las semillas para las fibras callosas usando "Nueva Región" en la ventana de la región y dibujar una "semilla" en el plano sagital que abarcaE corpus callosum. Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    5. Coloque las semillas para fibras cinguladas utilizando "Nueva Región" en la ventana de región y dibuje una región de "semilla" en el giro medio cingulado en la vista coronal. Utilice "Nueva Región" para dibujar dos ROIs, uno en el cíngulo más anterior y otro en el giro cingulado posterior bajo la vista coronal. Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    6. Coloque las semillas para las fibras claustrocortical usando la "nueva región" en la ventana de la región y dibuje una "semilla" en el claustrum con un ROI en la corona radiata usando la función del "Atlas ...". Seleccione el atlas como "JHU-WhiteMatter-labels-1mm".
      1. Seleccione y añada "Anterior_corona_radiata", "Posterior_corona_radiata" y "Superior_corona_radiata". Dibuje una región de evitación para todas las fibras que pasan a través de un plano inferior al nivel del claustrum en el plano axial usando "New Region"En la ventana de región Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    7. Coloque las semillas para el tracto corticoespinal usando una "semilla" de la función "Atlas ..." en la ventana de la región; Seleccione "JHU-WhiteMatter-labels-1mm" y agregue la región "Corticospinal_tract". Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    8. Colocar semillas para el tracto aslante frontal (FAT) utilizando una región "semilla" de la función "Atlas ..." en la ventana de región y seleccionar el ROI de Brodmann y el ROI de "Región 6" en "Región 44" y "Región 45". " Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4.
    9. Coloque las semillas para el tracto frontostriatal (FST) con una "semilla" en la "Región 6" usando la función "Atlas ...". Insertar nuevas regiones en el "caudado", "putamen" y "globus pallidus" del atlas "HarvardOxfordSub" y establecer el tipo en la ventana de la región a "fin."
      NOTA: El seguimiento de las fibras para la FST se realizará seleccionando la semilla de la Región 6 y sólo una de las semillas subcorticales por sesión de seguimiento ( es decir, la región 6 y el caudado, seguida por la región 6 y el putamen y finalmente la región 6 y el globo Pallidus).
      1. Realice el seguimiento de fibra como se describe en el paso 4.4 para cada combinación.
  4. Realice el seguimiento de fibra para cada una de las combinaciones anteriores.
    1. En la ventana "Opciones", establezca los parámetros de seguimiento como: índice de terminación de qa de 0,08, umbral angular de 75, paso de 0,675, suavizado de 0,2, longitud mínima de 20 mm y longitud máxima de 200 mm. Seleccione la orientación de la semilla como "Todos", la posición de la semilla como "Subvoxel" y aleatorice la siembra como "Activada". Utilizar la interpolación de la dirección trilineal con un algoritmo de seguimiento de Eline (Euler). Para cada combinación de regiones arriba, elija "Ejecutar seguimiento" en el & #34: Tramas de fibra ".
      NOTA: Debido a la naturaleza aleatoria del seguimiento, se identifican "fibras falsas" claras y se eliminan selectivamente, con regiones de evitación dibujadas a mano como "Nueva Región".
  5. Affine registra la exploración 3D MP-RAGE 3D, extraída por el cerebro, proporcionada en el conjunto de datos del Proyecto Connectome Humano a los datos de difusión usando la función "Slices -> Insert T1 / T2 Images" de DSI-Studio. Genere una representación superficial del cerebro seleccionando "Slices -> Add Isosurface". Utilice un "umbral" de 665.

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Resultados

El complejo SMA está situado en la parte posterior del giro frontal superior. Los bordes del complejo SMA son el surco precentral posterior, el surco frontal superior inferior-lateralmente y el sulcus cingulado inferior-medial 18 . El complejo SMA consta de dos partes: la pre-SMA anterior y la SMA propiamente posterior 18 . Existen diferencias en términos de conexiones de materia blanca y función entre estas dos partes 18<...

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Discusión

La importancia y las técnicas de estudio para los caminos de la materia blanca

La corteza cerebral se acepta como una estructura neuronal principal asociada con 2,5 millones de años de vida humana. Aproximadamente 20 mil millones de neuronas se han separado en varias partes basadas en la especificación morfológica y celular 40 . La arquitectura de cada una de estas partes corticales ha sido funcionalmente sub-agrupadas, tales como sentido sensorimotor y movimiento, exper...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia y no hay fuentes de financiamiento y apoyo, incluyendo cualquiera para equipos y medicamentos.

Agradecimientos

Los datos fueron proporcionados en parte por el Proyecto Connectome Humano, WU-Minn Consortium (Investigadores Principales: David Van Essen y Kamil Ugurbil; 1U54MH091657), financiado por los 16 Institutos NIH y Centros que apoyan el NIH Blueprint for Neuroscience Research; Y por el McDonnell Center for Systems Neuroscience en la Universidad de Washington. Las Figuras 2A y 2D fueron reproducidas con permiso de la colección Rhoton 57 (http://rhoton.ineurodb.org/?page=21899).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
%4 Solución de paraformaldehídoAFFYMETRIX, Inc.2046C208utilizado para la fijación
CongeladorINSIGNANS-CZ70WH6utilizado para congelar
Panfield DisectorAESCULAPFD305utilizado para la disección
Micro tijera quirúrgicaW. Lorenz04-4238utilizada para la microssección
Micro Gancho quirúrgicoV. MuellerNL3785-009utilizado para la miscrodissección
MICRO CAMILLA DE VASOS/ DILATORW. Lorenz04-4324utilizado para la micródissección
Emax2 SC 2000 Consola eléctricaAnspach CompaniesSC2102utilizado para la craneomía
Drill SetAnspach CompaniesNS-CZ70WH6utilizado para craneatomía
20-1000 microscopio de operaciónMoeller-Wedel,AlemaniaFS 4-20utilizado para la mistrodsección
Canon EOS 550D 18 MP CMOS APS-C Digital SLR CámaraCanon Inc.DS126271utiliza para tomar fotos
100 mm f/2.8L IS USM Lente macro CanonInc.4657A006usado para tomar fotos
MR-14EX II Macro Ring Lite (Flash)Canon Inc.9389B002usado para tomar fotos
TrípodeLino Manfrotto322RC2usado para tomar fotos
MAYFIELD Infinity Skull ClampIntegra Inc.A0077utilizado para fijar la cabeza
Escáner Skrya 3T "Connectome" modificadoSiemens Company, Inc.A911IM-MR-15773-P1-4A00utilizado para escanear DTI
XstereO PlayerYury GolubinskyVersión 3.6(22)utilizado para crear anaglifos
EF-S 18-55mm f/3.5-5.6 IS II SLR LensCanon Inc.2042B002utilizado para tomar fotos
Bisturí6B INVENT7-104-Lutilizado para hacer incisión
Reductor de velocidad compactoAnspach CompaniesCSR60utilizado para hacer orificio de rebaba
14 mm Perforador cranealAnspach CompaniesCPERF-14-11-3Futilizado para hacer orificio de rebaba
de 2 mm x 15,6 mm Enrutador estriadoAnspach CompaniesA-CRN-Mutilizado para hacer craneotomía
Fresas en forma de alfiler de 2,1 mmAnspach Companies03.000.130Sutilizadas para hacer craneotomía
EF

Referencias

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