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Artículo de método

Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón

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DOI:

10.3791/55715

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17 de mayo de 2017

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para aislar y cultivar rudimentos metanefricos de embriones de ratón.

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección, aislamiento y cultivo de rutinas metanefricas de ratón.

Durante el desarrollo del riñón de los mamíferos, los dos tejidos progenitores, el brote ureteral y el mesénquima metanéfrico, se comunican y inducen recíprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente el sistema colector y los nefrones del riñón. A medida que los embriones de mamíferos crecen intrauterinos y por lo tanto son inaccesibles para el observador, se ha desarrollado un cultivo de órganos. Con este método, es posible estudiar las interacciones epiteliales-mesenquimales y el comportamiento celular durante la organogénesis renal. Además, se puede investigar el origen de las malformaciones congénitas del riñón y del tracto urogenital. Después de una disección cuidadosa, los rudimentos metanefricos se transfieren a un filtro que flota sobre el medio de cultivo y puede mantenerse en una incubadora de cultivo celular durante varios días. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las condiciones sonArtificial y podría influir en el metabolismo en el tejido. Además, la penetración de sustancias de ensayo podría estar limitada debido a la matriz extracelular y la membrana basal presentes en el explante.

Una ventaja principal de la cultura de órganos es que el experimentador puede obtener acceso directo al órgano. Esta tecnología es barata, sencilla y permite un gran número de modificaciones, como la adición de sustancias biológicamente activas, el estudio de variantes genéticas y la aplicación de técnicas de imagen avanzada.

Introducción

El riñón de los mamíferos se deriva de dos estructuras primordiales de origen mesodérmico: la yema ureteral epitelial tubular y el mesénquima metanéfrico. Durante la nefrogénesis, la yema ureteral invade el mesénquima metanéfrico y se ramifica para formar el sistema colector. El mesénquima metanéfrico da lugar a los elementos epiteliales de las nefronas. Estos procesos ocurren de una manera precisa y coordinada espacialmente y se inician mediante mecanismos inductivos recíprocos. Ambos componentes del tejido se comunican y afectan a la morfogénesis celular del otro.

En la década de 1920, fue Boyden quien realizó la obstrucción in vivo del conducto mesonéfrico en pollos, proporcionando la primera indicación de interacciones inductivas como blastema nefrrico separado que no logra diferenciarse1. Casi al mismo tiempo, se publicaron los primeros intentos exitosos de cultivar rudimentos nefráticos de pollo en una gota colgante. Posteriormente, se desarrolló el cultivo de órganos para estudiar las interacciones de los tejidos en la organogénesis de los mamíferos. En la década de 1950, Grobstein desarrolló una técnica en la que los rudimentos metanefricos podían cultivarse en un filtro. Esta técnica fue modificada por Saxén, quien colocó el filtro en una pantalla tipo Trowell en un plato de cultivo1. A lo largo de los años, han surgido muchas modificaciones y aplicaciones para el cultivo de órganos. El método descrito aquí se basa en la técnica de Saxén, pero se simplifica, ya que los filtros flotan libremente en el medio y el diámetro del pozo de cultivo solo supera ligeramente el diámetro del filtro, lo que limita el movimiento no deseado del filtro.

El cultivo de órganos enteros es una herramienta clásica, barata y simple pero poderosa para investigar los procesos celulares y la comunicación intercelular durante la organogénesis. El cultivo de órganos permite el tratamiento con agentes biológicos, como factores de crecimiento, anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, virus y péptidos, así como con compuestos farmacéuticos y otros productos químicos. Además, la función de los genes puede estudiarse utilizando explantes derivados de ratones modificados genéticamente o utilizando tecnología de inactivación de genes inducibles, como el sistema Cre-loxP. Esto permite el estudio de las mutaciones genéticas que causan la letalidad embrionaria antes del desarrollo del riñón. El cultivo de órganos también puede combinarse con el marcaje fluorescente para la función de los genes o el rastreo de linajes y con técnicas modernas de imagen, que permiten el seguimiento en tiempo real del comportamiento de las células2.

En el ejemplo específico proporcionado aquí, se investigó el efecto de la señalización del receptor Eph activado por EphrinB2 en la morfología ramificada de la yema ureteral. La morfología de los ratones EphA4/EphB2 de doble knock-out sugería varios defectos graves en el desarrollo del riñón, que eran detectables ya en el día embrionario 11 (E11) e involucraban la yema ureteral, el uréter y el conducto nefrático común3. La señalización a través de los receptores Eph requiere la agrupación del ligando-receptor dímero4. Para sobreactivar la señalización de Eph, se cultivaron los rudimentos renales de embriones de ratón E11.5 en presencia de EphrinB2-Fc recombinante agrupada. EphrinB2 es un ligando conocido para el receptor EphA4, que se expresa en las puntas ureterales de las yemas3.

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Protocolo

Los ratones se mantuvieron de acuerdo con la normativa sueca y la legislación de la Unión Europea (2010/63 / UE). Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las directrices del Comité Sueco de Ética (permisos C79 / 9, C248 / 11, y C135 / 14). El Regierungspräsidium Karlsruhe y los Oficiales de Bienestar Animal de la Universidad de Heidelberg han aprobado procedimientos en la Universidad de Heidelberg sobre animales.

1. Preparación de reactivos y materiales para la cultura

NOTA: Use una campana de flujo laminar para minimizar la contaminación.

  1. En el día de la disección, la Fc humana previa a la agrupación o la proteína de efrina quimérica recombinante se fusionaron a Fc humano mezclándola con anticuerpos de cabra Fc antihumanos en una proporción molar de 1: 5 en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Incubar durante 1 h a 37 ° C 5 .
  2. Preparar el medio de cultivo suplementando Dulbecco's Modified Eagle Medium: NutrientMezcla F-12 (DMEM / F12) con 1% de penicilina / estreptomicina (v / v), 1% de glutamina (v / v), 1% de insulina-transferrina-selenio (v / v) Transferrina y 1,5 μg / ml de anfotericina.
    NOTA: 10 ml de medio son suficientes para 16 embriones.
  3. Añada una solución concentrada de efrina recombinante a una concentración final de 20 μg / ml al medio de cultivo. Utilice Fc humano agrupado como control.
  4. Preparar las placas de cultivo añadiendo 500 μl de medio de cultivo a cada pocillo de una placa estéril de 4 pocillos de poliestireno de fondo plano sin recubrimiento.
  5. Usando fórceps estériles, coloque cuidadosamente un filtro de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 5 μm por pocillo en la parte superior del medio. Transferir la placa preparada a la incubadora (37 ° C / 5% CO 2 ). Asegúrese de que el filtro permanezca seco en la superficie superior y flote.
    NOTA: Un filtro es suficiente para dos anlagen de riñón.
  6. Utilizando una cuchilla de afeitar, corte aproximadamente 30 puntas de pipeta (volumen: 100 μl) aprox.Y 1 mm de la punta para dar lugar a una abertura más amplia. Coloque las puntas de nuevo en un rack pipette-tip.

2. Disección de Rudimentos Metanefricos en E11.5

  1. Sacrifique a un ratón embarazado cronometrado en E11.5 por dislocación cervical (o usando un método aprobado por el comité de ética local).
  2. Retirar el útero y los embriones, según lo descrito por Brown et al 6 . A partir de este punto, trabajar bajo un microscopio de disección.
  3. Usando la pinza de relojería No. 5, corte el embrión directamente debajo de las patas delanteras. Utilice un plato de petri fresco para cada embrión. Quitar las piernas y la cola del embrión. Para ello, agarra el tejido que se va a quitar con un par de fórceps relojero nº 5 y usa las puntas de un segundo par para cortar.
  4. Para retirar la masa del órgano ventral, use las puntas de un par de pinzas para abrir lateralmente la pared del cuerpo del embrión en una dirección rostral a caudal.
    1. Corte superficialmente, paralelo a tLa aorta dorsal. Utilice la aorta dorsal llena de sangre y por lo tanto visible para la orientación. Separar cuidadosamente la parte ventral de la pared del cuerpo de la parte dorsal usando las puntas de la pinza cerrada y voltear el embrión. Corte la pared del cuerpo lateralmente en una dirección rostral a caudal y usando la aorta dorsal para la orientación, como para el lado anterior.
  5. Una vez que la pared del cuerpo ventral se ha separado del cuerpo dorsal, agárralo con un par de fórceps y tire con cuidado para quitarlo, junto con la masa del órgano.
    NOTA: El metanéfrico anlagen suele permanecer unido a la pared del cuerpo dorsal. Son estructuras ovales de ~ 200 μm de largo situadas al nivel de las extremidades posteriores.
  6. Sujete la pared del cuerpo dorsal con un par de fórceps, con el lado ventral hacia arriba. Utilizando el otro par de pinzas, agarrar la aorta dorsal en su extremo rostral y cuidadosamente pelar la aorta dorsal de la pared del cuerpo dorsal.
    NOTA: Ambos riñones metanefricos generalmente se mantienen unidosA la aorta dorsal.
  7. Usando un par de fórceps, corte rostralmente al riñón anlagen para eliminar la aorta. Luego, cuidadosamente separar los dos anlagen renal utilizando las puntas de la pinza.
  8. Cuidadosamente quitar el tejido no deseado del riñón anlagen con las puntas de la pinza. Tenga cuidado de no dañar el mesénquima, ya que el daño puede resultar en un pobre crecimiento y la exclusión del explante de un análisis posterior.
  9. Transferir el anlagen renal por separado con una pipeta de microlitros y una punta de pipeta abierta en 10 μL de PBS al filtro de membrana de policarbonato en una placa de 4 pocillos.
    NOTA: Debido a la tensión superficial, el explante se cubrirá con una fina capa de medio. Un filtro es suficiente para dos anlagen renal.
    1. Coloque cada uno de los dos anlagen renal en el centro de cada mitad respectiva del filtro. Transferir la placa de nuevo a la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 . Dejar la placa en la incubadora hasta que el ron metanefricImentes del siguiente embrión están listos para ser colocados en el filtro.
  10. Repita los pasos 2.3-2.9.1 para cada embrión.
    NOTA: Con cierta práctica, el procedimiento de disección tomará aproximadamente 5 min por embrión.
  11. Incubar el riñón anlagen durante 3 días a 37 ° C / 5% de CO 2 .

3. Preparación de reactivos para fijación y tinción

  1. Para preparar paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS sin calcio y magnesio (p / v), disolver el PFA a 60 ° C en PBS, agitando continuamente. Enfriar a temperatura ambiente y utilizar un filtro de papel para eliminar las partículas restantes. Alícuota y mantener a 4 ° C para su uso inmediato o congelar para el almacenamiento a largo plazo.
    PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica. Use el equipo de protección personal especificado en las normas de seguridad locales y trabaje en una campana extractora de humos. Deseche los desechos siguiendo las pautas institucionales y usando contenedores de desecho designados.
  2. Para preparar la solución de permeabilización, diluir Triton X-100En PBS sin calcio y magnesio hasta 0,3% (v / v).
  3. Para preparar la solución de bloqueo, añadir 5% (v / v) de suero de cabra y 0,1% Triton X-100 a PBS sin calcio y magnesio. Añadir azida sódica hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Almacenar a 4 ° C.
    PRECAUCIÓN: La azida sódica es tóxica. Manipular la azida sódica de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente.
    NOTA: Cuando se usan anticuerpos para la tinción, use suero al 5% de la especie de la que se derivó el anticuerpo secundario para hacer la solución de bloqueo.
  4. Diluir la aglutinina de Dolichorus biflorus biotinilada 1: 200 en solución de bloqueo. Diluir Alexa488-streptavidin conjugado 1: 200 en solución de bloqueo.
  5. Para preparar un medio de incrustación listo para usar (véase la tabla de materiales), añadir 0,1 g de mucoadhesivo / ml a base de alcohol polivinílico soluble en agua a glicerol al 25% (p / v) en Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Calentar a 50 ° C bajo agitación continua durante 1 h, enfriar y ajustar el pH a 8,0-8,5 usando 1M de NaOH. Evitar mayores concentraciones de NaOH. Añadir 100 μg / ml de N-propilgalato y timerosal hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El timerosal es tóxico. Manipularlo de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente.
    1. Llenar el medio de inclusión en tubos de 50 ml, equilibrar el rotor y centrifugar a 3.200 xg ya temperatura ambiente durante 10 min. Decantar la solución transparente en tubos de 15 mL y desechar el gránulo. Alícuota y almacenar a -20 ° C durante varias semanas. Una vez descongelado, mantener la solución a 4 ° C. Caliente a ~ 30 ° C inmediatamente antes de usar.
  6. Prepare tantos portaobjetos de vidrio como los filtros con explantes deben montarse. Para ello, pegue dos pequeños cubreobjetos, 18 x 18 mm, a cada lado de la diapositiva de vidrio con adhesivo instantáneo, Deje un espacio de ~ 15 mm para el filtro entre.

4. Fijación y tinción

  1. Después de un período de cultivo de 3Días in vitro (div), retirar las placas de la incubadora y aspirar cuidadosamente el medio de cultivo de cada pocillo usando una micropipeta. Asegúrese de no tocar el filtro y mantenga la punta abierta hacia la pared del pozo.
  2. Añadir 500 μl de PFA al 4% / PBS a cada pocillo. Los filtros flotarán sobre el fijador. Usando una micropipeta, agregue cuidadosamente el fijador PFA gota a gota para sumergir los filtros. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    NOTA: Para todos los pasos siguientes, se debe tener cuidado de no lavar los explantes del filtro. Mantenga la abertura de la punta de la pipeta hacia la pared del pozo.
  3. Retire el PFA y enjuague dos veces con 500 μl de PBS, sumergiendo el filtro. Añadir 500 μl de solución de permeabilización a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Enjuagar dos veces con 500 μL de PBS y añadir 500 μL de solución de bloqueo a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Reemplace la solución de bloqueo por250 μl de aglutinina biotinilada Dolichorus biflorus diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h.
  6. Retire la solución de aglutinina de Dolichorus biflorus y enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo.
  7. Añadir 250 μL de estreptavidina conjugada con Alexa488 diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h. Alternativamente, incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: Se consigue una mejor relación señal / ruido cuando se incuba a 4 ° C.
  8. Enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo. Usando fórceps, transfiera los filtros a las diapositivas de vidrio preparadas, con los explantes hacia arriba. Montar con ~ 50-100 μl de medio de incrustación. Cubrir con cubreobjetos No. 1.5 de 60 mm de largo. Dejar que la solución del medio de incrustación se solidifique durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Proceda a la formación de imágenes o almacene las diapositivas, envueltas en papel de aluminio, a 4 ° C hasta que esté listo para la imagen.
  9. Imagen con un microscopio de epifluorescencia de campo ancho 7 </ Sup> acoplado a una lámpara de Hg y utilizar una unidad de espejo para la excitación azul (paso de banda de excitación, 460 - 495 nm, espejo dicromático, 505 nm y paso de banda de emisión, 510 - 550 nm) y 20X Plan - Apochromat, 0,75 numérico abertura.

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Resultados

El anlagen renal metanéfrico se obtuvo a partir de ratones endocrinos Black-6 preñados a E11.5 y se cultivaron. Después de 3 días, la yema ureterica se había ramificado hasta 5 veces, dando como resultado una ramificación de la yema ureterica inicialmente en forma de T. Se fotografió cada explante y se cuantificaron los números de segmentos y puntos finales para determinar las generaciones de ramificación y para calcular el número de puntos finales por rama ( Figura 1 )....

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Discusión

Este manuscrito describe un método para aislar el desarrollo de metanfric anlagen del embrión de ratón y para cultivar los órganos rudiments. Este método es una técnica estándar, desarrollada por Grobstein 8 y Saxén 9 , 10 , y fue adaptada y modificada por muchos otros 11 , 12 . El éxito del método depende principalmente de la duración de la disección, ya que la supervivencia del ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Leif Oxburgh y Derek Adams por compartir generosamente sus conocimientos, Leif Oxburgh por los útiles comentarios sobre el manuscrito, y Stefan Wölfl y Ulrike Müller por su apoyo técnico y Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer y Viola Mayer por su ayuda en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado por Desarrollo, La Empresa de Biólogos (a CP).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21331020
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140148
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific 35050061
DPBS, calcio, magnesioThermo Fisher Scientific14040117uso para la disección
holo-Transferrina humanaSigma-AldrichT0665
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100x)Thermo Fisher Scientific41400045
ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127
Solución de anfotericina BSigma-AldrichA2942
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Azida sódicaSigma-AldrichS8032
TimerosalSigma-AldrichT5125
Galato de propiloSigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
GlicerolSigma-AldrichG5516
Biotinilado Dolichorus Biflorus AglutininaVector LaboratoriosB-1035
Alexa488 estreptavidina conjugadaJackson Immuno Research016-540-084
Efrina-B2 de ratón recombinante Fc Chimera Protein, CFR& D Systems496-EB
IgG1 Humana Recombinante Fc, CFR& D Systems110-HG-100
Cabra Anti-Humano IgG Fc AnticuerpoR& D SystemsG-102-C
Comprimidos de solución salina tamponada con fosfatoSigma-AldrichP4417uso para la fijación e inmunotinción
Dumont #5, puntas biologie
, INOX, 11 cm		agnthos.se0208-5-PSSe necesitan 2 pares de pinzas
Tijeras de iris, rectas, 12 cmagnthos.se03-320-120
Pinzas de vendaje,
rectas, delicadas, 13 cm		agnthos.se08-032-130
Placas de Petri Nunclo Delta tratadasThermo Fisher Scientific150679
TMTP01300 Filtro de membrana de isoporo, policarbonato, hidrófilo, 5.0 y micro; m, 13 mm, blanco, lisoMerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multiplatos
4 pocillos, fondo plano		Sigma-AldrichD6789-1CS
Cubreobjetos de microscopio de 24 x 50 mm de espesor. No.1.5H 0.17+/-0.005 mmnordicbiolabs107222
Cubreobjetos No.1.5, 18 mm x 18 mmnordicbiolabs102032
Portaobjetos ~76 x 26 x 1, 1/2 W. suelo lisonordicbiolabs1030418
Cuchillas de afeitar VWRVWR 55411-055
Tubos de centrífuga de 50 ml Sigma-AldrichCLS430828
tubos de centrífuga de 15 mlSigma-AldrichCLS430055
Whatman papel de filtro cualitativo prepleado, Grado 113V, crepadoSigma-AldrichWHA1213125
Mircoscopio de investigación de platina fijaOlympusBX61WI
Negro 6 ratones endogámicos, machos, C57BL/6NTacTaconicB6-M
Negro 6 ratones endogámicos, hembras, C57BL/6NTacTaconicB6-F
Microscopio estereoscópico GreenoughLeica LeicaS6 E

Referencias

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  5. Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
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  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
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  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
  11. Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
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  15. Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550(2010).
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