Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador

Summary

Transporte iónico celular a menudo puede evaluarse mediante el control de pH intracelular (pH). Genéticamente codificada pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH intracelular en las células intactas. Este protocolo detalla la cuantificación de pH intracelular a través de celular ex vivo vivo-proyección de imagen de los túbulos de Malpighi de la Drosophila melanogaster con pHerry, un pseudo-radiométrica genéticamente codificada en indicador de pH.

Abstract

Transporte iónico epitelial es fundamental para la homeostasis de iones sistémica así como el mantenimiento de gradientes electroquímicos celulares esenciales. PH intracelular (pH) está influenciado por muchos transportadores de iones y así control de pH es una herramienta útil para evaluar la actividad de transportista. Moderno codificado genéticamente pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH en las células intactas a escala celular y subcelular. Este protocolo describe la cuantificación en tiempo real del pH celular Reglamento en túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster por ex vivo vivo-proyección de imagen de pHerry, un pseudo-radiométrica GEpHI con un pK_un adecuadas para el seguimiento de los cambios de pH en el citosol. Mosca adulta extraída MTs se componen de secciones morfológicamente y funcionalmente distintas de epitelios capa unicelular y pueden servir como un modelo accesible y genéticamente manejable para la investigación del transporte epitelial. GEpHIs ofrece varias ventajas sobre los convencionales tintes fluorescentes sensibles a pH y electrodos ion-selectivos. GEpHIs puede etiquetar poblaciones celulares distintas siempre elementos promotor apropiado están disponibles. Este etiquetado es particularmente útil en ex vivo, en vivoy en situ preparados, que son inherentemente heterogéneos. GEpHIs también permiten la cuantificación de pH_i en tejidos intactos en el tiempo sin necesidad de externalización de tratamiento o tejido tinte repetidas. El principal inconveniente de GEpHIs actual es la tendencia a agregar en inclusiones citosólicas en respuesta al daño tisular y construir sobre expresión. Estas deficiencias, sus soluciones y las ventajas inherentes de GEpHIs se demuestran en el presente Protocolo mediante la evaluación del transporte de protones (H⁺) basolateral en células principales y radiadas funcionalmente distintas de mosca extraído MTs. Las técnicas y análisis descritos son fácilmente adaptables a una amplia variedad de vertebrados e invertebrados preparados y la sofisticación del análisis puede ampliarse desde laboratorios a intrincados determinación del flujo de iones a través de transportadores específicos de enseñanza.

Introduction

El objetivo de este protocolo es describir cuantificación de pH intracelular (pH_i) utilizando un genéticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) y demostrar cómo este método puede utilizarse para evaluar transporte basolateral H⁺ un insecto modelo (D. melanogaster) estructura renal, los túbulos de Malpighi (TM). MTs sirven como los órganos excretores de la mosca de la fruta y son funcionalmente similares a la nefrona mamífera en varios aspectos clave¹. MTs se arreglan como 2 pares de túbulos (anteriores y posteriores) en el tórax y el abdomen de la mosca. El sola célula epitelial tubo de cada MT está compuesto po....

Protocol

Todos los pasos de este protocolo cumplen con las directrices de uso de animales de la Mayo Clinic (Rochester, MN).

1. cría de la mosca

1. Levante vuela y conjunto de cruces según estándar cría²⁹.
   Nota: La expresión del reportero fluorescente por el sistema de GAL4/UAS es proporcional a la temperatura y así cría de temperatura se puede ajustar para alterar el nivel de expresión. Mientras que niveles altos de expresión a menudo conducen a una mejor relación señal a ruido esta condición también está asociada con aumento citosólicas y organellar agregados cuando usando GFP a la fusión de la proteína fluorescen....

Results

Tejidos sanos y correcta identificación de los MTs anteriores son vitales para el éxito de este protocolo. Durante la disección, debe tenerse cuidado que no toque el MTs y a manija única por el uréter como agarre el MTs directamente conducirá a la rotura (Figura 4A– B). Cuando se barren MTs plana sobre la diapositiva, los túbulos se deben tocar lo menos posible y exceso movimiento evitado ya que esto puede dañar la capa epit.......

Discussion

El éxito de cuantificación de pH en Drosophila MTs depende totalmente de la salud de MTs extraídos y la calidad del montaje y la disección (Figura A – C). Así, la manipulación cuidadosa del tejido como descrito es indispensable. Diapositivas recién revestidos en PLL substancialmente ayuda MT de montaje ya que tienden a ser mucho más pegamento que las diapositivas que han sido expuestos previamente a solución. Montaje cuidadoso también ayuda en la id.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de poli-L-lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P4832	Tienda a 4 ° C, se puede reutilizar.
Sal sódica de nigericina	Sigma-Aldrich	N7143	PRECAUCIÓN: Manéjelo con guantes. Almacene como alícuotas de 20 mM de solución madre en DMSO a 4 & C.
Cubiertas adhesivas de la cámara de perfusión, tamaño del adhesivo 1 mm, diámetro de la cámara y veces; espesor 9 mm y veces; 0,9 mm, diámetro de los puertos 1,5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Se pueden sustituir según sea necesario para que coincida con el sistema de perfusión.
Sylgard 184 Kit de Elastómero de Silicona	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Disponible en múltiples proveedores.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Disponible de múltiples proveedores.
Sistema de perfusión abierto alimentado por gravedad con controlador de válvulas, colector 8 a 1 y reservadores	Bioscience Tools	PS-8S	Se puede utilizar cualquier sistema de perfusión comparable.
Regulador de flujo	Warner Instruments	64-0221	Se puede sustituir según sea necesario para que coincida con el sistema de perfusión.
Tienda de 21720024 Fisher Scientific Medium de Schneider			en 4 ° C en alícuotas estériles.
#5 Pinzas de acero inoxidable	Fine Science Tools	11252-20	Se pueden sustituir según la comodidad del experimentador.
35 x 10 mm Placa de Petri de poliestireno	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	La marca y el tamaño exactos no son importantes.
75 x 25 mm Portaobjetos de microscopio	Corning Life Sciences	2949-75X25	La marca exacta y el tamaño pueden variar siempre que los pocillos de perfusión sean compatibles.
Vidrio capilar de borosilicato filimentado, diámetro interior 1,5 mm, diámetro exterior 0,86 mm, espesor 0,32 mm	Warner Instruments	64-0796	No es necesario filimento, el vidrio se puede sustituir para que coincida con los tubos de perfusión y los pozos de perfusión.
Tubo Tygon, ID 1/16", OD 1/8", espesor 1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	Disponible en múltiples proveedores, se puede sustituir para que coincida con el sistema de perfusión.
Grasa de silicona al vacío	Sigma-Aldrich	Z273554	Disponible en varios proveedores.
Abrazadera de control de flujo de plástico	Fisher Scientific	05-869	Disponible en varios proveedores, no se requiere esterilidad
Varillas de vidrio, 5 mm de diámetro	delphiglass.com	9198	El tamaño exacto es preferencia personal, varios proveedores disponibles
Pluma hidrofóbica PAP	Sigma-Aldrich Z377821		Disponible en varios proveedores.
Película de sellado	Sigma-Aldrich	P7668	Disponible en varios proveedores.
Tubo Falcon de 15 mL	BD Falcon	352096	Disponible en varios proveedores.
Tubo Falcon de 50 mL	BD Falcon	352070	Disponible en varios proveedores.
HEPES; Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico	Sigma-Aldrich	H3375	Disponible en varios proveedores.
MES; Ácido 4-morfolineetanosulfónico monohidrato	Sigma-Aldrich	69892	Disponible en múltiples proveedores.
Grifos; Ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanosulfónico	Sigma-Aldrich	T5130	Disponible en varios proveedores.
10X/0.45 Objetivo de aire	Zeiss	000000-1063-139	Se pueden sustituir objetivos comparables. Los objetivos 40X se pueden utilizar para la obtención de imágenes de una sola célula.
Estereoscopio de disección	Zeiss	Discovery.V8	Se puede utilizar cualquier estereoscopio de disección.
Transgénico UAS-pHerry Drosophila melagnogaster	Disponible en Romero Lab		Primera publicación: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Disponible en Romero Lab		Primera publicación: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Disponible en Romero Lab		Primera publicación: Citation 2
Cámara digital monocromática de alta sensibilidad	Zeiss	Axiocam 506 mono	La marca y el modelo exactos pueden variar, se pueden reemplazar con cualquier cámara monocromática de alta sensibilidad adecuada para imágenes celulares en vivo.
Juego de filtros GFP/FITC, 470/40 nm ex., 515 nm paso largo em., 500 nm dicroico	Chroma	CZ909	Se puede sustituir cualquier juego de filtros GFP/FITC.
Juego de filtros RFP/TRITC, 546/10 nm ex., 590 nm em. de paso largo, 565 nm	Chroma	CZ915	Se puede sustituir cualquier juego de filtros GFP/FITC.
Microscopio epifluoescente invertido	Zeiss	Axio Observer Z.1	Se puede utilizar cualquier microscopio comparable con conmutación de filtro motorizado. Los microscopios verticales se pueden utilizar con baños de perfusión abiertos y objetivos de inmersión en agua.
Software de análisis estadístico	Microcal	Origin 6.0	Cualquier software con funcionalidad comparable puede ser sustituido
Software de análisis	de imágenes Institutos Nacionales de Salud	ImageJ 1.50i	Cualquier software con funcionalidad comparable puede ser sustituido
Software de adquisición de imágenes	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Cualquier software con funcionalidad comparable puede ser sustituido
Hoja de afeitar de acero al carbono de un solo filo	Ciencias de la microscopía electrónica	71960	Disponible de múltiples proveedores.
Carpeta de portaobjetos de microscopía	Fisher Scientific	16-04	Disponible en varios proveedores.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Disponible en múltiples proveedores.
Viales de cría de polistrene Drosophila con Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Se pueden sustituir artículos comparables.
Cubo de hielo de laboratorio de 2,5 L	Fisher Scientific	07-210-129	Disponible en varios proveedores.
NMDG; N-metil-D-glucamina	Sigma-Aldrich	M2004	Disponible en múltiples proveedores.
Puntas de pipeta barrera de 200 uL	MidSci	AV200	Disponible en varios proveedores.
200 μ L pipeta de volumen variable	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Disponible en varios proveedores.