Este protocolo describe un método para aislar y cultivar rudimentos metanefricos de embriones de ratón.
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Artículo de método
Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección, aislamiento y cultivo de rutinas metanefricas de ratón.
Durante el desarrollo del riñón de los mamíferos, los dos tejidos progenitores, el brote ureteral y el mesénquima metanéfrico, se comunican y inducen recíprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente el sistema colector y los nefrones del riñón. A medida que los embriones de mamíferos crecen intrauterinos y por lo tanto son inaccesibles para el observador, se ha desarrollado un cultivo de órganos. Con este método, es posible estudiar las interacciones epiteliales-mesenquimales y el comportamiento celular durante la organogénesis renal. Además, se puede investigar el origen de las malformaciones congénitas del riñón y del tracto urogenital. Después de una disección cuidadosa, los rudimentos metanefricos se transfieren a un filtro que flota sobre el medio de cultivo y puede mantenerse en una incubadora de cultivo celular durante varios días. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las condiciones sonArtificial y podría influir en el metabolismo en el tejido. Además, la penetración de sustancias de ensayo podría estar limitada debido a la matriz extracelular y la membrana basal presentes en el explante.
Una ventaja principal de la cultura de órganos es que el experimentador puede obtener acceso directo al órgano. Esta tecnología es barata, sencilla y permite un gran número de modificaciones, como la adición de sustancias biológicamente activas, el estudio de variantes genéticas y la aplicación de técnicas de imagen avanzada.
Introducción
El riñón de los mamíferos se deriva de dos estructuras primordiales de origen mesodérmico: la yema ureteral epitelial tubular y el mesénquima metanéfrico. Durante la nefrogénesis, la yema ureteral invade el mesénquima metanéfrico y se ramifica para formar el sistema colector. El mesénquima metanéfrico da lugar a los elementos epiteliales de las nefronas. Estos procesos ocurren de una manera precisa y coordinada espacialmente y se inician mediante mecanismos inductivos recíprocos. Ambos componentes del tejido se comunican y afectan a la morfogénesis celular del otro.
En la década de 1920, fue Boyden quien realizó la obstrucción in vivo<....
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Protocolo
Los ratones se mantuvieron de acuerdo con la normativa sueca y la legislación de la Unión Europea (2010/63 / UE). Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las directrices del Comité Sueco de Ética (permisos C79 / 9, C248 / 11, y C135 / 14). El Regierungspräsidium Karlsruhe y los Oficiales de Bienestar Animal de la Universidad de Heidelberg han aprobado procedimientos en la Universidad de Heidelberg sobre animales.
1. Preparación de reactivos y materiales para la cultura
NOTA: Use una campana de flujo laminar para minimizar la contaminación.
- En el día de la disección, la Fc humana previa a la....
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Resultados
El anlagen renal metanéfrico se obtuvo a partir de ratones endocrinos Black-6 preñados a E11.5 y se cultivaron. Después de 3 días, la yema ureterica se había ramificado hasta 5 veces, dando como resultado una ramificación de la yema ureterica inicialmente en forma de T. Se fotografió cada explante y se cuantificaron los números de segmentos y puntos finales para determinar las generaciones de ramificación y para calcular el número de puntos finales por rama ( Figura 1 )........
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Discusión
Este manuscrito describe un método para aislar el desarrollo de metanfric anlagen del embrión de ratón y para cultivar los órganos rudiments. Este método es una técnica estándar, desarrollada por Grobstein 8 y Saxén 9 , 10 , y fue adaptada y modificada por muchos otros 11 , 12 . El éxito del método depende principalmente de la duración de la disección, ya que la supervivencia del .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Leif Oxburgh y Derek Adams por compartir generosamente sus conocimientos, Leif Oxburgh por los útiles comentarios sobre el manuscrito, y Stefan Wölfl y Ulrike Müller por su apoyo técnico y Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer y Viola Mayer por su ayuda en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado por Desarrollo, La Empresa de Biólogos (a CP).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| Suplemento GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific 35050061 | ||
| DPBS, calcio, magnesio | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | uso para la disección |
| holo-Transferrina humana | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Solución de anfotericina B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Timerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Galato de propilo | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinilado Dolichorus Biflorus Aglutinina | Vector Laboratorios | B-1035 | |
| Alexa488 estreptavidina conjugada | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Efrina-B2 de ratón recombinante Fc Chimera Protein, CF | R& D Systems | 496-EB | |
| IgG1 Humana Recombinante Fc, CF | R& D Systems | 110-HG-100 | |
| Cabra Anti-Humano IgG Fc Anticuerpo | R& D Systems | G-102-C | |
| Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato | Sigma-Aldrich | P4417 | uso para la fijación e inmunotinción |
| Dumont #5, puntas biologie , INOX, 11 cm | agnthos.se | 0208-5-PS | Se necesitan 2 pares de pinzas |
| Tijeras de iris, rectas, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Pinzas de vendaje, rectas, delicadas, 13 cm | agnthos.se | 08-032-130 | |
| Placas de Petri Nunclo Delta tratadas | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Filtro de membrana de isoporo, policarbonato, hidrófilo, 5.0 y micro; m, 13 mm, blanco, liso | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multiplatos 4 pocillos, fondo plano | Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Cubreobjetos de microscopio de 24 x 50 mm de espesor. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cubreobjetos No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Portaobjetos ~76 x 26 x 1, 1/2 W. suelo liso | nordicbiolabs | 1030418 | |
| Cuchillas de afeitar VWR | VWR 55411-055 | ||
| Tubos de centrífuga de 50 ml Sigma-Aldrich | CLS430828 | ||
| tubos de centrífuga de 15 ml | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman papel de filtro cualitativo prepleado, Grado 113V, crepado | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Mircoscopio de investigación de platina fija | Olympus | BX61WI | |
| Negro 6 ratones endogámicos, machos, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Negro 6 ratones endogámicos, hembras, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Microscopio estereoscópico Greenough | Leica Leica | S6 E |
Referencias
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
- Peuckert, C., ....
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Reimpresiones y permisos
