Artículo de método

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

DOI:

10.3791/55697

⸱

13 de junio de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este procedimiento describe cómo iniciar, extender y conectar rápidamente neuritas organizadas en cámaras microfluídicas usando perlas revestidas con poli-D-lisina fijadas a micropipetas que guían la elongación de las neuritas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las lesiones cerebrales y de la médula espinal pueden conducir a una incapacidad permanente ya la muerte porque todavía no es posible regenerar las neuronas a largas distancias y reconectarlas con precisión con un objetivo apropiado. Aquí se describe un procedimiento para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Las velocidades de extensión alcanzadas alcanzan más de 1,2 mm / h, 30-60 veces más rápido que las tasas in vivo de los axones de crecimiento más rápido del sistema nervioso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 y 10 veces más rápido de lo que se informó anteriormente para el mismo Neuronal tipo en una etapa anterior de desarrollo [ 4] . En primer lugar, las poblaciones aisladas de las neuronas del hipocampo de rata se cultivan durante 2-3 semanas en dispositivos microfluídicos para posicionar con precisión las células, lo que facilita la micromanipulación y reproducibilidad experimental. A continuación, se colocan perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL) sobre neuritas para formar adhesivoActúa y la micromanipulación con pipeta se utiliza para mover el complejo perla-neurita resultante. A medida que se mueve el cordón, extrae una nueva neurita que puede extenderse a lo largo de cientos de micrómetros y conectarse funcionalmente a una célula diana en menos de 1 h. Este proceso permite la reproducibilidad experimental y la facilidad de manipulación mientras se evitan las estrategias químicas más lentas para inducir el crecimiento de las neuritas. Las medidas preliminares presentadas aquí demuestran una tasa de crecimiento neuronal muy superior a las fisiológicas. La combinación de estas innovaciones permite el establecimiento preciso de redes neuronales en la cultura con un grado de control sin precedentes. Es un método novedoso que abre la puerta a una plétora de información y conocimientos sobre la transmisión de señales y la comunicación dentro de la red neuronal, además de ser un campo de juego en el que explorar los límites del crecimiento neuronal. Las aplicaciones potenciales y los experimentos son generalizados con implicaciones directas para las terapias que apuntan a reconectar neuronaL después del trauma o en enfermedades neurodegenerativas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) adulto pueden conducir a una discapacidad permanente debido a múltiples mecanismos que limitan el rebrote axonal 1 . Tras la lesión, muchos axones del SNC no forman un nuevo cono de crecimiento y no logran montar una respuesta regenerativa eficaz 2 . Además, el daño y el tejido cicatricial que rodea las lesiones del SNC inhiben significativamente el crecimiento axonal 1 , 2 , 3 . Las terapias actuales para promover la regeneración del SNC después de la lesión se han centrado en mejorar el potencial de crecimiento intrínseco de la neurona lesionada y en enmascarar los inhibidores de la extensión axonal asociados con restos de mielina y la cicatriz glial 1 , 3 . A pesar de esto, la capacidad de regenerar axones largos a objetivos distantes y formar sinapsis funcionales apropiadas permanece severamente limitada 4 , 5 , 6 , 7 .

En el presente trabajo, las microperlas, la micromanipulación con pipeta y los dispositivos microfluídicos se utilizan para iniciar, alargar y conectar con rapidez nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Trabajos previos han demostrado que las perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL-perlas) inducen adhesión a la membrana seguido de la agrupación de complejos de vesículas sinápticas y la formación de boutons presinápticos funcionales [ 8] . También se demostró que cuando el PDL-perla es mecánicamente retirado después de la diferenciación presináptica, el grupo de proteínas sinápticas sigue el cordón, el inicio de una nueva neurita [ 9] . El siguiente procedimiento explora este hecho junto con la capacidad de cultivar las neuronas del hipocampo embrionarias de ratas en regiones organizadas en un cubreobjetos usando dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) para volver a cablear precisamente una neuronacircuito.

Estos dispositivos microfluídicos PDMS son no tóxicos, ópticamente transparentes y consisten en dos cámaras conectadas por un sistema de microcanales. Una vez montados en un cubreobjetos, cada dispositivo sirve como molde para guiar el crecimiento neuronal y mantener cultivos neuronales sanos en patrones precisos durante más de 4 semanas in vitro .

Aquí, se presenta un marco en el que se investigan los límites de extensión y funcionalidad de la nueva neurita. Se crean neuritas nuevas y funcionales que se posicionan para controlar (re) alambre las redes neuronales. Las velocidades de extensión alcanzadas son más rápidas que 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica y se establecen conexiones funcionales. Estos resultados muestran, inesperadamente, que la capacidad intrínseca de estas neuritas para la elongación es mucho más rápida de lo que se pensaba anteriormente. Este enfoque mecánico propuesto ignora las estrategias químicas lentas y permite la conexión controlada a un objetivo específico. ThEs técnica abre nuevas vías para el estudio in vitro de nuevas terapias para restaurar la conectividad neuronal después de la lesión. También permite la manipulación y recableado de redes neuronales para investigar aspectos fundamentales del procesamiento de señales neuronales y la función neuronal in vitro .

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos detallados a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill y conformados con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

1. Estandarización de cultivos neuronales utilizando dispositivos microfluídicos: Montaje de dispositivos

  1. Seleccione un dispositivo microfluídico adecuado para el experimento deseado. Para conectar las neuronas dentro de la misma población, utilice los Neuro Devices ( Figura 1 ) y para conectar neuronas en diferentes poblaciones, use los Dispositivos de Co-Cultura ( Figura 6 ).
  2. Limpie y prepare el número deseado de cubreobjetos estériles o platos de fondo de vidrio. Para obtener los mejores resultados en superficies de plástico utilice platos de 35 mm, en el vidrio utilice cubreobjetos de 25 mm o platos de vidrio de 35 mm de fondo. Seleccione el grosor del vidrio según el sistema de imagen, por ejemplo 0,15 mm.
  3. Cubra los platos o cubreobjetos con 0,5-1 mL de PDL 100 μg / mL durante 2 h o durante la noche a temperatura ambienteAtura
    Nota: El protocolo se puede pausar aquí y reanudarse el día siguiente si se desea. Además, los platos pueden recubrirse con PDL diluida en tampón de borato, poli-L-lisina (PLL), laminina o cualquier otra molécula de adhesión celular.
  4. Lavar los platos dos veces con agua (no usar solución salina tamponada con fosfato (PBS) ya que los cristales de sal pueden bloquear los canales), quitar todo el líquido y dejarlo secar en un ambiente estéril como un gabinete de bioseguridad durante 5-10 min o hasta La superficie está completamente seca.
    Nota: Tenga cuidado de asegurarse de que los cubreobjetos estén absolutamente secos, ya que cualquier líquido restante interferirá con la adherencia de los sistemas microfluídicos.
  5. Coloque los dispositivos microfluídicos con los patrones hacia arriba bajo luz UV en un ambiente estéril (gabinete de bioseguridad) durante 10 min. Asegúrese de seguir los procedimientos estériles cuando trabaje en el gabinete de bioseguridad 10 .
  6. Usando pinzas colocar un dispositivo microfluídico con el patrón hacia abajo en contacto con la cubierta limpiaIp / plato. Utilice las pinzas para presionar suavemente el dispositivo para que se adhiera al cristal.
    Nota: La transparencia de la zona adherida será visible al mirar contra la luz. Asegúrese de que todas las esquinas estén en contacto con el cristal. Haga esto a todos los dispositivos microfluídicos. Véase la Figura 1a .
  7. Para llenar el dispositivo de población única con medio, dirija la pipeta hacia los canales y añada 50 μl de medio celular completo suplementado con B-27 libre de suero (relación de volumen 1:50) y 500 μg / mL de penicilina / estreptomicina / glutamina Llamado NBM) en el pocillo superior derecho, y luego añadir otros 50 μL al pozo que se encuentra diagonalmente a él. Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, añadir 50 μL de medio a los 2 pocillos restantes. Véase la figura 2a .
    1. Para llenar el dispositivo de población múltiple con medio, apunte la pipeta hacia los canales y añada 30 μLDe NBM completo a los pozos derechos, consulte la Figura 6a . Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, añadir 50 μL de medio a los 4 pocillos restantes.
  8. Coloque los aparatos en una placa más grande con un plato abierto con agua en autoclave (cámara húmeda) y colóquelo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad) durante 1-2 horas mientras se prepara el cultivo celular. Véase la figura 2b .

2. Colocación de neuronas en sistemas microfluídicos

  1. Siguiendo el protocolo descrito en la Ref. 8 , se obtienen neuronas hipocampales o corticales disociadas de embriones de rata Sprague Dawley (ambos géneros).
  2. Resuspender las neuronas embrionarias en NBM a una concentración de 1-2 millones de neuronas / mL. Verificar las concentraciones celulares en el microscopio utilizando un hemocitómetro y la siguiente referencia 8 . Ajustar la concentración celular segúnG a la densidad celular deseada. Para aumentar las posibilidades de obtener solo axones del hipocampo por canal, la placa de 10.000 neuronas por dispositivo. Para tener axones múltiples en el mismo canal, plancha 60.000 neuronas por dispositivo.
    Nota: Estos números varían según el tipo neuronal utilizado.
  3. Retire el medio de los dispositivos microfluídicos sin vaciar los pocillos. Deje aproximadamente 5 μl en cada uno.
  4. Para colocar las células en el dispositivo de población única, añada 50 μl de NBM al pocillo inferior derecho. En este punto el medio fluye por sí mismo para llenar el otro pozo inferior. Añadir 20 μl de la solución de células concentradas en el pozo superior derecho del dispositivo microfluídico, como se indica en la Figura 1b .
    1. Para placas de células en el dispositivo de población múltiple añadir 20 μ l de la solución de células de concentrado en cada uno de los pozos de la derecha en la Figura 6a .
  5. Verifique en el microscopio si las célulasEstán dentro de las cámaras y colocan los dispositivos en la incubadora durante 15-30 minutos para promover la unión de células al sustrato.
  6. Verifique en el microscopio si hay suficientes células en las cámaras. Si se necesitan más, repita los pasos 2.4 y 2.5.
  7. Añadir 50 μL de NBM a los 2 pozos superiores del dispositivo de población única y 20 μL de NBM en el mismo pozo, ya que las células se inyectaron en el dispositivo de población múltiple. Los medios sobresalen ligeramente para formar un menisco positivo que da a los pocillos un aspecto superior del mollete. Una vez más, vea la Figura 2a .
  8. Mantener las células a 37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad.

3. Mantenimiento de las culturas neuronales

  1. Retire NBM (aproximadamente 30 μL con una pipeta) de las células y aplique nuevo NBM precalentado al día siguiente de su introducción a los dispositivos (es decir, 1 d después del paso 2).
  2. Compruebe cada 2 días si hay suficiente medio en cada canal. Si el muffin tOp es baja sólo agregue más medio a los pozos superiores.
  3. Células de cultivo durante al menos 7 d antes de la eliminación de los dispositivos microfluídicos. Las células pueden sobrevivir en estos dispositivos durante varias semanas. Retire los dispositivos 1-2 días antes de que los experimentos se realicen en muestras.

4. Eliminación de dispositivos microfluídicos

  1. 1 - 2 d antes de la eliminación de los dispositivos microfluídicos, añadir 2 mL de NBM precalentado a 37 ° C a cada plato de muestra, inundando las cámaras, y mantener los dispositivos en la incubadora.
  2. Utilice pinzas estériles y una punta para quitar los dispositivos microfluídicos de los cubreobjetos dejando una configuración modelada de las neuronas. Utilice la punta para sujetar el cubreobjetos en su lugar y las pinzas para sujetar el borde del dispositivo en la esquina inferior izquierda del pozo. Aplicar delicadamente la torsión, levantando el dispositivo con las pinzas para que se despegue de la cubreobjetos. Vea la Figura 2c - 2d .
  3. Cada 2-3 días, reemplazar haSi se utiliza el NBM hasta que la muestra se utilice para experimentos.
  4. Antes de realizar experimentos de cableado en la muestra, verifique que las neuritas en los canales de dispositivo de población única y las poblaciones neuronales en el dispositivo de población múltiple se aíslan examinando los vacíos entre ellos en el microscopio para asegurar que no hay filamentos que enlazan poblaciones neuronales.

5. Preparación de perlas recubiertas de PDL

  1. Añadir 2 x 50 μL gotas de 4, 10 o 20 μm de bolitas de poliestireno diluidas en agua (1: 500) a 1 mL de PDL (100 μg / mL). Dejar por lo menos 2 h a temperatura ambiente.
    Nota: El protocolo puede pausarse aquí y reanudarse al día siguiente.
  2. Centrifugar la solución a 8,820 xg durante 1 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas acumuladas en el fondo del recipiente.
  3. Lavar las perlas dos veces con 1 ml de solución HEPES 10 mM estéril pH 8,4.
  4. Resuspender las perlas recubiertas de PDL en 200 ml de HEPES 10 mM pH 8,4solución.

6. Preparación de Micropipetas

  1. Prepare pipetas de tubos capilares de vidrio (diámetro interno de 1 mm, diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un extractor de electrodos horizontal. Ajustar los ajustes para que la punta exterior de la micropipeta extraída sea ~ 2-5 μm. Antes de tirar, asegúrese de que los tubos de vidrio estén limpios.
  2. Fije las pipetas a los portaobjetos de vidrio para el almacenamiento y asegúrese de que la punta no entre en contacto con la superficie del portaobjetos, ya que la punta es frágil. Guarde a temperatura ambiente en un recipiente cubierto para protegerlo del polvo. Utilice las pipetas el mismo día en que son tiradas.

7. Adherencia de PDL-gránulo a neuronas

  1. Añadir 40-60 μL de perlas recubiertas con PDL preparadas en el paso 5 a un cultivo celular preparado en el paso 4. Centrar la punta de la pipeta sobre las neuronas, que son débilmente visibles en la cubreobjetos, y añadir las perlas.
  2. Devolver la muestra a la incubadora durante 1 h para promover la formación de syContactos nápticos 8 , 9 .
  3. Después de la incubación, retire las perlas no adheridas lavando suavemente el cultivo con NBM previamente calentado.

8. Preparación de una solución fisiológica salina (para experimentos con temperatura ambiente)

  1. Preparar solución fisiológica salina mediante la combinación de los ingredientes enumerados en las referencias 7 , 8 . Esto es para regular el ambiente celular fuera de la incubadora.
  2. Verificar la osmolaridad y los niveles de pH como se indica en las referencias 7 , 8 .
  3. Infundir continuamente la solución con O 2 para minimizar las fluctuaciones del pH mientras se realizan experimentos.
  4. Calentar a temperatura ambiente.
  5. Instalar el sistema de perfusión mediante la inserción de un extremo de un tubo de plástico (dimensiones opcionales) en solución fisiológica infundida con O 2 y fijar el otroNd a una aguja insertada en el soporte de muestras. Coloque el tubo y la solución por encima de la muestra (vea la Figura 4 ).
    1. Desconecte el tubo de la aguja y conéctelo a una jeringa. Utilice la jeringa para ejercer presión y extraer líquido, llenando el tubo. Selle con una abrazadera de rodillo y vuelva a conectar la aguja.

9. Micromanipulación del grano

  1. Instale la muestra en una instalación experimental de tal manera que las células se puedan acceder desde arriba por dos micropipetas montadas en micromanipuladores y se accede ópticamente por debajo, por ejemplo con el objetivo de fase 40X (apertura numérica de 0,6) de un microscopio óptico invertido. En esta configuración, montar una cámara CCD para la captura de imágenes en el puerto lateral del microscopio. Conecte cada pipeta a jeringas de 1 ml a través de tubos de plástico. En este paso, reemplace NBM con solución salina fisiológica (1-2 mL) (Ver Figura 4 ).
  2. Durante experi, Perfundir continuamente las células con la solución salina fisiológica preparada en la etapa 8 a una velocidad de 0,5-1 ml / min.
  3. Seleccione un talón PDL NO conectado a una neurona en el campo de visión. Alinee el cordón con una punta de micropipeta enfocándola sobre el talón y luego hacia arriba hasta la micropipeta. Lleve la punta hacia abajo lo más cerca posible de la cuenta mediante la supervisión a través del microscopio.
  4. Aplique presión negativa con la jeringa de 1 ml conectada a la pipeta para recoger el cordón. Mantener la presión negativa durante todo el experimento.

10. Tirando Neuritos

  1. Seleccione un talón PDL unido a una neurona en el campo de visión y adjúntelo a la segunda micropipeta utilizando succión como se describe en los pasos 9.3-9.4.
  2. Tire del complejo PDL-perla-neurona lentamente (~ 0,5 μm / min) moviendo el micromanipulador o la etapa de muestra por 1 μm y haga una pausa de 5 min para permitir la iniciación de la neurita.
  3. Repita el paso 10.2 dos veces.
    Nota: Los primeros 3 &# 181; m tiene que ser jalado muy lentamente para garantizar el éxito experimental, que ocurre sobre el 95% del tiempo.
  4. Tire del complejo PDL-perla-neurona lentamente (~ 0,5 μm / min) moviendo el micromanipulador o la etapa de la muestra en 2 μm y haga una pausa de 5 min para permitir el alargamiento de las neuritas.
  5. Después de la iniciación exitosa y la extensión de las neuritas para los primeros 5 μm, tire de la neurita a 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica.
    Nota: La tracción puede realizarse de forma continua o por etapas ya diferentes velocidades. Véase la Figura 5b- 5c .

11. Conexión de neuronas

  1. Seleccione una región rica en neuritas y baje el complejo PDL-bead-neurite para que físicamente se ponga en contacto con él. Utilice otras perlas para medir la altura de la punta sobre la superficie del cubreobjetos. Vea la Figura 5d .
  2. Dejar el complejo PDL-perla-neurita en contacto con la neurita diana mientras se manipula la segunda micropiPette Baje la segunda pipeta con la segunda perla de PDL encima de la neurita recién formada de aproximadamente 20 μm de la primera perla. Utilice el segundo talón de PDL para empujar el nuevo filamento de neurita hacia la célula objetivo.
  3. Mantenga ambas perlas en su lugar durante al menos 1 h. Comprobar la ausencia de hinchamiento focal, un engrosamiento de las neuritas en contacto con el cordón, con el microscopio [ 16] .
  4. Durante este tiempo, utilice la perfusión para cambiar lentamente el medio de la muestra de solución salina fisiológica a NBM equilibrado precalentado con CO 2 .
  5. Libere el cordón de la segunda pipeta liberando la succión. Si la nueva neurita permanece unida, libere el primer cordón también. Véase la figura 5e .
  6. Remueva suavemente la solución salina y reemplácelas con NBM (~ 2 mL).
  7. Cuidadosamente colocar la muestra de nuevo en la incubadora para fortalecer la conexión neuronal para futuros experimentos. Esta conexión es estable durante> 24 h 7 .

12. Verificación de la funcionalidad de la nueva conexión a través de grabaciones de parche de parche

  1. Siga las referencias 7 , 18 , 19 . Para montar una instalación de electrofisiología.
  2. Siga las referencias 7 . Para preparar los electrodos pre y postsinápticos.
  3. Reúna los datos de pinza de parche, siguiendo de nuevo las referencias 18 , 19 .
  4. Compare los resultados con las señales naturales 7 para determinar el tipo de conexión.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las neuronas del hipocampo de ratas embrionarias se cultivan en dispositivos microfluídicos para permitir el posicionamiento preciso de células, perlas de PDL y micromanipuladores. El primer paso es montar adecuadamente el dispositivo microfluídico en un cubreobjetos o plato de vidrio. Es esencial que el dispositivo microfluídico esté bien unido al sustrato para evitar que las células salgan de las cámaras y se muevan bajo las partes del dispositivo que deben sellarse (

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizando una micromanipulación estándar y dispositivos microfluídicos innovadores, se desarrolló una nueva técnica para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a grandes distancias. La micromanipulación con pipeta es una herramienta común en la mayoría de los laboratorios de neurociencia 4 , 13 . El verdadero desafío para lograr resultados reproducibles y confiables fue la estandarización de cultivos neuron...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La autora Margaret H Magdesian es la directora general de Ananda Devices que produce instrumentos utilizados en este artículo.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría dar las gracias a Yoichi Miyahara por muchas discusiones y puntos de vista útiles. MA y PG reconocen fondos del CRSNG.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dispositivos de cocultivoAnandaDisponible comercialmente en http://www.anandadevices.com
Neuro devicesDispositivos Ananda Disponiblecomercialmente en http://www.anandadevices.com
Nº 1 Cubreobjetos de vidrio Redondo de 25 mmWarner Instruments64-0705
Platos con fondo de vidrio de 35 mm #0, sin recubrimiento, irradiados con rayos gammaIncorporación de MatTexP35G-0-20-C
Placa de cultivo celular de 35 mm, no pirogénica, estérilCorning Inc430165
placa de Petri de 95 mm x 15 mm, tapa deslizante, poliestireno estérilFisherbrandFB0875714G
50 mL Tubos de centrífuga con graduaciones impresas y tapas planasVWR89039-656
Tubo cónico de polipropileno de 15 ml, estilo de 17 x 120 mm, no pirogénico,halcón estéril
Neurobasal Medium LifeTechnologies21103-049Solución extracelular
B-27 Suplemento (50X), sin sueroSuplemento B-27 (50X), sin suero17504044Solución extracelular
Penicilina, estreptomicina, glutaminaThermo Fisher Scientific 11995-065Solución extracelular
200 μ L pipetasVWR89079-458
2 - 20 μ L PipettorsPuntas Resistentes a Aerosoles2149P
BD Falcon 3mL Pipetas de Transferencia [No Estériles]BD Falcon357524
GlucosaGibco15023-021Solución Extracelular
HEPESSigma7365-45-9Solución Extracelular/Perlas
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Solución
ExtracelularKClSigma-Aldrich7447-40-7Solución extracelular
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Solución extracelular
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3Solución extracelular
#5 Pinzas Dumont Dumostar 11 cmWorld Precision Instruments500233
Herramientas de disecciónBraun, Aesculap
Hidrobromuro de poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407
Micropartículas a base de poliestireno, 10 μ mSigma-Aldrich72986
Tubos de borosilicato KingPrecision Glass, Inc.14696-2
Extractor de pipetas horizontalesMicromanipuladores Sutter InstrumentsBrown-Flaming P-97
, serie PCS-5000SD InstrumentsMC7600R
Jeringa de 1 mL Microscopioinvertido BD Luer-Lok309628
Olympus IX71
ObjetivoOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
Cámara CCDFotometría CascadaII: 512
Leibovitz's (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Rat Disection
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol redLife Technologies25300054Disección
de ratasDMEM (1x) Medio Eagle Modificado de Dulbecco [+4,5 g/L de D-glucosa, + L-glutamina, + 110 mg/L de piruvato de sodio]Life Technologies11995-065Disección de Ratas
HBSS (1x) Solución salina equilibrada de Hank [- Cloruro de calcio, - Cloruro de magnesio, - Sulfato de magnesio]Life Technologies14170-112Disección de ratas
Dispositivos 352097

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Dispositivos microflu dicosperlas recubiertas de PDLmicromanipulaci n con pipetaneuronas hipocampales de ratatasa de crecimiento neuronalcircuitos neuronales funcionalespatch clamp de c lula completareproducibilidad experimental

Artículos relacionados