Method Article

Un método para probar el efecto de las señales ambientales sobre el comportamiento de apareamiento en Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55690

⸱

July 17th, 2017

 , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se demuestra un ensayo para analizar las señales ambientales y genéticas que influyen en el comportamiento de apareamiento en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El impulso sexual de un individuo está influenciado por el genotipo, la experiencia y las condiciones ambientales. Cómo estos factores interactúan para modular comportamientos sexuales sigue siendo mal entendido. En Drosophila melanogaster , las señales ambientales, como la disponibilidad de alimentos, afectan la actividad de apareamiento, ofreciendo un sistema manejable para investigar los mecanismos que modulan el comportamiento sexual. En D. melanogaster , las señales ambientales a menudo se perciben a través de los sistemas gustativo y olfativo quimiosensoriales. Aquí, presentamos un método para probar el efecto de las señales químicas ambientales en el comportamiento de apareamiento. El ensayo consiste en una pequeña arena de apareamiento que contiene medio de alimento y una pareja de apareamiento. La frecuencia de apareamiento para cada pareja se controla continuamente durante 24 h. Aquí presentamos la aplicabilidad de este ensayo para probar compuestos ambientales de una fuente externa a través de un sistema de aire presurizado, así como la manipulación de los componentes ambientales directamente en el campo de apareamiento. El uDe un sistema de aire a presión es especialmente útil para probar el efecto de compuestos muy volátiles, mientras que la manipulación de componentes directamente en el campo de acoplamiento puede ser de valor para determinar la presencia de un compuesto. Este ensayo puede adaptarse para responder a preguntas sobre la influencia de las señales genéticas y ambientales en el comportamiento de apareamiento y la fecundidad, así como otros comportamientos reproductivos masculinos y femeninos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los comportamientos reproductivos suelen tener altos costos de energía, especialmente para las hembras, que producen gametos más grandes que los machos y deben escoger cuidadosamente las condiciones para criar a sus descendientes en desarrollo. Debido al costo energético, no es de extrañar que la reproducción esté relacionada con las condiciones nutricionales. Esto es cierto en la mayoría de los animales, incluso en los mamíferos, cuya pubertad puede ser retardada por la desnutrición y cuyo impulso sexual puede verse afectado negativamente por la restricción de los alimentos 1 .

La reproducción del organismo genético modelo Drosophila melanogaster también se ve afectada por las condiciones nutricionales. Los varones corte en el nivel más alto en la presencia de los volátiles del alimento 2 , y las hembras son sexualmente más receptivas en presencia de la levadura, un nutriente importante para la producción del huevo y la supervivencia de la descendencia 3 , 4 , 5 . EstaLa respuesta reproductiva evolutiva conservada a los alimentos ofrece la oportunidad de estudiar mecanismos que conectan la disponibilidad de alimentos ambientales a la reproducción sexual en un organismo geneticamente manejable y eficiente en el tiempo. De hecho, el trabajo en D. melanogaster ha implicado la vía de la insulina como un importante regulador de la conexión entre la comida y el comportamiento de acoplamiento [ 6] . También ha demostrado que el acto de apareamiento a sí mismo cambia la preferencia alimentaria de las hembras, así como las neuronas quimiosensoriales asociadas 7 , 8 , 9 .

Está claro que las señales alimentarias afectan los comportamientos reproductivos en D. melanogaster . Estos efectos parecen afectar principalmente a las hembras, específicamente a las que ya se han apareado 5 . Sin embargo, para probar estos efectos agudos de las condiciones ambientales, el ensayo clásicamente utilizado para el comportamiento de apareamiento femenino podríaNo ser muy adecuado debido a las largas interrupciones entre los episodios de apareamiento. En el clásico ensayo de remate, una hembra virgen se aparea primero con un macho, y se aísla inmediatamente y se presenta con un nuevo macho 24 a 48 h después. Este ensayo clásico se ha utilizado con gran éxito para identificar componentes del eyaculado masculino que modifican el comportamiento femenino y la respuesta femenina 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . El ensayo de apareamiento continuo demostrado aquí es, por lo tanto, una adición a los ensayos de apareamiento clásicos que pueden usarse para estudiar el efecto agudo de las condiciones ambientales en los comportamientos reproductivos.

Utilizando el ensayo continuo para el comportamiento de apareamiento que se explica aquí, hemos demostrado previamente que un par de moscas expuestas a la levadura remate sCada vez durante un período de observación de 24 h 5 , 19 , 20 , 21 , mientras que las moscas no expuestas a los alimentos sólo remate una vez 5 . Este hallazgo puede ser desconcertante a la luz de una gran parte de la literatura de D. melanogaster que indica que las hembras no remate durante varios días después de un apareamiento inicial (revisado en las referencias 10 , 11 ). Sin embargo, esta discrepancia puede ser fácilmente explicada por condiciones de ensayo, donde una hembra se aísla de uno a varios días antes de que se proporcione una nueva oportunidad de apareamiento. Si la pareja no se aparea en este período de observación de una hora, la hembra se caracteriza por no ser receptiva. Por otra parte, la alta frecuencia de apareamiento no debe ser sorprendente, dado que los datos de las moscas capturadas en el medio silvestre muestran que las hembras contienen espermatozoides de 4 a 6 machos en sus órganos de almacenamiento; Por lo tanto enIndicando que las hembras naturalmente remate varias veces 22 , 23 .

Aquí, demostrar el uso de este ensayo de apareamiento continuo para desentrañar cómo las moscas recopilar y combinar la información sobre las condiciones ambientales para modular la frecuencia de apareamiento. Este ensayo permite probar un número relativamente grande de parejas de apareamiento para estudios genéticos y probar la influencia de señales ambientales volátiles y no volátiles. El ensayo típicamente dura 24 h, pero se puede extender hasta 48 h, permitiendo la prueba de ciclos ambientales como el ciclo luz-oscuridad (LD). Demostramos este ensayo mediante la prueba de la influencia de las señales volátiles de un cultivo de levadura dentro de un sistema de aire presurizado en combinación con la disponibilidad de nutrientes no volátiles de levadura en el sustrato de alimentos.

El sistema de aire presurizado bombea continuamente señales volátiles en una arena de acoplamiento que contienenUn sustrato alimenticio y una pareja de prueba (cuyo comportamiento de apareamiento es controlado). Para determinar adicionalmente las especificidades a través de las cuales la levadura influye en el apareamiento, probamos un compuesto volátil principal de levadura, a saber ácido acético 24 , en combinación con un contenido de aminoácidos que corresponde al de la levadura en el sustrato alimenticio, en forma de peptona Ácidos derivados de la digestión enzimática de proteínas animales). Juntos estos experimentos demuestran cómo el efecto de señales ambientales en el comportamiento de apareamiento de D. melanogaster puede ser probado con este ensayo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Caja de acoplamiento ambientalmente controlada

  1. Para asegurar un área de prueba controlada y fácil de limpiar, configure un gabinete de cocina de acero inoxidable de 120 cm x 64 cm x 85 cm como se ilustra en la Figura 1A.
    1. Taladre un agujero en la parte posterior del gabinete justo debajo del techo y cuatro juegos de cuatro agujeros en los lados, cada uno con un diámetro de 2 cm. Perfore los dos primeros conjuntos de cuatro orificios, a cada lado de la caja a una altura de 7 cm desde el fondo de la caja y con 12,5 cm entre los agujeros. Taladre los otros dos conjuntos en cada lado de la caja a una altura de 35 cm desde el fondo.
      NOTA: Los cuatro juegos de cuatro orificios se utilizan para cables de alimentación de cámara y tubos de bomba de aire para entrar y salir del gabinete. El agujero en la parte posterior se utiliza para los cables de alimentación de una placa de luz.
    2. Construir un tablero de luz con 18 filas de 40 diodos electroluminiscentes blancos y rojos alternos (LED) con un espacio de 2,5 cm entre cada luz. Montar los LEDs blancos y rojos en un circuiT con fuente de alimentación. Conecte cada LED en serie con una resistencia de 560 Ω, 0,25 W y 5% de tolerancia.
      NOTA: Las longitudes de onda de emisión de la luz roja se extendieron desde 590-661 nm con un pico pronunciado a 627 nm. La intensidad luminosa resultante en el área experimental es de aproximadamente 900 lux con las luces encendidas y 90 lux con sólo las luces rojas encendidas; Esto se midió usando una aplicación de medidor de luz de smartphone.
    3. Coloque la placa de luz en la parte superior del gabinete de acero inoxidable y pasar los cables de alimentación a través del agujero en la parte posterior.
    4. Conecte el adaptador de los LED blancos a un temporizador de control de potencia para permitir el apagado del LED blanco durante la fase oscura del experimento. Conecte el adaptador de la luz roja, que vuela son ciegos a 25 , a una fuente de alimentación regular para mantenerlos encendidos durante toda la duración del experimento.
    5. Fijar uno de 110 cm y dos soportes de metal de 54 cm de largo, cada uno con un ancho de 0,5 cm, a los lados interiores de la caja a una altura de 50Cm desde el fondo de la caja. Coloque una placa de difusión de vidrio esmerilado (dimensiones de 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) en estos soportes.
    6. Añadir tres capas de papel de filtro (120 cm x 50 cm) entre el tablero de luz y la placa de vidrio para difundir la luz y limitar el deslumbramiento en la superficie de las arenas de apareamiento (descritas en la sección 4). Pin de dos hojas de papel de filtro juntos en su borde largo en barras de madera de 120 cm de largo con imanes (en el lado), para pegarlos en el interior del gabinete de metal; Realizar esta acción 3 veces.
    7. Coloque cuatro ventiladores en los lados de la caja para crear una corriente de aire que aísle continuamente la caja de acoplamiento. Coloque el primer conjunto de ventiladores de 8 cm entre la placa de luz y la placa de vidrio, con la entrada de aire en el lado izquierdo y el escape en el lado derecho de la caja, para minimizar la acumulación de calor generado por la placa de luz.
    8. Conecte el segundo juego de ventiladores de 12 cm a 25 cm por encima del fondo del gabinete para crear un flujo de aire hacia afueraNside del gabinete y lo enfría a una temperatura estable de 26 ° C. Conecte los ventiladores en el lado de escape a una manguera de succión y conduzca la corriente de aire fuera de la habitación para evitar el reciclaje del aire en el gabinete.
  2. Montar dos stands (aproximadamente 48 cm de altura) montados con dos pinzas, una a 28 cm y una a 30 cm de la base del soporte. Fije una webcam en cada una de las abrazaderas. Conecte las 4 cámaras a un ordenador que ejecute el software de supervisión.
  3. Coloque hojas A4 debajo de cada webcam. Use hojas o hojas blancas no impresas con una cuadrícula pre numerada de 7 por 5 cuadrados con ejes de 4 cm para acomodar las arenas de apareamiento (descritas en la sección 4).
    NOTA: Una cámara web HD con una gran angular de 78 ° y una resolución de 5 millones de píxeles puede cubrir un área de 21 cm x 30 cm correspondiente a una hoja A4 y monitorizar entre 20 y 35 arenas de acoplamiento.

2. Cría y recolección de moscas

  1. Coloque 20 machos y 20 hembras de tipo salvaje Canton-SVuela en botellas de cría de moscas que contienen 45 ml de medio rico en moscas (ver sección 3) durante tres a cuatro días. Transferir los mismos adultos tres veces primero golpeándolos hacia abajo y luego en botellas frescas.
    1. Colocar las botellas en una incubadora a 25 ° C, y 12 h: ciclo de luz-oscuridad de 12 h con las luces encendidas a las 09:00 (hora Zeitgeber (ZT) 0). Una nueva generación aparecerá unos 10 días más tarde.
  2. Anestesiar las moscas recién cerradas resultantes en las almohadillas del dióxido de carbono por no más de 5 minutos y recogerlas en viales del mosca del alimento usando un cepillo de pintura.
    1. Recolecte las hembras vírgenes (recién cerradas) y los machos virginales de las botellas salvajes de tipo salvaje Canton-S en frascos de cría de moscas de 2,5 cm x 9,5 cm con 6,5 ml de medio rico en moscas.
  3. Age las moscas en grupos del mismo sexo de 20 moscas cada uno en viales de cría de moscas durante 5 a 8 días a 25 ° C y 12 h: ciclo de luz-oscuridad de 12 h y se enciende a las 09:00 (ZT 0).
  4. TransfEr las moscas a viales de cría de mosca fresca en el día antes del experimento.

3. Preparación del alimento

  1. Prepare 1 L de medio de mosca rica como sigue.
    1. Vierta 1 L de agua del grifo en un vaso de precipitados de vidrio de 2 l con una barra de agitación magnética y coloque el vaso en una placa caliente magnética. Mantenga la agitación apagada y gire el calentamiento hasta 300 ° C hasta alcanzar la temperatura de ebullición.
      NOTA: Durante el tiempo de ebullición largo en los siguientes pasos se evaporará una proporción de agua, pero junto con los ingredientes añadidos, este protocolo da como resultado 1 L de medio de mosca rica cuando se prepara a temperatura ambiente de aproximadamente 22ºC.
    2. Se añaden los siguientes ingredientes al agua hirviendo: 10 g de agar, 30 g de glucosa, 15 g de sacarosa, 15 g de harina de maíz, 10 g de germen de trigo, 10 g de harina de soja, 30 g de harina de soja Melaza, 35 g de levadura seca activa. Espere a que la levadura espuma vigorosamente, luego baje la temperatura de la placa calienteHasta 120 ° C.
    3. Después de 10 minutos, gire la placa caliente hasta 30ºC y deje que la mezcla se agite hasta que se enfríe a 48ºC. Controle la temperatura insertando un termómetro directamente en el alimento.
    4. Disolver 2 g de éster metílico del ácido p-hidroxibenzoico (tegosept, 100%) en 10 ml de etanol al 96%. Añadir esto y 5 ml de ácido propiónico 1 M a la mezcla. Se agita durante 3 min.
    5. Vierta el medio alimenticio de la mosca en las arenas (descrito en la sección 4) para crear una capa de 0.3 cm de espesor en la parte inferior de la arena.
      1. Utilice un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml para verter. Cuando las cantidades exactas son importantes, use una pipeta serológica de 10 ml.
  2. Preparar mosca medio menos levadura exactamente como se describe en el paso 3.1.1 hasta 3.1.5, pero dejar de levadura en el paso 3.1.2.
  3. Preparar el medio con agar con o sin peptona mezclando 10 g de agar y 35 g de peptona en 1 L de agua hirviendo y realizar los pasos 3.1.4 a 3.1.5.

4. MatinG Preparación de la arena

  1. Perfore un orificio de aproximadamente 0,3 cm de diámetro en la parte superior de una placa de plástico de 3,5 cm x 1,0 cm de plástico usando una aguja de preparación calentada (calentada a rojo en un quemador Bunsen). Como alternativa, utilice un soldador.
  2. Cuando se prepara un medio alimenticio con compuestos olorosos, primero se pipetean 30 μl (1% del medio alimentario final, por ejemplo, ácido acético glacial 100%) del compuesto deseado en el plato para la mitad de los platos experimentales. Deje la otra mitad de los platos vacíos para la comparación.
    NOTA: Con la configuración descrita aquí, se puede probar un máximo de 140 arenas a la vez.
  3. Utilizando una pipeta serológica de 10 ml, vierta 3 ml de medio alimenticio en la parte inferior del plato en la parte superior del compuesto deseado. Cubrir con un paño de queso para evitar la contaminación, y dejar el medio para solidificar durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente.
  4. Coloque una tapa en los platos y cinta cada uno cerrado en dos lados. Prepare pequeños tapones de película de parafina para cubrir los orificios deLos platos enrollando trozos de película de parafina en rodillos de 0,2 cm de espesor y luego cortarlos en segmentos de 0,5 cm.

5. Cultura de la levadura para el olor

  1. Crecer levadura activa seca en extracto de levadura de agar dextrosa peptona (YPD) en una placa de Petri de 14,0 cm x 2,06 cm. Use guantes para evitar la contaminación en este paso.
    1. Preparar las placas de agar YPD añadiendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 22 g de glucosa (monohidrato de 0 (+) - glucosa) y 15 g de agar (puro) a 1 L de agua ultrapura hirviendo. Capa el fondo de la placa de Petri una vez que todo se disuelve y se almacena boca abajo en el refrigerador a 4 ° C, durante un máximo de 2 meses.
    2. Espolvorear unos cuantos granos de levadura seca en una placa mediana de YPD, dejar que se disuelvan. A continuación, seque la placa mediana con un bucle estéril. Guarde la placa en un incubador a 30 ° C durante la noche. Después, almacene el cultivo en el refrigerador por no más de 1 semana.
  2. Preparar el medio líquido YPD iN 1 L de botellas añadiendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 22 g de glucosa (monohidrato de 0 (+) - glucosa) y una barra de agitación a 1 L de agua ultrapura.
    1. Autoclave durante 25 min a 120 ° C y 1 bar de presión. A continuación, guarde las botellas a 4 ° C durante un máximo de 2 meses hasta su uso.
  3. Coloque tapas de botellas abiertas (4,5 cm) con un tabique de silicona de 0,32 cm de espesor.
    1. Cortar dos pequeños orificios en el tabique para ajustarse perfectamente a los accesorios de mamparos de púas. Conecte el tubo pequeño de cloruro de polivinilo (PVC) (diámetros: exterior 0,8 cm e interior 0,5 cm) a ambas salidas que salen de la botella ya sólo una de las entradas que entran en la botella. Vea la figura 1B para ilustración.
    2. Envuelva las tapas y el tubo en papel de aluminio y autoclave durante 25 min a 120 ° C y 1 bar de presión.
  4. Use guantes para protegerse contra la contaminación en este paso. Sumerja una punta de pipeta estéril de 100 μL en una de las colonias de levadura de la placa de agar YPD (dDescrito en 5.1) y colóquelo en la botella de medio líquido YPD esterilizada en autoclave.
    1. Cubra esta botella de medio líquido YPD inoculada con levadura, así como una botella de control de medio YPD (levadura no añadida) con tapas autoclavadas montadas con entrada y salida (descritas en el paso 5.3). Se ponen ambas botellas en placas magnéticas separadas y se agitan a 100 rpm a temperatura ambiente durante 24 h antes del inicio del experimento para permitir que el cultivo de levadura crezca.
    2. Conecte las entradas de ambas botellas para separar las bombas de acuario para suministrar aire al cultivo de levadura. Asegúrese de conectar la salida de la botella experimental de levadura a un tubo que ventila el olor de la levadura fuera de la sala experimental para evitar la interferencia con el experimento.

6. Configuración de la bomba de aire

  1. Conecte el tubo de PVC grande (diámetros: 1,2 cm exterior y 0,9 cm interior) a un suministro de aire presurizado y conduzca a través de dos matraces Erlenmeyer de vidrio de 1 L rellenos con carbón activado a los 800 mlLínea para purificar el aire. Utilice aire presurizado comúnmente suministrado en laboratorios como suministro de aire, o conecte los tubos a una bomba de aire (se utilizó aire a presión aquí).
    NOTA: El material de la tubería debe seleccionarse sobre la base de las propiedades químicas de los volátiles y probado para evitar que los volátiles se peguen al revestimiento de la tubería (por ejemplo, politetrafluoroetileno, nylon o acero inoxidable).
  2. Haga dos divisores de aire de tubos de 15 mL y tres puntas de pipeta de 1,000 μL cada una.
    1. Haga tres agujeros de ~ 1 cm de diámetro. Primero quemar dos agujeros, usando una aguja de preparación calentada (calentada en rojo en un quemador Bunsen), adyacentes entre sí justo debajo de la tapa del tubo de 15 mL. Luego haga el tercer orificio quitando la parte inferior del tubo.
    2. Pegue las puntas de la pipeta de 1.000 μl en los orificios con el extremo estrecho apuntando hacia fuera. Corte el extremo de las puntas de la pipeta para permitir un mayor flujo de aire.
  3. Conecte el tubo de PVC grande de la salida de la cLleno de harcoal en la punta de la pipeta en la parte inferior del tubo de 15 ml. Agregue pequeñas salidas de tubos de PVC a las dos puntas de pipeta horizontales y conduzca hacia un control y una botella experimental.
  4. Para evitar la contaminación del medio YPD con microorganismos, fije el tubo pequeño a un filtro de jeringa estéril (tamaño de poro de 0,45 μm) con un empuje de plástico en el conector de la tubería del mamparo que va hacia el filtro y un tornillo en el conector plástico del tabique que sale del filtro. A continuación, conecte el tubo a la entrada de la botella de cultivo YPD (ver Figura 1B ).
  5. Para evitar que la levadura transportada por el aire se desplace desde el matraz de cultivo al campo experimental, coloque un tubo de vidrio (6,5 cm de largo, diámetro exterior = 0,5 cm y diámetro interior = 0,3 cm) a la salida de cada botella de cultivo YPD usando tubos pequeños. Conecte el tubo de PVC al otro lado del tubo de vidrio y guíelo hacia los orificios inferiores (perforados a cada lado) de la caja del experimento.
    1. Llene el tubo con fibra de vidrio y autoclavelo antes de usarlo.
  6. Agregue otro tubo de 15 ml (descrito en la sección 6.2) a la tubería pequeña de PVC, a cada lado de la caja experimental, para que dos tubos entren en la caja en el lado experimental (más cercano al escape de la corriente de aire del ventilador, a la derecha) Y el lado de control (más cercano a la entrada de la corriente de aire del ventilador, a la izquierda).
  7. Prepare 8 pipetas serológicas de 25 ml cada una con 10 salidas para probar 80 pares de machos al mismo tiempo, es decir , 40 para cada condición de aire.
    1. Quemar 10 agujeros de ~ 0,8 cm de diámetro, 2 cm de distancia en la pipeta.
    2. Corte la parte externa de una jeringuilla de 1 ml en una pequeña (2,5 cm) y una gran (5 cm) de salida.
    3. Pegue estas salidas en los orificios con pegamento caliente.
    4. Envuelva una pequeña banda de película de parafina de plástico alrededor del extremo de los enchufes y adjunte una punta de pipeta de 1000 μL. El diámetro de la abertura de la punta es de 0,1 cm. Utilice consejos limpios para cada experimento.
  8. Coloque dos pipetas serológicas, utilizando un divisor T con diámetro exterior ≥ 0,5 cm y piezas cortas de tubo pequeño de PVC, a cada una de las dos salidas en ambos lados. Tape las pipetas sobre la hoja de papel blanco (debajo de las cámaras en la caja de acero).
  9. Utilizando un monitor de flujo de aire, ajuste el flujo de aire de modo que la velocidad del aire a la salida de la punta de la pipeta de 1000 μL sea de 0,5 m / s. Esto corresponde a un flujo de aire de 0,0017 L / s por punta.

7. Supervisión del comportamiento de apareamiento

  1. Use una pipeta de boca (como se describe en la referencia 26 ) para colocar una hembra experimental en una pequeña placa de Petri (descrita en la sección 4) a las 15:00 (ZT 6) y darle 1 h para aclimatarse a la arena de apareamiento.
  2. Configure la caja experimental (descrita en la sección 1) como sigue:
    1. Encienda las luces, es decir , los LED de luz blanca en un ciclo de 12h: 12 h luz-oscuridad conectado a un temporizador queLuz a las 09:00 (ZT0) y LEDs de luz roja continua para permitir el monitoreo de las moscas durante la fase oscura del experimento. Encienda los ventiladores para limitar el calentamiento del gabinete por la fuente de luz y para asegurarse de que los excesos de olores se ventilan fuera del área de prueba.
    2. Conecte las cámaras de la webcam a una computadora e inicie con el software de monitoreo para monitorear la imagen.
    3. Para cada cámara, ajuste el enfoque, el brillo y el zoom en el software de monitoreo.
      1. Haga clic con el botón derecho en la pantalla de la cámara, abra "propiedades de la cámara" y desactive "enfoque automático". Ajuste el "enfoque" para aclarar la cuadrícula o cualquier palabra escrita en la hoja de papel. Si es necesario, cambie el "brillo" y el "zoom".
    4. Ajuste el programa del software de monitoreo para capturar 1 imagen cada 2 min. Haga clic con el botón derecho en cada pantalla de la cámara y seleccione "editar cámara" y luego la opción "Acciones". Haga clic para iniciar las acciones "At regular intErvals "y cambie el tiempo a" 2 minutos ". Elija" Take Photo "para seleccionar acciones para realizar y finalmente haga clic en" ok ".
    5. Haga clic con el botón derecho del ratón en cada pantalla de la cámara y seleccione "iniciar el monitoreo".
  3. Después de 1 h (en ZT 7), transfiera un macho de tipo salvaje a la placa de Petri usando la pipeta de boca, coloque el plato en las hojas de papel A4 debajo de las cámaras de webcam y haga clic en "start monitoring" durante 24 h. Para el experimento con la bomba de aire, coloque el plato de tal manera que una salida de pipeta esté conectada al orificio de entrada de la arena de acoplamiento.
  4. Para analizar el comportamiento de apareamiento de la pareja, haga lo siguiente.
    1. Seleccione y abra todas las imágenes de un software de visualización de imágenes y haga una página a través de ellas en orden cronológico.
    2. Anote la fecha, el número del experimento, el número del plato y la hora de inicio en una hoja de cálculo dentro de la misma fila. Tome la hora de inicio de cada arena desde el momento en que se coloca bajo la webcaM cámara Registre la marca de tiempo de las imágenes.
    3. Marque la hora de inicio de cada copulación en la misma fila en la hoja de cálculo. Contar un apareamiento como un incidente cuando el macho ha montado la hembra y la pareja permanece moderadamente estacionaria y en la misma postura por lo menos cinco cuadros consecutivos (10 min).
      NOTA: Este criterio se basa en la longitud reportada de cópula, que oscila entre 12 y 27 min en D. melanogaster , y la observación de que las copulaciones de 10 min y más son fértiles 27 , 28 .
    4. Contar el número de copulaciones para cada fila en la hoja de cálculo para determinar la frecuencia de apareamiento. Alternativamente, restar el tiempo de inicio del experimento desde el momento del primer apareamiento para cada fila como una medida de la latencia de acoplamiento, o restar el tiempo del primer acoplamiento del momento del segundo acoplamiento como una medida de la latencia remate.
      1. Para calcular la latencia de remate, asegúrese deDefinir las fechas del primer y el segundo apareamiento como días consecutivos en el software de la hoja de cálculo.
    5. Analizar los datos con modelos de efectos mixtos, suponiendo una distribución normal de los datos e incluyendo la fecha del experimento como un factor aleatorio, utilizando un software estadístico (ver tabla de materiales) para determinar la significación estadística de las variables independientes -medio alimentario, El tipo de aire y la interacción-como se ha descrito previamente 5 .
    6. Seleccione el mejor modelo de explicación realizando la eliminación hacia atrás de variables independientes no significativas usando pruebas de razón log-verosimilitud y la información Akaike asociada. Después de ejecutar el modelo, inspeccione visualmente los datos residuales para confirmar la normalidad. Confirmar la homogeneidad de las varianzas mediante la prueba de Levene. En el caso de homogeneidad desigual, la raíz cuadrada transforma los datos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este ensayo continuo, el comportamiento de apareamiento, y la frecuencia de apareamiento en específico, se puede determinar bajo condiciones ambientales experimentales. Para controlar las condiciones ambientales, transformamos un gabinete de cocina de acero inoxidable en un área de prueba, con su propia fuente de luz y difusión, lo que garantiza una gran cantidad de luz y una mínima cantidad de reflejos desde la parte superior de las arenas de apareamiento ( Figura 1A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un ensayo para probar el comportamiento de apareamiento durante 24 horas mientras se controlan continuamente las señales ambientales que se supone que una pareja conjugada usa para determinar la frecuencia de apareamiento. Es posible aumentar la frecuencia de apareamiento en respuesta al aire de levadura suministrado a través de un sistema de aire presurizado cuando el medio contiene levadura también ( Figura 2B ). Además, se puede observar una respuesta similar en la frecuencia ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses en competencia para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Damos las gracias al Bloomington Drosophila Stock Center para las acciones de la mosca; C. Gahr, JT Alkema y S. van Hasselt por su temprano intento de desarrollar el ensayo de aire presurizado; Jasper Bosman por el consejo sobre cultivar levadura; Y Rezza Azanchi y Joel Levine por haber desarrollado originalmente el monitoreo de lapso de tiempo del comportamiento de apareamiento de Drosophila . JA Gorter recibió el apoyo de una Beca del Programa de Posgrado BCN / NWO de la Escuela de Investigación Neurocientífica. Este trabajo fue apoyado en parte por la organización holandesa para la investigación científica (NWO) (referencia: 821.02.020) a JC Billeter.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CabinetArmario de cocina de
acero inoxidableHorecaworld7412.0105
LEDs blancosLucky Lightll-583wc2c-001LEDs blancos fríos, 20 mAmp y 2 V
rojosLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daLongitud de onda entre 625 nm, 20 mAmp y 6 V
ResistenciaRoyal OhmCFR0W4J0561A50560 ohmios, 0,25 W, 250 V y 5 % de tolerancia
Aplicación de medidor de luz para teléfonos inteligentesPatrick GiudicelliMedidor de luz/lux GRATIS, versión 1.1.1
Temporizador de potenciaAlectoTS-121
Soportes metálicosÁngulo agudo 5 por 5 mm, 2 x 5450 y 1 x 1100 mm de largo
Placa1190 x 545 x 5 mm
Papel de filtro hojasFiltros LEE220Escarcha blanca
Ventilador pequeñoNanoxia Silencio profundo426028529282880 mm Ventilador de PC ultrasilencioso, 1200 RPM
Ventilador grandeNanoxia Silencio profundo4260285292910120 mm Ventilador de PC ultrasilencioso, 650-1500 RPM
Cámara webcamLogitech950270B910 HD WEBCAM OEM, Ángulo: 78 grados, resolución: 5 millones de píxeles;  
Software de cámaraDeskShareMonitor de seguridad pro
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
>Fly rearing
Fly criando botellas Flystuff32-1306oz Caldo de Drosophila botella
FlypadFlystuff59-114
Moscas salvajesCanton-S
Viales de cría de moscasDominique Dutscher789008Drosophila tubos estrechos 25x95 mm
IncubadoraSanyoMIR-154
Placa calefactora magnéticaHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Ingredientes B.V.010001.26.0
GlucosaGezond& wel1019155Dextrosa/Druivensuiker
SacarosaVan GilseAzúcar granulada
Harina de maízFlystuff62-100
Germen de trigoGezond& Weel1017683
Harina de sojaFlystuff62-115
MelazaFlystuff62-117
Levadura seca activaRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%
Peptona (bacto)BD211677
Ácido AcéticoMerck1000631000Glacial, 100%
PetriGreiner bio-one62710235 x 10 mm con rejillas de ventilación Película de
parafinaBemis NAParafilm
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Levadura y configuración de aire a presión
Petriplato grandeGosselinBP140-01140 x 20,6 mm
Agua ultrapuraMillipore corporationMiliQ
Extracto de levaduraBD212750
Agar (puro)BD214530bacto
Glucosa (0(+)-glucosa monohidratada) Merck18270000004
Open gorrasSchott29 240 28 GL45
Tabique de siliconaVWR548-0662
Accesorios de mampara de púasNalgene6149-0002
Diámetro de tubo: exterior 1,2 cm e interior 0,9 cm
de tubo de: exterior 0,8 cm e interior 0,5 cm
Tubo de 15 mlBomba de acuario Falcon
SeraprecisionSera air 110 plus, CA 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W y presión >100 mbar
Carbón activadoSuperfishA8040400Carbón activado Norit
Unidad de filtrado desechableWhatman10462100
Pipetas serológicasVWR612-1600
BD Plastipak300013
Pegamento calientePattex
Filtro de jeringaWhatmanFP 30/tamaño de poro 0,45 mm CA-S
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Analysis
Statistics softwarePaquete Rlme4
de vidrio esmerilado Pequeña placa de de PVC grandeDiámetros pequeños PVC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575(2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Mating BehaviorEnvironmental CuesReproductive BehaviorsBehavioral AssayFood Medium PreparationChemosensory SystemsMating FrequencyPressurized Air SystemVolatile CompoundsFemale Receptivity

Related Articles