Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

Resumen

Presentamos un protocolo para generar un linaje condrogénico a partir de sangre periférica humana (PB) a través de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un método de integración libre, que incluye la formación de células embrionarias (EB), expansión de células fibroblásticas y inducción condrogénica.

Resumen

En este estudio, hemos utilizado las células sanguíneas periféricas (PBC) como células de semillas para producir condrocitos a través de inducida por células madre pluripotentes (iPSCs) en un método de integración libre. Después de la formación del cuerpo embrionario (EB) y la expansión de las células fibroblásticas, las iPSC se indujeron para la diferenciación condrogénica durante 21 días en condiciones sin suero y sin xeno. Después de la inducción de los condrocitos, los fenotipos de las células se evalúan mediante análisis morfológicos, inmunohistoquímicos y bioquímicos, así como por el análisis cuantitativo en tiempo real de los marcadores de diferenciación condrogénica. Los gránulos condrogénicos muestran coloración alcian azul positivo y tinción con azul de toluidina. La inmunohistoquímica de la tinción con colágeno II y X también es positiva. El contenido de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) y los marcadores de diferenciación condrogénica COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 y AGGRECAN están significativamente regulados positivamente en chondGránulos rogénicos en comparación con hiPSCs y células fibroblásticas. Estos resultados sugieren que los PBC pueden ser utilizados como células de semilla para generar iPSCs para la reparación del cartílago, que es específico del paciente y rentable.

Introducción

El tejido del cartílago tiene una capacidad muy baja para auto-reparación y regeneración. Varias intervenciones quirúrgicas y tratamientos biológicos se utilizan para restaurar el cartílago y la función de las articulaciones, con resultados insatisfactorios. El reciente desarrollo de la tecnología de células madre puede cambiar todo el campo de reparación de cartílago ¹ . Varias células madre han sido estudiadas como células de semillas, pero las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) parecen ser la opción más prometedora, ya que pueden proporcionar muchos tipos de células específicas del paciente sin causar reacciones de rechazo ² . Además, pueden superar la limitada naturaleza proliferativa de las células adultas y mantener su auto-renovación y habilidades pluripotentes. Además, la orientación génica puede usarse para cambiar el genotipo para obtener tipos específicos de condrocitos.

Los fibroblastos han sido ampliamente utilizados para generar iPSCs porque sus potenciales de reprogramación también han sido bien estudiados.Sin embargo, todavía hay algunas limitaciones que deben ser superadas, como la biopsia dolorosa de los pacientes y la necesidad de la expansión in vitro de los fibroblastos, lo que puede dar lugar a mutaciones genéticas [ ^3] . Recientemente, los PBCs resultaron ventajosos para la reprogramación ⁴ ; Además, eran comúnmente utilizados y abundantemente almacenados. Es posible que puedan reorientar el enfoque del estudio de la piel. Sin embargo, a nuestro leal saber y entender, hay pocos informes sobre reprogramación PBC seguida de diferenciación en condrocitos.

En el presente estudio, utilizamos PBCs como una fuente alternativa de reprogramar en iPSCs y luego diferenciar el iPSCs en el linaje condrogénico a través de un sistema de cultivo de pellets con el fin de imitar la formación de condrocitos.

Protocolo

El protocolo para la generación de HiPSCs de PBC se puede encontrar en nuestro estudio anterior [ ^5] . El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de nuestra institución.

1. Formación del Cuerpo Embrionario (EB)

1. Hacer 50 ml de medio hiPSC: medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (DMEM) suplementado con un reemplazo de suero knockout al 15% (KSR), suero bovino fetal al 5% (FBS), 1 x aminoácidos no esenciales, 2-mercaptoetanol 55 μM, 2 mM L -glutamina y 8 ng / ml de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF).
2. Hacer 50 ml de medio de formación de EB: DMEM suplementado con KSR al 15%, FBS al 5%, aminoácidos no esenciales 1x, 2-mercaptoetanol 55 μM y L-glutamina 2 mM.
3. Hacer 50 ml de medio de cultivo basal: DMEM suplementado con 20% de FBS, 1 × aminoácidos no esenciales, 2-mercaptoetanol 55 μM y 2 mM de L-glutamina.
4. Preparar 10 ml de solución dispasa, 1 mg / ml en DMEM knockout.
5. CultuRe hiPSCs en placas de cultivo de tejidos de 60 mm con células alimentadoras ( es decir, una monocapa de células de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados). Cuando las células son 80-90% confluentes, disociar las células con dispase y paso de los hiPSCs 1: 3 cada 4-5 días. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C y 5% de CO ₂ .
6. Se diseccionan las colonias hiPSC indiferenciadas en trozos más pequeños (aproximadamente 50 - 100 mu m de diámetro) usando una aguja de vidrio de extracción de fuego cuando las iPSC son confluentes al 80 - 90%. Generalmente, se usan colonias de hiPSC en un plato de 60 mm para generar EB en una placa de Petri de 100 mm.
   1. Cultivar menos de 100 pequeños trozos de colonias en una placa de Petri no adherente de 100 mm que contenga 10 ml de medio de formación de EB. Coloque los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ .
7. Reemplazar aproximadamente el 25% del medio inicial con una cantidad igual del medio basal de cultivo cada 2 días. Incline el plato para dejar que los EBs se asienten. Retire con cuidado 3 mLDel medio superior y agregar 4 ml de medio de cultivo basal fresco. No molestar a los EBs.
   NOTA: Los EBs se caracterizan morfológicamente por las piezas de colonias, teniendo una apariencia redonda con bordes lisos bajo el microscopio.
8. Después de 10 días de cultivo en la placa de Petri no adherente, se cubre un nuevo plato de cultivo de tejidos de 100 mm con 4 ml de gelatina al 0,1% durante 30 minutos a 37ºC antes de su uso.
9. Transferir el medio más EBs de 100 mm, una placa de Petri no adherente a un tubo cónico de 15 ml. Deje que los EBs sedimenten durante 4-5 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y dejar menos de 0,5 ml de medio más EBs
10. Sembrar menos de 100 EB en un plato de cultivo de tejidos recubierto de gelatina de 100 mm con 10 ml de medio de cultivo basal. Coloque los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ .

2. Formación de pastillas celulares y diferenciación de condrocitos

1. Hacer 10 ml de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético al 0,25% (EDTA). Hacer 80 ml de basAl medio de cultivo: DMEM suplementado con FBS al 20%, aminoácidos no esenciales 1x, 2-mercaptoetanol 55 μM y L-glutamina 2 mM.
2. Hacer 10 ml de medio de diferenciación condrogénica: DMEM (glucosa alta) suplementado con solución de insulina-transferrina-selenio (ITS) al 10%, dexametasona 0,1 μM, ácido ascórbico 1 mM, piruvato sódico al 1% y factor de crecimiento transformante 10 ng / Beta 1 (TGF-β1).
3. Refrescar el medio con 10 ml de medio de cultivo basal después de 48 h. A continuación, refrescar el medio cada tres días con 10 ml de medio de cultivo basal.
   NOTA: Después de 10 días en cultivo, las proliferaciones de células fibroblásticas deberían haberse expandido desde los EB.
   1. Recubrir las placas de 100 mm con 4 ml de gelatina al 0,1% durante 30 minutos a 37 ° C antes de su uso. Deseche el sobrenadante celular y lave las células con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) una vez.
   2. Se digieren las células con 3 ml de tripsina / EDTA al 0,25% a 37 ° C durante 5 min y se neutralizan con 4 mL de medio de cultivo basal.
4. Disociar las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces y pasarlos a través de una malla de nylon de 70 μm. Centrifugar la suspensión celular a 200 xg durante 5 min. Vuelva a sembrar las células en un nuevo plato de cultivo de tejidos recubierto de gelatina de 100 mm con 10 ml de medio de cultivo basal.
5. Refrescar el medio con 10 ml de medio de cultivo basal después de 48 h. A continuación, refrescar el medio cada tres días con 10 ml de medio de cultivo basal.
   NOTA: Las células adquieren una morfología homogénea similar a los fibroblastos.
6. Cuando se alcanza la confluencia del ~ 90-100% ( es decir, aproximadamente 5-7 días), se cosechan las células con 3 ml de tripsina / EDTA al 0,25% a 37 ° C durante 5 min. Neutralizar con 4 ml de medio de cultivo basal. Disociar las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Utilice un hemocitómetro para contar el número de células.
   1. Coloque 3 x 10 ⁵ células en un tubo de polipropileno de 15 ml. Centrifugar a 200 xgDurante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Re-suspender las células en 1 ml de medio de diferenciación condrogénica.
7. Centrifugar las células a 300 xg durante 3 min y mantener las células en forma de pellets pequeños. Colocar el tubo en el 37 ° C y 5% CO ₂ incubadora durante 21 días. No atornille la tapa firmemente y deje que el intercambio de gas.
8. Reemplazar 3/4 del medio de cultivo cada tres días con medio de diferenciación condrogénica fresca.
   NOTA: Después de 21 días en cultivo, deben formarse gránulos hiPSC-condrogénicos (hiPSC-Chon). También se recogen células madre mesenquimatosas humanas (MSC), como control positivo, y se cultivan en el medio de diferenciación condrogénica durante 21 días para formar pastillas condrogénicas (hMSC-Chon).

3. Análisis de la diferenciación condrogénica

1. Preparar 10 ml de formalina con tampón neutro al 10%.
2. Preparar 50 ml de reactivo azul alciano al 0,1% y 50 ml de reactivo azul de toluidina al 1%.
3. PrEpare 1 mL de los anticuerpos primarios: anticuerpos policlonales de conejo contra el colágeno II (1:50) o anticuerpos monoclonales de ratón contra el colágeno X (1:50). También, preparar anticuerpos secundarios de conejo o de ratón.
4. Hacer 1 mL de solución de papaína: 10 U / mL en PBS con acetato de sodio 0,1 M, EDTA 2,4 mM y L-cisteína 5 mM.
5. Hacer 100 ml de solución de colorante azul de dimetilmetileno (DMMB): 100 μl de azul de 1,9-dimetilmetileno 16 mg / L, glicina 40 mM, NaCl 40 mM y HCl 9,5 mM; PH 3,0.
6. Evaluar la diferenciación condrogénica por azul alcian y azul toluidina manchas de las secciones de pellets.
   1. Fijar un gránulo hiPSC-Chon o pellet hMSC-Chon en 1 mL de formalina con tampón neutro al 10% durante 24 h.
   2. Transferir el pellet a 1 ml de etanol al 70% en H ₂ O. deshidratar el pellet con 1 ml de una serie de etanol graduada (es decir, 25, 50, 75, 90, 95, 100, y 100%, 3 minutos cada uno).
   3. Aclare el gránulo en 1 ml de xileno al 100% tres veces. InfiltratE el gránulo con parafina durante 1 h en un horno a 65 ° C. Incrusta el gránulo en bloques de parafina con un molde de 7 x 7 x 5 mm ³ bases, siguiendo los procedimientos histológicos de rutina ⁶ .
   4. Hacer secciones adyacentes por microtomo con un grosor de aproximadamente 4 μm ⁷ . Adherir las secciones sobre diapositivas de vidrio.
   5. Seque los portaobjetos durante 2 h a 60 ° C en un horno. Desparafinar las secciones en tres ciclos (3 min cada uno) utilizando 100% de xileno.
   6. Utilice una serie de alcohol decreciente para la rehidratación ( es decir, 100, 100, 95, 95, 70, 50 y 25% en H ₂ O, 3 min cada uno) y luego realice un enjuague final con agua desionizada durante 5 min.
   7. Mancha las secciones con 0,1% de azul alciano reactivo o 1% toluidina tinción azul durante 4-5 h y luego enjuagar con agua destilada.
   8. Deshidratar con una serie graduada de etanol ( es decir, 25, 50, 75, 90, 95, 100 y 100%, 3 min cada), seguido de tresEps de clarificación en xileno al 100%. Montar las diapositivas y visualizarlas bajo un microscopio.
7. Realizar la inmunohistoquímica.
   NOTA: Las secciones de pellets adicionales se evalúan adicionalmente mediante inmunohistoquímica.
   1. Después de la desparafinización y la rehidratación, llevar las diapositivas a ebullición en 1 mM EDTA, pH 8,0 (impermeable en agua hervida por autoclave). Dejarlos reposar durante 8 min a una temperatura de sub-ebullición y luego dejar que los portaobjetos se enfríen a TA.
   2. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada 3 veces. Incubar las secciones en 3% H ₂ O ₂ solución en metanol a TA durante 15 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena.
   3. Enjuagar los portaobjetos con agua desionizada y sumergirlos en DPBS durante 5 min. Aplique 50-100 μl de anticuerpo primario diluido apropiadamente (1:50) a las secciones de los portaobjetos y luego incube en una cámara humidificada a RT durante 1 h.
   4. Lavar los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) con DPBS. Incubar la saMples con los correspondientes anticuerpos secundarios ( es decir, anti-conejo o ratón) durante 15 min a RT.
   5. Lavar los portaobjetos 3 veces (durante 5 min cada uno) con DPBS. Realizar la detección de DAB bajo un microscopio.
   6. Lavar los portaobjetos con DPBS 3 veces (2 min cada uno). Contraste los núcleos de las células sumergiendo los portaobjetos en hematoxilina durante 1-2 min. Deshidratar con una serie de etanol graduada (25, 50, 75, 90, 95, 100 y 100%, 3 min cada uno) seguido de tres pasos consecutivos de clarificación con xileno. Finalmente, monte las diapositivas y visualícelas bajo el microscopio.
8. Detectar el contenido de sGAG.
   1. Digerir gránulos condrogénicos en solución de papaína a 60 ° C durante 2 h.
   2. Determinar el contenido de ADN utilizando el kit de ensayo dsDNA y el sistema de fluorómetro. Mida el contenido de sGAG mezclándolo con solución de colorante DMMB bajo medición de absorbancia a 525 nm ⁸ .
   3. Calcular la concentración de sGAG frente a una curva estándar deSulfato de condroitina de tiburón.
9. Realice el análisis PCR en tiempo real de los marcadores de diferenciación condrogénica en píldoras HiPSC-Chon.
   1. Coseche 3-4 de los mismos gránulos condrogénicos añadiendo 500 μl de reactivo de extracción enfriado con hielo a un tubo. Vórtice bien. Incubar la muestra durante 5 min a TA.
   2. Añadir 0,1 ml de cloroformo. Vórtice la muestra durante 15 s e incubar a RT durante 3 min. Centrifugar la muestra durante 15 min a 12.000 xg y 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior (aproximadamente 250 μl) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Añadir 25 μl de acetato de sodio y 1 μl de glucógeno a la muestra. Precipitar el ARN mezclándolo con 250 μl de alcohol isopropílico. Mezcle bien. Incubar la muestra a RT durante 10 min.
   4. Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg y 4 ° C. Retire completamente el sobrenadante. Lavar el sedimento de ARN dos veces con 500 μl de etanol al 75%.
   5. Centrifugar durante 5 minA 7.500 xg y 4 ° C. Retire todo el etanol restante y seque con aire la pastilla de ARN durante 5-10 minutos. Disolver el ARN en 10 μl de agua libre de nucleasa.
   6. Convertir el ARN en cDNA utilizando un sistema de transcriptasa inversa. Sujeción de las muestras de cDNA a PCR en tiempo real utilizando qPCR kit master mix (2x) y un sistema de PCR en tiempo real [ ^9] .
      NOTA: Las secuencias de cebadores son:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H beta - ACTIN - F : TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H beta - ACTIN - R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 - F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 - F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9- R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10- R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Resultados

Diferenciación condrogénica de hiPSCs:

El medio de formación EB y el medio basal de cultivo se utilizaron para diferenciar los hiPSCs en el linaje mesenquimal. Se utilizó un método de cultivo en múltiples etapas ( Figura 1 ). En primer lugar, los hiPSCs se diferenciaron espontáneamente a través de EB formación durante 10 días (D10, Figura 2A ]. En segundo lugar, las célu...

Discusión

Aquí, proporcionamos un protocolo para generar condrocitos de PBCs a través de iPSCs. Debido a que los PBC son más comunes y ampliamente utilizados en el campo clínico, se presentan como una alternativa potencial para la reprogramación. En este estudio, los vectores episomales (EV) se utilizaron para reprogramar PBCs en iPSCs, siguiendo el método establecido por Zhang et al. ¹¹ . Este enfoque libre de integración no implica la integración de la genotoxicidad asociada a virus, que se cree...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Knockout DMEM	Invitrogen 10829018		Medio basal utilizado para el cultivo de hiPSC y el medio de formación de EB
Knockout Serum Replacement (KSR)	Invitrogen	10828028	Un suplemento de medio más definido y libre de FBS utilizado para el cultivo de hiPSC y el medio de formación de EB
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone	sh30070.03	Utilizado para el cultivo de hiPSC y el medio de formación de EB, ofrece un excelente valor para la célula cultivo
Aminoácidos no esenciales	Chemicon	TMS-001-C	Utilizado como suplemento de crecimiento en todos los medios de cultivo celular, para aumentar el crecimiento celular y la viabilidad
L-glutamina	Invitrogen	TMS-002-C	Un aminoácido necesario para el cultivo celular
Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF)	Peprotech	100-18B	Una citocina utilizada para mantener la pluripotencia y la autorrenovación de las hiPSC
Dispasa	Invitrogen	17105041	Se utiliza para la disociación de hiPSC para el subcultivo
DMEM	Gibco	C11960	basal utilizado para el medio de cultivo MSC
0,1% gelatina	Millipore	ES-006-B	Se utiliza para la unión de células en las placas
0,25% de tripsina/EDTA	Gibco	25200072	Se utiliza para la disociación celular
DPBS	Gibco	14190250	Una solución salina equilibrada utilizada para el lavado celular o la preparación de reactivos
2-mercaptoetanol	invitrogen	21985023	Se utiliza como suplemento de crecimiento en todos los medios de cultivo celular.
ITS	invitrogen	41400045	insulina, transferrina, solución de selenio.Se utiliza para la diferenciación cronogénica.
Ácido ascórbico	Sigma	4403	Conocido como vitamina C. Ayuda en el crecimiento activo y tiene propiedades antioxidantes.
Piruvato de sodio	Gibco	11360070	Añadido al medio de cultivo celular como fuente de energía además de la glucosa.
Factor de crecimiento transformante-beta 1	Peprotech	AF-100-21C	Citoquinas que regulan la proliferación celular, el crecimiento y la diferenciación condrogénica.
Anticuerpos policlonales de conejo contra el colágeno II	Abcam	ab34712	Este anticuerpo reacciona con los colágenos de tipo II, que es específico de los tejidos cartilaginosos.
Anticuerpos monoclonales de ratón contra el colágeno X	Abcam	ab49945	Este anticuerpo reacciona con el colágeno tipo X, que es un producto de los condrocitos hipertróficos.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Para el montaje y almacenamiento a largo plazo de portaobjetos
Azul de toluidina	Sigma	89640	Se utiliza para la detección de proteoglicanos.
Azul alcián	Amresco	#0298	Se utiliza para la detección de glucosaminoglicanos.
Papain	Sigma	P4762-25MG	Se utiliza para digerir gránulos condrogénicos.
Azul de dimetilmetileno	Sigma	341088-1G	Se utiliza para cuantificar glicosaminoglianos
Sulfato de condroitina sal sódica de cartílago de tiburón	Sigma	C4384-250MG	Se utiliza para dibujar la curva estándar para la medición del contenido de sGAG.
Qubit dsDNA HS kit de ensayo	Invitrogen	Q32851 (100)	Se utiliza para determinar el contenido de ADN
TRIzol	Invitrogen	15596018	Se utiliza para el aislamiento de ARN de células
Sistema de transcriptasa inversa	Promega	A3500	Se utiliza para convertir el ARN en ADNc
Kit de qPCR SYBR FAST Master Mix	Kapa	KK4601	Se utiliza para PCR en tiempo real