Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia.
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Artículo de método
Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Aquí, introducimos un nuevo sistema para la inducción de hipoxia, que desarrollamos para estudiar los efectos de la hipoxia en organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema comprende una cámara con una instalación sencilla pero que es, sin embargo, robusta para inducir y mantener una concentración específica de oxígeno y temperatura en cualquier solución experimental de elección. El sistema presentado es muy rentable pero altamente funcional, permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia para experimentos directos in vivo y durante varios periodos de tiempo de hasta 48 h.
Para monitorear y estudiar los efectos de la hipoxia, se han empleado dos métodos - la medición de los niveles de hipoxia inducible factor 1alfa (HIF-1α) en embriones enteros o tejidos específicos y la determinación de la proliferación de células madre retinianas por 5-etinil-2'- Desoxiuridina (EdU) en el ADN. Los niveles de HIF-1 alpha pueden servir como un marcador general de hipoxia en todo el embrión o tejidoDe elección, aquí la retina embrionaria. La incorporación de EDU en las células proliferantes de la retina embrionaria es un resultado específico de la inducción de hipoxia. Por lo tanto, hemos demostrado que hypoxic progenitores de la retina embrionaria disminuir la proliferación dentro de 1 h de incubación en el 5% de oxígeno de la rana y el pez cebra embriones.
Una vez dominado, nuestro sistema se puede emplear para el uso con micro organismos acuáticos pequeños, para experimentos directos in vivo , en cualquier período de tiempo dado y bajo concentración de oxígeno normal, hipóxico o hiperóxico o bajo cualquier otra mezcla de gases dada.
Introducción
La investigación de la hipóxia tiene numerosas aplicaciones. Estos incluyen la investigación de la patogénesis y el desarrollo de tratamientos para condiciones médicas que se caracterizan por la hipoxia 1 y la enfermedad de alta altitud aguda 2 . El estrés hipóxico causa importantes cambios metabólicos en todos los organismos que requieren oxígeno. Estrés hipóxico también influye en el crecimiento fetal y el desarrollo y la patogénesis de varias enfermedades humanas, incluida la restricción de crecimiento intrauterino [ 3] . El estrés hipóxico puede no sólo conducir a la reducción del peso al nac....
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Protocolo
Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Cambridge.
1. Mantenimiento de animales
- Embriones de rana
NOTA: Los embriones pueden ser criados y mantenidos de acuerdo con las instalaciones del animal y del laboratorio. Aquí se describe un ejemplo del mantenimiento de los animales.- Preparar solución de solución de Barth (MBS) modificada 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 μM, NaHCO3 24 μM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 3,3 μM y CaCl2 4,1 μM, pH 7,6 .
- Obtener embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro.
- Inducir la ovulación en ran....
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Resultados
El empleo del sistema de cámara hipóxica que aquí se presenta permite estudiar los efectos de la hipoxia individualmente e in vivo en animales vivos enteros. La hipoxia puede ser inducida colocando embriones enteros de sapo o pez cebra en la cámara hipóxica ( Figura 1 ), y realizarse en diferentes combinaciones de condiciones. En la Figura 2 se muestra una imagen de nuestra instalación completa de la cámara de gas. Hemo.......
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Discusión
Aquí hemos presentado un nuevo pero fácil método robusto para inducir hipoxia que se ajusta para su uso con los embriones de sapo y pez cebra, pero también puede ser adecuado para otros organismos acuáticos. La principal ventaja de este método reside en su simplicidad y rentabilidad. Sin embargo, los resultados obtenidos con este método son muy robustos. Hemos demostrado que la hipoxia puede ser inducida eficientemente en la cámara tanto en embriones enteros como en tejido específico - aquí, retinas. Para determinar la .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Premio de Apoyo Wellcome Trust SIA 100329 / Z / 12 / Z a WAH y la beca de DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de sodio | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Medio embrionario, 10x TBST |
| Cloruro de potasio | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embrión mediu,Bicarbonato |
| de sodio | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x |
| MBS HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Sulfato de magnesio | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Medio embrionario |
| Nitrato de calcio | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Cloruro de calcio | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Medio embrionario |
| Azul de metileno | Sigma | M9140 | Medio embrionario |
| Yegua preñada gonadotropina sérica (PMSG) | Sigma | CG10 | Fertilización de ranas |
| Tanque de cría de pez cebra | Carolina | 161937 | Construcción de cámaras |
| de gas Placa de 24 pocillos | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, para la construcción de cámaras de gas |
| Resina epoxi | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Válvula distribuidora de gas | WPI Luer Valves Kit 14011 | Accesorio de tanque acuático (Esquema 1, H) | |
| Válvula de gas de alta precisión | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Accesorio de depósito de gas (Esquema 1, I) |
| 5% de oxígeno y 95% N2 depósito de gas | BOC | 226686-L | Mezcla de gases hipóxicos |
| difusor de disco cerámico | CO2 Art | Difusor de vidrio CO2 Nano Aquarium, DG005DG005 | Esquema 1, grasa J |
| silicona | Suministros de laboratorio científico | VAC1100 | Esquema 1, K |
| oxímetro | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Configuración de cámara hipóxica |
| sensor de oxígeno disuelto de fibra óptica | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Configuración de cámara hipóxica |
| pipeta pasteur de plástico | Sterilin | STS3855604D | para la transferencia de embriones |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Tampón anestésico para embriones |
| RIPA | Sigma | R0278-50ML | Homogeneización de tejidos |
| Inhibidor de la proteasa | Sigma | P8340 | Homogeneización de tejidos |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Tampón de carga Laemmli, 10x TBST |
| Glicerol | Sigma | G5516 | 4x Tampón de carga Laemmli |
| Sulfato de dodecilo de sodio (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Tampón de carga Laemmli, 5x Tampón de funcionamiento |
| beta-Mercaptoetanol | Sigma | M6250 | 4x Tampón de carga Laemmli |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Tampón de carga Laemmli |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Tampón de ejecución, Tampón de transferencia |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Tampón de ejecución, Tampón de transferencia |
| Metanol | Sigma | 34860 | Tampón de transferencia |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| Leche desnatada en polvo | Sigma | 70166 | Solución de bloqueo |
| Tubo | de microcentrífuga EppendorfHomogeneizador de tejidos Sigma | T9661 | |
| Motor de mortero de pellets Kontes | Z359971 | Morteros de pellets de homogeneización de tejidos | |
| Sigma | Z359947-100EA | Homogeneización de tejidos | |
| prefabricado 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| escalera de proteínas | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| membrana de nitrocelulosa (0,45 y micro; m) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1 y alfa; anticuerpo | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-&alfa;-tubulina | anticuerpo Sigma | T6074 | Western Blot |
| anticuerpo anti-conejo en cabra | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| anticuerpo anti-ratón en cabra | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Reactivo Pierce ECL 2 | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| Películas ECL Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, Incorporación de EdU |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| formaldehído | Thermo Scientific | 28908 | Solución de fijación |
| Sacarosa Fluka | S/8600/60 | Solución | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Suero de cabra inactivado por calor (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Solución de bloqueo (incorporación de EdU) |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporación |
| de dimetilsulfóxido (DMSO) | Sondas moleculares | C10338 | Incorporación de EdU |
| vial de vidrio | VWR | 98178853 | análisis de incorporación de EdU |
| Compuesto de temperatura de corte óptima Tissue-Plus | Scigen | 4563 | Medio de incrustación, EdU análisis de incorporación |
| criostato Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | análisis de incorporación de EdU |
| portaobjetos de microscopio Super-Frost plus Menzel | vidrio Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU análisis de incorporación |
| EdU kit de química Click-iT Sondas | moleculares | C10338 | Análisis de incorporación de EdU |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Medio de montaje, cubreobjetos de análisis de incorporación |
| EdU | VWR | ECN631-1575 | EdU análisis de incorporación |
| microscopio fluorescente | Nikon | Eclipse 80i | EdU análisis de incorporación |
| microscopio de barrido confocal | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU análisis de incorporación |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU análisis de incorporación |
Referencias
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203(2007).
- Grant, S., et al.
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Reimpresiones y permisos
