Artículo de método

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

DOI:

10.3791/55689

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27 de junio de 2017

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1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Las interacciones ADN-proteína son esenciales para múltiples procesos biológicos. Durante la evaluación de las funciones celulares, el análisis de las interacciones ADN-proteína es indispensable para la comprensión de la regulación de genes. La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para analizar tales interacciones in vivo.

Resumen

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Los múltiples procesos celulares, incluyendo la replicación y reparación del ADN, la recombinación del ADN y la expresión génica, requieren interacciones entre las proteínas y el ADN. Por lo tanto, las interacciones ADN-proteína regulan múltiples funciones fisiológicas, fisiopatológicas y biológicas, tales como la diferenciación celular, la proliferación celular, el control del ciclo celular, la estabilidad cromosómica, la regulación genética epigenética y la transformación celular. En las células eucariotas, el ADN interactúa con las proteínas histonas y no histonas y se condensa en cromatina. Varias herramientas técnicas se pueden utilizar para analizar las interacciones ADN-proteína, tales como el Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) y DNase I footprinting. Sin embargo, estas técnicas analizan la interacción proteína-ADN in vitro , no dentro del contexto celular. La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es una técnica que captura las proteínas en sus sitios específicos de unión al ADN, permitiendo así la identificación de la interacción ADN-proteínaS dentro de su contexto de cromatina. Se realiza mediante fijación de la interacción ADN-proteína, seguido por inmunoprecipitación de la proteína de interés. Posteriormente, se caracteriza el sitio genómico al que estaba ligada la proteína. Aquí, describir y discutir ChIP y demostrar su valor analítico para la identificación de la transformación de factor de crecimiento β (TGF-β) inducida por la unión de la transcripción factor SMAD2 a SMAD Elementos de Unión (SBE) dentro de la región promotora de la tirosina- Proteína cinasa Kit (c-KIT) receptor ligando Stem Cell Factor (SCF).

Introducción

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En el núcleo de eucariotas, el ADN interactúa con las proteínas histonas y las proteínas nonhistone y se condensa en cromatina. En el contexto fisiológico, fisiopatológico y de biología celular, las funciones celulares se controlan espacial y temporalmente mediante la expresión de genes coordinados con la cromatina. Las interacciones ADN-proteína tienen un papel esencial en la regulación de los procesos celulares, como la replicación, recombinación y reparación del ADN, así como la expresión de proteínas. Por lo tanto, el análisis de las interacciones ADN-proteína es una herramienta indispensable en la evaluación de la expresión génica y la función celular.

Existen varias técnicas para evaluar las interacciones ADN-proteína in vitro , tales como el Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) y DNase I footprinting 1 , 2 . Sin embargo, estas técnicas no analizan la interacción proteína-ADN dentro de la cromatina y el contexto celular. ChIP iSa que captura proteínas unidas a sus sitios de unión de ADN específicos y facilita de este modo la identificación de interacciones ADN-proteína dentro del contexto de la cromatina. La técnica fue desarrollada originalmente por Gimour y Lis para la evaluación de ARN polimerasa II vinculante a genes específicos en Escherichia coli y Drosophila melanogaster [ 3 , 4] . Se realiza mediante la fijación de los complejos de ADN-proteína, seguido de la extracción de cromatina y cizallamiento del ADN en fragmentos de aproximadamente 200 pares de bases (pb). Posteriormente, la proteína de interés unida al ADN se aísla por inmunoprecipitación. Después de la inversión de la reticulación ADN-proteína, el ADN se purifica y analiza. Pueden usarse varios métodos para el análisis de los sitios de unión a proteínas y dependen de la secuencia de ácido nucleico del sitio de unión a proteínas dentro del gen diana 5 . En los casos en que se conoce la secuencia de ADN, la norma PolYmerase Chain Reactions (PCR), usando pares de cebadores específicos flanqueando el sitio de unión conocido. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) también puede ser utilizado [ 6] . En los casos en que la secuencia es desconocida, ChIP puede combinarse con microarrays de ADN (ChIP-on-chip), secuenciación de ADN (ChIP-seq) o técnicas de clonación 7 , 8 , 9 .

La vía TGF-β tiene potentes funciones supresoras de tumores y es una vía clave en la diferenciación celular. Se activa a través de la unión del ligando TGF-β1 a su complejo receptor cognato, resultando en la fosforilación serina de factores de transcripción SMAD2 / 3. Tras su asociación con el mediador común SMAD4, el complejo SMAD se trasloca al núcleo y se une al SBE dentro de la región promotora de los genes diana, donde regula los genes que controlan el ciclo celular, la apoptosis y la diferenciación celularen. La respuesta transcripcional a la estimulación de TGF-β es de tipo celular y de contexto específico [ 10] . Recientemente, se describe un lazo de retroalimentación positiva entre TGF-β y el c-KIT vía 11 . En este modelo, el SMAD2 activado por TGF-β1 se une al promotor del ligando c-KIT e induce su expresión y secreción. Posteriormente, el ligando c-KIT activa el receptor c-KIT de una manera auto- y para-crínica. C-KIT activación del receptor en STAT3 Tyr 705- fosforilación a través de JAK1 / 2. Tras la activación de STAT3 y la translocación nuclear, STAT3 se une al gen del ligando TGF-β1 y regula su expresión.

Aquí, se demuestra el papel esencial del análisis de ChIP para la identificación de SMAD2 vinculante a la c-KIT receptor ligando promotor y para la identificación del transductor de señal (y) Activador (de) Transcripción 3 (STAT3 vinculante a la TGF-β1- gene).

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Protocolo

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1. Preparación de Soluciones

  1. Prepare las siguientes soluciones frescas para cada experimento.
    1. Para la solución de fijación , se prepara 37% formaldehído y se almacena a temperatura ambiente. Diluir en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) hasta una concentración final de 1,42%.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído se clasifica como irritante, corrosivo, mutagénico, teratogénico y carcinógeno. No ingerir. No respirar los gases / humos / vapores / aerosoles. en caso de falta de ventilación, lleve equipo de respiración adecuado. Evite el contacto con la piel y los ojos. Mantener alejado de sustancias incompatibles, tales como agentes oxidantes, agentes reductores, ácidos, álcalis y humedad.
    2. Para la solución de fijación de glicina, preparar glicina 0,125 M en solución de 1x PBS y almacenarla a TA.
    3. Para la solución de raspado de células, preparar una solución 1x PBS en dH2O y almacenarla en hielo. Directamente antes de su uso, añada el inhibidor de la proteinasa fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) tOa una concentración final de 0,5 mM.
      PRECAUCIÓN: El PMSF se clasifica como corrosivo y tóxico; Use ropa protectora y úsela en un área ventilada.
    4. Directamente antes de usar el tampón de lisis celular (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 85 mM y NP40 al 0,5%), añadir 1X Coqueta de Inhibidores de Proteasa (PIC; 100x solución madre en dimetilsulfóxido (DMSO) Hidrocloruro de fluoruro de 2-aminoetil) bencenosulfonilo (AEBSF), aprotinina 80 mu M, bestatina 4 mM, E-64 1,4 mM, leupeptina 2 mM y pepstatina A 1,5 mM) y PMSF 0,5 mM.
    5. Directamente antes de usar el tampón de lisis de núcleos (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, ácido etilendiaminotetraacético 10 mM (EDTA) y SDS al 1%), añadir PIC 1X y PMSF 0,5 mM.

2. Fijación y Cizallamiento de la Célula

  1. Crecer las células a 70-80% de confluencia en 10 cm placas de cultivo de tejidos. Estimular las células por los objetivos experimentales.
  2. Eliminar el medio de cultivo de tejido, añadir 5 ml de solución de fijación e incubarLas células durante 10 min a RT en una plataforma de agitación.
  3. Se retira la solución de fijación y se lavan las células dos veces con 10 ml de PBS 1x helado.
  4. Eliminar el PBS 1x, añadir 5 ml de solución de glicina stop-fix, e incubar las células durante 5 min a RT en una plataforma de agitación.
  5. Se retira la solución de fijación de glicina y se lavan las células dos veces con 10 ml de PBS 1x helado.
  6. Retire el 1x PBS, agregue 2 mL de solución de raspado de células y recoja las células usando un raspador de células. Transferir las células cosechadas a un tubo cónico sobre hielo.
  7. Centrifugar las muestras durante 10 min a 600 xg y 4 ° C.
  8. Se retira el sobrenadante, se vuelve a suspender el sedimento en 1 ml de tampón de lisis celular 1X y se incuba en hielo durante 30 min. Alternativamente, se puede congelar a presión el gránulo en nitrógeno líquido y almacenarlo a -80ºC.
  9. Una vez que el sedimento se resuspendió en el tampón de lisis celular, transferir la suspensión de células a un homogeneizador de dounce helado y dounce durante 10 carreras usando un pestl de tipo BE para la disrupción celular.
  10. Transferir la suspensión de células a un tubo de microcentrífuga y centrifugar las muestras durante 10 min a 2.400 xg y 4 ° C.
  11. Desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento en 350 μL de tampón de digestión de núcleos e incubar las muestras durante 5 minutos a 37 ° C.
  12. Añadir nuclease micrococcal (1 U / μL) y mezclar por vórtex. Incubar las muestras a 37 ° C durante 5-20 min; Mezclar las muestras cada 2 min por inversión.
    NOTA: El tiempo y la concentración enzimática difieren entre líneas celulares y pueden requerir optimización en casos de cizallamiento enzimático subóptimo.
  13. Alternativamente, lograr el cizallamiento de la cromatina por sonicación usando sonicadores comercialmente disponibles.
    NOTA: Las condiciones de sonicación requerirán optimización. A continuación se proporciona un protocolo de ejemplo de optimización usando un volumen de muestra de 300 μl y una potencia de procesamiento de muestra de 25%.
    1. Después de la etapa 2.10, desechar el sobrenadante y resuspender el nUclear en 1,0 ml de tampón de cizallamiento comercial.
    2. Alícuota de 300 μl del sedimento nuclear resuspendido en tres tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Colóquelos en el hielo.
    3. Cizallar las 3 alícuotas de cromatina fija al 25% de potencia utilizando 3 condiciones diferentes para determinar las condiciones óptimas de sonicación:
      5 pulsos de 20 s cada uno, con un descanso de 30 s sobre hielo entre cada pulso.
      10 pulsos de 20 s cada uno, con un reposo de 30 s sobre hielo entre cada pulso.
      20 pulsos de 20 s cada uno, con un descanso de 30 s sobre hielo entre cada pulso.
    4. Continúe con el Paso 2.15, como se describe a continuación.
  14. Después de la incubación con la nuclease micrococcal, añadir 7 μl de EDTA 0,5 M enfriado con hielo para detener la reacción.
  15. Centrifugar las muestras con el ADN cortado durante 10 min a 16.200 xg y 4 ° C.
  16. Transferir el sobrenadante que contiene ADN cortado a un tubo de microcentrífuga fresco. Alícuota de 50 μl en un tubo de microcentrífuga separado para confirmar el suCizallamiento excesivo del ADN (sección 3). Utilice el volumen restante inmediatamente para inmunoprecipitación (sección 4) o guárdelo a -80 ° C.

3. Confirmación de la Eficiencia de Corte

  1. Añadir 150 μL de dH2O libre de nucleasa y 10 μL de NaCl 5 M a la alícuota de 50 μl de la cromatina cortada de la etapa 2.16.
  2. Incubar las muestras a 65 ° C durante 4 h para invertir los enlaces cruzados.
  3. Añadir 2 μl de RNasa A (10 μg / μl) e incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min.
  4. Añadir 10 μL de proteinasa K (0,5 μg / μl) e incubar las muestras a 42 ° C durante 90 minutos.
  5. Para la purificación del ADN, realizar una extracción de fenol / cloroformo 12 .
    1. Añadir agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 200 μl. Añadir 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) a la muestra y agitar durante 20 s.
    2. Centrifugar a temperatura ambienteDurante 5 min a 16.000 x g. Quitar cuidadosamente la fase acuosa superior y transferirla a un tubo nuevo. Asegúrese de no transportar ningún fenol durante la pipeta.
    3. Añadir 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M (NH4OAc), pH 5,2, y mezclar agitando varias veces el tubo con un dedo. Añadir 2,5 volúmenes de etanol 100% enfriado con hielo y mezclar por vórtex durante 5 s. Incubar la muestra O / N a -20 ° C, o durante al menos 1 h a -80 ° C.
    4. Centrifugar la muestra durante 30 min a 4 ° C y 16.000 xg para sedimentar el cDNA.
    5. Retirar con cuidado el sobrenadante sin interrumpir el gránulo. Añadir 1 mL de RT, etanol al 70% e invertir el tubo varias veces.
    6. Centrifugar la muestra durante 2 min a 4 ° C y 16.000 x g. Retire cuidadosamente el sobrenadante.
    7. Se seca el gránulo durante 5-10 minutos a TA. Resuspender el sedimento en 30 μl de dH $ ₂ $ O.
  6. Utilizar una alícuota de 5 y 10 μl del ADN purificado para electroforesis en gel con un 1% de TAEGel de agarosa.
    NOTA: El exitoso corte de la cromatina da como resultado un patrón de ADN de 200-1.500 pb. Si el cizallamiento no tiene éxito, determine las condiciones de cizallamiento óptimas para las células específicas modificando el tiempo de incubación de la etapa de cizallamiento (etapa 2.12) a 5, 10 y 15 min.
  7. Utilice la muestra restante para analizar la concentración de ADN de la muestra. Reverse-calcule la concentración de ADN en la muestra de cromatina cortada (paso 2.16); Utilizar las mismas cantidades de ADN para cada grupo de tratamiento para la inmunoprecipitación (sección 4).

4. Inmunoprecipitación

  1. Combinar 10-25 μg de la cromatina reticulada cortada (etapa 2.16) con 25 μL de perlas magnéticas de proteína G de grado ChIP, 10 μl de tampón de dilución de inmunoprecipitación (solución madre: SDS al 0,01%, Triton X-100 al 1,1%, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1,2 mM y NaCl 167 mM) y 1 μl de PIC.
  2. Después de 4 h de incubación, se a~naden 1-10 μg de anticuerpo (el anticuerpo concentradoLa variación dependerá de la afinidad del anticuerpo; Debe utilizarse inicialmente según las recomendaciones del fabricante y optimizado experimentalmente si es necesario) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir dH 2 O a un volumen final de 100 μl.
    NOTA: En lugar del método de inmunoprecipitación directa descrito anteriormente, se puede usar el método de inmunoprecipiación indirecta combinando primero la cromatina con los anticuerpos y añadiendo posteriormente perlas magnéticas de proteína G.
  3. Incubar las muestras en un rotador de extremo a extremo durante 4-12 horas a 4 ° C.

5. Elución

  1. Coloque los tubos en un soporte magnético. Una vez que las perlas magnéticas se agregan en el lado del tubo, retire cuidadosamente y deseche el sobrenadante.
  2. Lavar las perlas tres veces con 800 μl de tampón de lavado 1 (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM pH 8, Tris-HCl 20 mM, pH 8 y NaCl 150 mM); Mezcle invirtiendo el tubo varias veces. Coloque el tubo en el soporte magnético aY retirar cuidadosamente el tampón de lavado una vez que las bolas magnéticas se agregan en el lado del tubo.
  3. Lavar las perlas una vez con 800 μl de tampón de lavado 2 (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM, pH 8, Tris-HCl 20 mM pH 8 y NaCl 500 mM); Mezcle invirtiendo el tubo varias veces. Coloque el tubo en el soporte magnético y retire con cuidado y deseche el tampón de lavado una vez que las perlas magnéticas se agregan en el lado del tubo.
  4. Resuspender las perlas en 50 μl de tampón de elución (SDS al 1% y NaHCO3 100 mM) e incubar las muestras en un rotador de extremo a extremo durante 15 minutos a TA.
  5. Coloque los tubos sobre un soporte magnético, y una vez que las bolas magnéticas se acumulan en el lado del tubo, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
  6. Añadir 6 μl de NaCl 5 M, para invertir la reticulación, y 2 μL de proteinasa K (0,5 μg / μl). Después de mezclar las muestras, incubar las muestras durante 2 h a 65 ° C.
  7. Para la purificación del ADN, realizar un pheNol / cloroformo 12 (etapa 3.5) y posteriormente resuspender el sedimento en 30 μl de dH2O.
    NOTA: Las muestras se pueden analizar directamente en cuanto a sitios de unión a proteínas (sección 5) o pueden almacenarse a -20ºC.

6. Análisis del sitio de enlace

  1. Realice un análisis para sitios de unión específicos dentro de una secuencia de ácido nucleico conocida usando PCR o qRT-PCR. Para el diseño del cebador, siga protocolos convencionales de PCR o qRT-PCR. Diseñe los cebadores para sintetizar un amplicón de 150-400 pb que puentee el sitio de unión a proteínas de interés ( Figura 1 ).
  2. Preparar la PCR usando cuatro plantillas de ADN diferentes para asegurar la especificidad: i) ADN de ChIP inmunoprecipitado con el anticuerpo de interés, ii) ADN de ChIP inmunoprecipitado con un anticuerpo IgG no específico, iii) ADN de entrada, e iv) H 2 O como Negativo para la PCR para descartar la contaminación. En el caso de la estimulación de la vía, Elija una quinta plantilla utilizando un conjunto diferente de cebadores específicos para un sitio de unión conocido de la proteína inmunoprecipitada.
    NOTA: En el caso del análisis del promotor de ligando c-KIT, use PCR convencional para demostrar la unión SMAD inducida por TGF-β en el SBE dentro de la región promotora del ligando c-KIT. Como control positivo, realizar la PCR sobre el inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) como un objetivo conocido de unión a SMAD inducida por TGF-β.

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Resultados

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La unión del ligando de TGF-β1 a su complejo de receptor afín resulta en la fosforilación de serina de factores de transcripción de SMAD2 / 3, seguida por su asociación con el mediador común, SMAD4. El complejo SMAD se transloca al núcleo. TGF-β puede regular la transcripción de genes, ya sea directamente a través SMAD vinculante a SBEs dentro de las regiones reguladoras de los genes objetivo, o indirectamente a través de la expresión regulada por SMAD de activadores transcripcionales o ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este informe, demostramos la unión inducida por TGF-β1 de SMAD2 a un SBE dentro del promotor del ligando c-KIT y la unión inducida por TGF-β1 de STAT3 a su secuencia de reconocimiento dentro del gen del ligando TGF-β1. Demostramos citoquina inducida por la unión de ambos factores de transcripción utilizando cromatina immunoprecipitation.

La inmunoprecipitación de cromatina es una poderosa herramienta para demostrar la unión directa de una proteína de interés al ADN, para caracterizar los ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fondos de inicio, BB).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células HepG2ATCCHB-8065
Células Hep3BATCCHB-8064
TGF-β 1R& D Systems101-B1Utilizado a una concentración de 10 ng/mL
Anticuerpo Anti-SMAD2Tecnología de señalización celular5339Cantidad utilizada/IP: 3 y micro; g
Anticuerpo anti-STAT3Tecnología de señalización celular4904Cantidad utilizada/IP: 3 y micro; g
ChIP-IT Proteína G Bolas Magnéticas ActiveMotif53033
Cóctel de inhibidores de proteasa ActiveMotif37490
Tecnología de señalización de célulasde nucleasa microcócica10011
PCR cebador directo: PAI-1Secuencia: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Imprimación inversa PCR: PAI-1Secuencia: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
Cebador de avance de PCR: Secuencia SCF: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'  
Imprimación inversa PCR: Secuencia SCF: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Imprimación directa de PCR: TGF-y beta; 1 (STB-1)Secuencia: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'  
Imprimación inversa de PCR: TGF-y beta; 1 (STB-1)Secuencia: 5'-TAGCTCTCTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'  
Imprimación directa de PCR: TGF-y beta; 1 (STB-2)Secuencia: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'        
Imprimación inversa de PCR: TGF-y beta; 1 (STB-2)Secuencia: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'    

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Promotor de c KITinteracci n prote na ADNuni n de SMAD2se alizaci n de TGF betafactor de c lulas madreuni n de factores de transcripci nensayo de promotoruni n de STAT3diferenciaci n celular

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