Prueba de reconocimiento de objeto novedoso para la investigación del aprendizaje y la memoria en ratones

Summary

La prueba de reconocimiento de objeto (ORT) es un ensayo sencillo y eficaz para evaluar el aprendizaje y la memoria en ratones. La metodología se describe a continuación.

Abstract

La prueba de reconocimiento de objeto (ORT) es un ensayo de comportamiento utilizado para la investigación de diversos aspectos del aprendizaje y la memoria en ratones. La ORT es bastante simple y puede completarse en 3 días: día de habituación, jornada de formación y pruebas. Durante el entrenamiento, el ratón está permitido explorar 2 objetos idénticos. En el día del examen, uno de los objetos de formación se sustituye por un nuevo objeto. Porque los ratones tienen una preferencia innata por la novedad, si el ratón reconoce el objeto familiar, pasará la mayor parte de su tiempo en el nuevo objeto. Debido a esta preferencia innata, no hay necesidad de refuerzo positivo o negativo o largos calendarios de formación. Además, también puede modificarse la ORT para numerosas aplicaciones. El intervalo de retención puede ser acortado para examinar la memoria a corto plazo, o alargado para sonda de memoria a largo plazo. Intervención farmacológica puede utilizarse en varias veces antes del entrenamiento, después del entrenamiento o antes de la llamada a investigar diferentes fases del aprendizaje (es decir, adquisición, consolidación temprana o tardía o memoria). En general, la ORT es una prueba relativamente poco estrés, eficiente para la memoria en ratones y es apropiada para la detección de cambios neuropsicológicos tras manipulaciones farmacológicas, biológicas o genéticas.

Introduction

La prueba de reconocimiento de objeto (ORT), también conocido como la prueba del reconocimiento de la novela objeto (ni), es un medio relativamente rápido y eficiente para probar diferentes fases de aprendizaje y memoria en ratones. Originalmente fue descrito por Ennaceur y Delacour en 1988 y utilizado principalmente en ratas¹; sin embargo, desde entonces, ha sido exitosamente adaptado para uso en ratones^2,3,4,5,6,7. La prueba se basa en tan sólo tres sesiones: sesión de una habituación, un entrenamiento y una prueba de sesión. Formación implica simplemente exploración visual de dos objetos idénticos, mientras que la sesión de la prueba consiste en sustituir uno de los objetos previamente explorados con un objeto nuevo. Porque los roedores tienen una preferencia innata por la novedad, un roedor que recuerda el objeto familiar pasa más tiempo explorando la novela objeto de^8,7,9.

La principal ventaja de la ORT sobre otras pruebas de memoria de roedores es que se basa en la propensión natural de los roedores para explorar novedad⁸. Por lo tanto, no hay numerosas sesiones de entrenamiento o cualquier refuerzo positivo o negativo para motivar el comportamiento. Esto significa que la ORT es mucho menos estresante, con respecto a otras pruebas^{10,11,12,13,14,15}y requiere a la significativamente menos tiempo para ejecutar que comúnmente emplean memoria pruebas, como el laberinto acuático de Morris o el laberinto de Barnes, que puede tardar hasta una semana o más. En consecuencia, las condiciones de la ORT más de cerca se asemejan a los utilizados en el estudio de la cognición humana, incrementar la validez ecológica de la prueba sobre muchas otras pruebas de memoria de roedores. Del mismo modo, porque ORT es una tarea de memoria visual simple, ha sido exitosamente adaptado para uso en numerosas especies, incluyendo seres humanos y primates no humanos, para evaluar diferentes aspectos de entre las especies de la memoria declarativa ^{2,16 ,17}. Por último, la ORT puede modificarse fácilmente para examinar diferentes fases del aprendizaje y la memoria (es decir, adquisición, consolidación o recuperación), para evaluar diferentes tipos de memoria (e.g., memoria espacial), o para evaluar la retención de diferentes intervalos (es decir, a corto plazo memoria a largo plazo vs ).

La versatilidad de la ORT proporciona una plataforma para aplicaciones de investigación innumerables. Estudios pueden hacer uso de agentes farmacológicos para alterar o mejorar la memoria. Variando el tiempo de administración antes o después del entrenamiento o antes de la prueba puede insinúan neural subyacente mecanismos que conducen a interrumpen o mayor memoria^{6,18,19, 20}. de manera similar, la tecnología de optogenetic puede ser utilizado en estos mismo varios puntos de tiempo para mirar la activación/inhibición neural que contribuye a las distintas fases del aprendizaje y la memoria. La tro también es apropiado para evaluar diferencias en animales transgénicos, en los estudios de la lesión, o en modelos neurodegenerativos o en envejecimiento estudios^{21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28}. el tiempo entre la formación y de prueba, conocido como el intervalo de retención, puede modificarse para evaluar cualquiera de estos cambios en la memoria de corto y largo plazo²⁶. En última instancia, la ORT puede utilizarse como una herramienta para el estudio de cambios farmacológicos, genéticos y neurológicos en el aprendizaje y la memoria, o pueden utilizar estas herramientas para el estudio de la base del aprendizaje y la memoria en la ORT.

Protocol

aquí se realizan todos los procedimientos fueron sometidos a y aprobado por el cuidado Animal y Use Comité y se llevaron a cabo siguiendo las directrices NIH.

1. selección de objetos y disposición Experimental

1. seleccionar los objetos que son suficientemente diferentes como para ser fácilmente discriminados por los ratones, pero tienen un grado similar de complejidad (textura, forma, patrones de color y brillo, etc.) con el fin de minimizar cualquier potencial inducida por preferencia de objeto que puede sesgar los resultados (véase Ennaceur 2010 para una descripción comprensiva del objeto opción ⁷).
   1. Prueba de preferencia innata y discriminación (ver pasos 2 & 3).
   2. Objetos de uso que son tamaño de ratón o sólo ligeramente más grande para alentar la exploración ( figura 1). Para reducir la preferencia inducida, asegurar que los ratones son capaces de subir ni objeto, u objetos aunque habilidad para escalar un objeto puede aumentar el interés en la exploración (tiempo gastado sentado solo en un objeto no cuenta hacia el tiempo de exploración)
   3. Tener al menos 2 copias de cada objeto. Sin embargo, para minimizar posibles señales de olor durante la prueba, tener al menos 3 de cada objeto, duplicados para el entrenamiento y de prueba.
   4. Uso objetos de material irrompible, como la pérdida de un objeto debidos a daño durante la experimentación podrían interferir en la continuidad de la prueba y potencialmente causar daños o lesiones a los animales.
   5. Limpie los objetos antes y entre uso (etanol al 70% vol/vol es apropiado).
2. Para minimizar el estrés de iluminación brillante, utilice iluminación difusa, baja, con el centro del laberinto iluminado alrededor de 20 lux. Utilice una temperatura y humedad similar a las condiciones de vivienda habitual. Si los ratones son trasladados de una sala de la vivienda a otra habitación para el experimento, aclimatar ratones a su nueva habitación durante al menos 1 h antes de su uso cada día.
3. Manija ratones bien antes del entrenamiento. Porque la prueba se basa en la tendencia natural de los roedores para explorar novedad, reducir cualquier estrés o ansiedad de manejo que puede interferir con su deseo de explorar el campo y posteriormente, los objetos. Lo ideal es manejar ratones 1 - 2 veces / día durante al menos 1 minuto, 1 a 2 semanas antes de la prueba ^{15 , 29}.
4. Para la arena principal, utilice una cámara cuadrada (aproximadamente 40 cm x 40 cm x 40 cm) de blanco o negro, plástico no poroso, en contraste con el color del ratón. Como alternativa, utilizar un ed. arena redonda específicamente, al usar ratones ansiosos que pueden sentarse en las esquinas de un cuadrado arena, un estadio redondo puede ser preferible a conducta exploratoria ^{18 , 30}.
   1. En día de entrenamiento, colocar objetos idénticos 2 en la diagonal (es decir, uno en la esquina de NW y uno en la esquina SE). Si los objetos son demasiado ligeros y el ratón se pueden mover, fijarlos al suelo. Extraíble obras masilla de montaje bien.
   2. Para día de la prueba, utilice la copia de 3 ^rd de cada objeto para colocar un objeto familiar y un nuevo objeto en la misma diagonal como el día de entrenamiento ( figura 2).
   3. Contrarrestar el uso de cada conjunto de objetos de modo que cada objeto se utiliza igualmente como un objeto familiar y como un objeto nuevo. Además, contrarrestar la ubicación del objeto nuevo para cada una de las 4 esquinas de la arena. Asegúrese de tener en cuenta que diagonal se utiliza para que animal para que la diagonal en la jornada de formación es la misma que la utilizada en el día de la prueba, para cada ratón.
   4. Limpie bien el aparato y objetos para quitar señales de olor antes y entre uso (etanol al 70% vol/vol es apropiado).
5. Coloque la cámara directamente arriba del aparato para la visión óptima de la exploración. Sólo hay que usar el software con detección de punto de la nariz para análisis preciso. Si utiliza el software, captura una imagen de fondo con los objetos en su lugar antes de comenzar. En el software, configurar el área de exploración para ser aproximadamente 2-3 cm alrededor del objeto.
6. Para reducir la interferencia del experimentador, grabar la prueba y anotar más tarde. Ciego el scorer a las condiciones experimentales. Si anota manualmente durante el experimento, asegúrese de que el experimentador es más de 1 metro de la arena y no es visible al ratón.
   Nota: Cualquier momento el ratón pasa sobre el objeto sin activo vibrissae barriendo o sniffing no cuenta como tiempo de exploración.
Exploración de la
7. definir como cuando el ratón ' ruido s está apuntando hacia el objeto y dentro de 2-3 cm del objeto, con activo vibrissae barriendo o inhalación. No se tienen en cuenta cualquier momento sentado en el objeto sin la indicación de exploración activa.

2. Necesarios experimentos piloto

1. pruebas de preferencia inducida
   1. para la habituación, quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena abierta. Permitir que el ratón para explorar libremente por 5 min
   2. En día de entrenamiento (T1), colocar 2 objetos diferentes en cuadrantes opuestos del aparato, (es decir, NW y esquinas SE). Quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena abierta. Permite la exploración libre durante 10 minutos
   3. Calcular el índice de discriminación. Si no hay ninguna preferencia inducida, el índice de discriminación debe ser en o cerca de cero. Los objetos que muestran preferencia no deberían utilizarse para ORT.
2. Pruebas de capacidad de discriminación
   1. para la habituación, quitar el ratón de su jaula casa y colocarlo en medio de la arena abierta. Permitir que el ratón para explorar libremente por 5 min
   2. En la sesión de entrenamiento (T1), colocar objetos idénticos 2 en cuadrantes opuestos. Coloque el ratón en el centro de la arena y permitir que el ratón para explorar durante 10 minutos
   3. En pruebas de período de sesiones (T2), coloque uno del objeto utilizado durante T1 y un nuevo objeto en cuadrantes opuestos (es decir, esquinas SE y NW). Sesenta minutos después de la T1, coloque el ratón en el centro de la arena y permite la exploración libre durante 10 minutos
   4. Calcular el índice de discriminación. En un intervalo de retención de 60 min, el índice de discriminación debe estar por encima de 0.25.

3. Procedimiento experimental

1. 1. la habituación quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena abierta, vacía. Permita la libre exploración de la arena durante 5 minutos. Una vez vacía la jaula casera, guardarlo para su uso como una jaula de tenencia al día siguiente.
   2. Al final de 5 minutos, quite el ratón y coloque en una jaula de tenencia. No devuelva el ratón a su jaula original, o esto puede afectar el comportamiento de los ratones restantes a probarse.
   3. Limpie bien el aparato entre ratones con etanol al 70% vol/vol.
      Nota: Durante la habituación, ansiedad-como comportamiento puede evaluarse calculando el tiempo de permanencia en el centro (ver Prut & Belzung 2003 ³¹). Esto es una medida útil cuando se considera la longitud de tiempo de T1. Ratones de ansiedad más altos pueden requerir una sesión de 10 minutos para alcanzar el criterio de exploración mínimo.
2. Formación (T1)
   1. colocar dos objetos idénticos en cuadrantes opuestos de la arena (es decir, NE esquina y SW).
   2. 24 h después de la habituación, quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena, equidistante de los objetos idénticos 2.
   3. Permite la exploración libre de un mínimo de 5 minutos. Si se utiliza una cepa de ratones que se sabe que tienen baja actividad locomotor o exploración, (es decir, la mayoría de ratones no alcanzan un mínimo de 20 exploración de s de ambos objetos por 5 min, como se observa en las experiencias piloto o la literatura), extender la prueba a 10 min para todos mic e en la cohorte de.
   4. Al final de la prueba, quite el ratón y colocar en la jaula de tenencia. Una vez vacía la jaula casera, guardarlo para su uso como la jaula de retención en la prueba día.
   5. Limpie bien el aparato y objetos entre ratones con etanol al 70% vol/vol.
3. Pruebas (T2)
   1. Coloque un objeto que se utiliza durante T1 (es decir, el objeto familiar) y un nuevo objeto en cuadrantes opuestos de la arena. Utilizar los mismos lugares utilizados durante T1 para cada ratón.
   2. En el T1 T2 intervalo de elección, quitar el ratón de su jaula casa y colóquelo en el ámbito del centro, equidistante de los objetos familiares y la novela.
      Nota: En un intervalo de retención de 24 horas, la mayoría ratones no será capaces de discriminar entre el objeto conocido y novedoso (generalmente -0.2 < d2 < 0.2, en comparación con un positivo control de ³²). Si probando efectos Nootrópicos, utilice este momento para sonda para mejorar la memoria. Para probar para los déficits de memoria, utilice un intervalo de retención más corto de cualquier lugar entre 20 minutos a 4 horas, dependiendo de la cepa de ratón.
   3. Permite la exploración libre durante 10 minutos. Al final de la prueba, quite el ratón y colocar en la jaula de tenencia.
4. Tanto para T1 como T2, anotar los primeros 5 minutos. Si el ratón no cumple con el tiempo de exploración mínimo de 20 s para ambos objetos, continuar anotando más allá de 5 minutos hasta la exploración total sea superior a 20 s.

4. Análisis de datos

1. Criterios de exclusión
   1. durante entrenamiento (T1) y pruebas (T2), calcular el tiempo total de exploración para ambos objetos para cada sesión (e1 y e2). Más ratones deben alcanzar una mínima exploración total para ambos objetos de 20 s por 5 minutos
   2. Extender T1 y T2 tiempo de 10 min para las cepas de ratones que tienen bajo exploración y no cumplen con este criterio mínimo por 5 minutos, según lo observado durante la prueba piloto.
   3. Puntuación comportamiento durante 5 minutos o más allá de 5 minutos hasta alcanzar el criterio mínimo de 20 s.
   4. Si los ratones no alcanzan un mínimo de s 20 de exploración para ambos objetos para T1 o T2 en 10 min, excluir de análisis, no se puede confirmar que pasaban bastante tiempo explorando para aprender/discriminar.
2. Vs absolutas relativa análisis
   Nota: fórmulas diferentes para el análisis y su relación con otros pueden verse en la tabla 1. E1
   1. calcular el tiempo total de exploración durante el entrenamiento para 2 objetos idénticos, donde a1 y a2 son los objetos idénticos.
      e1 = a1 + a2
   E2
   2. calcular el tiempo total de exploración durante la prueba para el objeto conocido (a) y la novela de objeto (b).
      e2 = a + b
   Objeto de
   3. calcular d1 como simplemente el tiempo explorando la novela menos tiempo dedicado a explorar el objeto familiar. La medida de discriminación absoluta (d1) no toma en cuenta las diferencias en el tiempo de exploración entre ratones o tratamiento de grupos, aunque en ciertas circunstancias, puede ser una medida más sensible de ².
      d1 = b-a
   4. Calcula d2 como el tiempo de explorar el nuevo objeto menos el tiempo dedicado a explorar el objeto familiar dividido por el tiempo total de exploración. La medida más comúnmente usada es un valor de discriminación relativa referido a menudo como el índice de discriminación (d2), que no es influenciado por las diferencias en el tiempo de exploración. Esto significa que todos los valores caen entre -1 y + 1.
      d2 = d1/e2
   5. o bien, calcular el reconocimiento o preferencia índice (d3) ³. Este es el tiempo de explorar el nuevo objeto dividido por el tiempo total. Esto significa que todos los valores caen entre 0 y 1. A menudo es multiplicado por 100 y utiliza como valor porcentual.
      d3 = e2/b * 100
3. Análisis estadístico
   1. utilizando los valores de discriminación promedio para cada grupo, determinar el rendimiento de la memoria usando ANOVA unidireccional. Para su posterior análisis, hacer comparaciones post hoc de dos vías con los grupos control positivo/negativo y estado del vehículo tratado vs.

Results

Una configuración experimental general de la ORT se muestra en la figura 2. En la habituación ratones día (T0) se colocan en el terreno vacío por 5 min 24 horas más tarde, ratones se colocan en el compartimiento con 2 objetos idénticos y permitió explorar libremente hasta 10 minutos (T1). En la prueba el día (T2), los ratones nuevamente se colocan en la arena, pero con un objeto familiar y un nuevo objeto y permite explorar hasta 10 minutos. El intervalo de r...

Discussion

La ORT es un método eficaz y flexible para el estudio de aprendizaje y la memoria en ratones. Cuando se configura un experimento, es importante considerar una serie de variables que pueden afectar el resultado. Como en los resultados representativos, la cepa de ratón afectará tanto intervalo de retención y tiempo de exploración. Una disminución en el tiempo de exploración puede sesgar o máscara resulta en una discriminación absoluta análisis^2,3,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caja de campo abierto	Panlab/Harvard Apparatus LE800SC		Disponible en gris, blanco o negro
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Sistema de seguimiento del comportamiento
EthoVisionXT 12	Noldus		Sistema de seguimiento del comportamiento; requiere seguimiento de 3 puntos
Cámara de video	Cualquier		cámara de video debe montarse directamente sobre la cabeza del aparato
70% Etanol	Fisher Scientific	BP2818-4	Antes de comenzar las pruebas y entre pruebas, cada objeto debe limpiarse cuidadosamente. También se deben limpiar el suelo y las paredes del aparato.