Artículo de método

Un enfoque de diagnóstico resuelto por componentes para un estudio sobre los alérgenos de polen de hierba en el sur de China con rinitis alérgica y / o asma

DOI:

10.3791/55723

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4 de junio de 2017

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1State Key Laboratory of Respiratory Disease, 2National Clinical Research Center of Respiratory Disease, 3Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, 4Department of Allergy and Clinical Immunology, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 5Department of Respiratory Medicine, Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este trabajo describe un protocolo que utiliza un enfoque resuelto por componentes para estudiar la sensibilización a los alérgenos de polen de hierba en una cohorte de pacientes del sur de China con rinitis alérgica y / o asma.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sensibilización al polen de la hierba impone un riesgo global para las enfermedades alérgicas de las vías respiratorias. Aunque la prevención depende de la investigación local de los alérgenos del polen, los datos sobre este tema están limitados en el sur de China. Todos los datos disponibles se obtuvieron mediante cuestionarios de autoinforme, pruebas cutáneas y pruebas de IgE totales o específicas utilizando extractos crudos. Por muchas razones, estos métodos no son confiables. Se examinó la reactividad sérica sérica a los alérgenos de Bermuda, Timothy grass y Humulus scandens en una cohorte de pacientes del Gran Cantón (la ciudad más grande del sur de China y sus afueras) con rinitis alérgica y / o asma utilizando un analizador de inmunoensayo completamente automatizado como componente (CRD).

Por primera vez, se demostró una prevalencia considerablemente alta de la positividad de la hierba de Bermuda en los residentes del sur de China con rinitis alérgica y / o asma. En estos pacientes, una sutil prevalencia de sensibilizaciónA Timothy grass y Humulus scandens , que pueden surgir de la reactividad cruzada, ya que los dos últimos no son comunes en la región. Esto también fue apoyado por la detección de componentes alergénicos.

Los analizadores de inmunoanálisis totalmente automatizados pueden ofrecer una consistencia satisfactoria entre regiones, laboratorios e instituciones y con el tiempo. La automaticidad del instrumento puede permitir una detección estandarizada que no se hubiera revelado fácilmente antes del advenimiento del CRD.

Este es un estudio que utiliza un enfoque CRD para investigar la sensibilización a los alérgenos de polen de hierba en el sur de China. Se añade a la evidencia actual en la literatura. Se necesitan estudios futuros para validar estos hallazgos. Sin embargo, aunque el CRD es una herramienta útil, los hallazgos realizados con el analizador de inmunoanálisis totalmente automatizado no deben sustituir a otras investigaciones de laboratorio, evaluaciones clínicas y experiencia médica.

Introducción

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El polen de pasto representa casi el 50% de las alergias relacionadas con la inmunoglobulina E (IgE) y, debido a su naturaleza aérea, impone un riesgo global de enfermedades alérgicas de las vías respiratorias, en particular asma y rinitis alérgica 1 , 2 , 3 , 4 . La prevención contra alergias al polen de hierba en una región se basa en información sobre la distribución local de los alérgenos de polen. Desafortunadamente, el espectro de los alérgenos sensibilizantes varía de un lugar a otro, una observación generalmente conocida como especificidad regional.

En China, un vasto territorio de Asia oriental, la especificidad regional de la sensibilización del polen de pasto se complica aún más por los limitados datos disponibles actualmente en la parte sur de este país durante las últimas décadas 5 . Esta escasez de datos ha conducido a una dificultad en mostrar el polen sensiTización en este gran país 6 . Además, los datos muy limitados sobre el sur de China se obtuvieron en gran medida a partir de cuestionarios de auto-reporte, pruebas de prick cutáneo (en lugar de pruebas de suero de laboratorio), IgE total (en lugar de IgE alergeno-específica) y detección de IgE a alérgenos En lugar de moléculas de componentes alergénicos).

El auto-reporte de síntomas alérgicos puede ser poco fiable cuando se trata de alérgenos específicos. Las pruebas cutáneas, aunque ampliamente accesibles, implican el uso de extractos alergénicos crudos no estandarizados, que pueden contener otros componentes sensibilizantes que confunden la interpretación de los resultados. La fiabilidad de la prueba cutánea también depende en gran medida de la manipulación hábil por los alergistas o enfermeras especializadas, el uso reciente de histamina y el cumplimiento del paciente (a veces muy difícil para los niños pequeños). La IgE total es útil para la detección de una alergia pero no determinaE ofender alérgenos en un paciente. Además, casi todos los alérgenos contienen una serie de moléculas de componente alergénico. La sensibilización a los componentes principales (Der p 1 y Der p 2 de los ácaros del polvo doméstico) puede sugerir una alergia "genuina" (alergia a un alérgeno específico, en lugar de una falsa positividad debido a reacciones cruzadas con otros alérgenos), pero la sensibilización A ciertos ( es decir, la reacción cruzada Der p 10, una tropomiosina) no puede 7 .

Antes de que se introdujeran los diagnósticos resueltos por componentes (CRD), estos decepcionantes retrocesos impedían los estudios sobre alergenos en China. CRD detecta con precisión los componentes de un alergeno mediante el uso de moléculas de alérgeno recombinante o purificado, por lo que la medición fácilmente cuantificable y caracterizable [ 8] . En décadas pasadas, los estudios de la alergia emplearon con frecuencia extractos crudos de alergenos que inevitablemente contienen una serie de componentes irrelevantes. Muchos de estos coLos componentes son inertes, pero ocasionalmente, algunos podrían conducir a confundir las reacciones positivas. El uso de moléculas alérgenas recombinantes o purificadas en CRD puede eludir esto y por lo tanto proporcionar una mejor exactitud de la prueba. Cuando se procesa en microarrays, un enfoque de CRD rastrea rápidamente o identifica la sensibilización a cientos de moléculas de alérgenos en sujetos individuales. Actualmente no existe un estudio de CRD bien diseñado sobre la sensibilización del polen de pasto en el sur de China. Idealmente, este estudio debería incluir una población local de considerable cobertura geográfica, explicar el polen de gramíneas comúnmente reportado en China y abordar los aspectos técnicos mencionados anteriormente. Para llegar a un nivel práctico de relevancia clínica y para facilitar el reclutamiento de muestras de suero, la investigación temprana sobre la sensibilización a los polen de hierba como alergenos inhalantes puede también centrarse en pacientes con trastornos alérgicos respiratorios, en lugar de en la población general.

Este trabajo describe un métodoUtilizado para probar la reactividad sígida del suero a la hierba Bermuda, Timothy grass y Humulus scandens en pacientes del Gran Cantón (la ciudad más grande del sur de China y sus afueras) con rinitis alérgica y / o asma utilizando el enfoque CRD 5 . Estos hallazgos sobre la sensibilización a estos peces de pasto subtropical y templado en el sur de China añaden evidencia importante a la que actualmente se encuentra en la literatura.

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Protocolo

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El protocolo del estudio, incluido el uso de muestras de suero humano, fue aprobado por el Comité de Ética, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou. Todos los participantes ofrecieron consentimiento informado por escrito, ya sea de forma independiente o vía sus padres (en el caso de los niños). El protocolo se ha registrado en línea (Chinese Clinical Trial Registry, Nº Reg .: ChiCTR-DCC-13004003, consulte http://www.chictr.org/cn/).

1. Identificación de la población de estudio

NOTA: El Repositorio de Información sobre Alergias del Laboratorio Principal de Enfermedades Respiratorias (AIR-SKLRD) es la principal fuente de reclutamiento de pacientes, ya que AIR es la base de datos más documentada de pacientes para pruebas alérgicas en el sur de China 9,10. AIR ha estado almacenando muestras de suero de pacientes durante casi una década. Brevemente, estas muestras almacenadas se prepararon previamente por centrifugación de 5 ml deF de sangre venosa flebotomizada durante 10 min a 3.000 xg y recuperando el sobrenadante. Las muestras de suero se colocaron en -80 ° C refrigeradores para el almacenamiento a largo plazo. Las muestras que cumplieron los criterios de inclusión de los pacientes estaban listas para usar en todas las pruebas del presente estudio.

  1. A partir de la base de datos de AIR, recoja datos sobre pacientes con rinitis alérgica y / o asma que se sometieron a exámenes de suero de alérgenos de hierba entre enero de 2013 y junio de 2015, el período de estudio prediseñado.
  2. Seleccione pacientes con rinitis alérgica leve o moderada y / o asma de acuerdo con las directrices de la Rinitis Alérgica y su Impacto en el Asma (ARIA) 11 y la Iniciativa Global para el Asma (GINA) 12 . Asignarlos como el "grupo de estudio".
  3. Excluir a los pacientes con registros médicos incompletos, los que se pierden en el seguimiento, los que se niegan a dar su consentimiento informado con respecto al uso de sus muestras de suero con fines científicos,Mmunodeficiencia, aquellos que actualmente están en inmunoterapia o agentes inmunomoduladores, o aquellos que tienen infecciones parasitarias.
  4. Seleccione una cohorte contemporánea de pacientes con alergias no respiratorias (eccema, dermatitis alérgica y alergia alimentaria) de acuerdo con los mismos criterios de exclusión y asignarlos como el "grupo control".
  5. Asegúrese de que las muestras de suero fueron recolectadas antes de que se hayan administrado recetas o tratamientos para minimizar los efectos de confusión en los hallazgos de laboratorio. Excluya cualquier muestra de suero que no cumpla con este requisito.
  6. Asegúrese de que todos los sujetos son residentes permanentes de todas las partes del Gran Cantón ( es decir, nacido o ha vivido allí por más de 10 años).

2. Flujo del Estudio y Mediciones de Interés

  1. Recuperar las muestras de suero de pacientes elegibles de la bio-banco. Para probar un componente alérgeno / alérgeno, use 140 μl de suero (incluyendo 100 μL para llenarHasta el espacio muerto).
    NOTA: El volumen sérico total máximo necesario para cada paciente en este estudio es: 3 alérgenos específicos y 8 componentes alérgenos, sIgE = 140 μL * 11 = 1.540 μL.
  2. Cuando utilice este instrumento, pruebe primariamente las muestras de suero para SIGE a alérgenos enteros de Bermuda, Timothy grass y Humulus scandens . Siga las instrucciones de la Sección 3.
    NOTA: Estos pólenes fueron seleccionados para las mediciones porque Bermuda grass 13 , 14 , 15 y Humulus scandens 16 han sido ampliamente reportados en China, mientras que Timothy grass 17 , 18 , 19 es una especie vegetal típica que vive en ambientes que van de tropical a templado Y es el más estudiado en todo el mundo.
  3. Secundariamente, probar las muestras de suero identificadas en el paso 2.3 para tenerSIGES a alergenos completos para la presencia de SIGES a componentes alérgenos de Bermuda [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp1 (g205), Phlp4 (g208), Phlp5 (g215), Phlp6 (g209 ), Phlp7 (g210), Phlp11 (g211) y Phlp12 (g212)], y determinantes de carbohidratos reactivos cruzados [CCD (o214)]. Siga las instrucciones de la Sección 3.

3. Procedimiento de prueba completamente automatizado utilizando el sistema de análisis inmunoensayo

NOTA: Todo el procedimiento de la prueba de alergia de la sIgE, que es totalmente automatizado y ha sido descrito en otro lugar 7 , 8 , 9 , 10 , sigue el protocolo del fabricante.

  1. Inicie el analizador de inmunoensayo completamente automatizado ( por ejemplo, ImmunoCAP1000) y úselo para realizar el inmunoensayo durante todo el estudio. Active el equipo de administración de datos de información (IDM).
    NOTA: El inmunoensayo analYzer está rutinariamente en modo de espera.
  2. Con la "alimentación primaria" activada, encienda la "alimentación del sistema" y espere 3 minutos hasta que se inicie el software incorporado. Haga clic en "Load Rinse Solution" y "Load Washing Solution".
  3. Añada 140 μl de suero a un vial para cada prueba del componente alérgeno / alérgeno. Etiquetar cada vial que contenga 140 μl de suero con un número de identificación único para cada paciente.
  4. Desde la interfaz IDM, ejecute los siguientes pasos haciendo clic en el menú.
    1. Compruebe la ventana "Solicitar lista" en el IDM para asegurarse de que "sIgE" es el método de prueba de elección.
    2. Cargue los tubos de muestra en los bastidores de muestra y los tubos de control de calidad en los bastidores de control de calidad con códigos de barras.
      NOTA: Para cada paciente se planificó inicialmente la prueba para sIgE a 3 alérgenos específicos y 8 componentes alérgenos, o 346 * 11 (3,806) tubos de muestra. Para cada tubo de muestra, 3 tubos de control de calidadQue contienen niveles bajos, medios y altos de control sIgE (ver Tabla de Materiales para más detalles). Finalmente, sólo 58 pacientes que dieron positivo en la prueba primaria (paso 2.3) fueron examinados en la prueba secundaria (paso 2.3). La carga de los tubos se puede ajustar automáticamente en la consola del ordenador.
    3. Seleccione "Load Reagents" en la pantalla "Assay Processing". Completar la carga de la muestra y las bandejas de control de calidad, solución de desarrollo, conjugado, calibradores, portador, puntas de pipeta, solución de parada y solución de lavado de acuerdo con la "Lista de carga" (consulte la Tabla de materiales para más detalles).
    4. En "Cargar e iniciar", presione "Aceptar".
      NOTA: Al final de la medición, los resultados aparecen en el IDM.
    5. Desde la interfaz IDM, seleccione los datos que se van a exportar. Haga clic en "Menú", "Aprobar" y "Guardar como" y exporte los resultados de medición de SIGE como un archivo de hoja de cálculo.
    6. Importe el archivo de hoja de cálculo a un software estadístico ( por ejemplo, SPSS) 10 . Utilizando un módulo específico para los coeficientes de Spearman del menú SPSS, analice las correlaciones en la sensibilización entre estos pollos de hierba (sIgE positivo a todo el alergeno) y los componentes del polen (sIgE positiva a las moléculas alérgenas).

4. Definición de la reactividad de SIGE

NOTA: Para una muestra de suero sin diluir, el rango de medición de IgE específica es de 0,35 a 100 kU / L.

  1. Diluir las muestras con valores sIgE> 100 kU / L 1: 5 y volver a ensayar. Cuando el valor se mantenga superior a 100 kU / L, proceda a nuevas diluciones hasta alcanzar un nivel final de hasta 1.000 kU / L.
  2. Basándose en el valor umbral de 0,35 kU / L, considere un nivel sIGe superior a 0,35 kU / L para ser positivo 5 , 7 , 10 . Calificar el reactiv(≥0.35 y <0.70 kU / L), clase 2 (≥0.70 y <3.50 kU / L), clase 3 (≥3.50 y <17.50 kU / L), clase 4 (≥ 17,50 y <50,00 kU / L), clase 5 (≥50,00 y <100,00 kU / L) y clase 6 (≥100,00 kU / L).

5. Análisis estadístico

  1. Analizar los datos con software estadístico ( por ejemplo, SPSS) 10 . Reportar los datos cuantitativos como la media y la desviación estándar, los datos cualitativos como la mediana y los rangos intercuartiles (IQR), y los datos categóricos como la proporción de los resultados positivos.
  2. Utilice una prueba de ji cuadrado para la comparación de proporciones entre grupos, una prueba t no emparejada para datos cuantitativos y una prueba de suma de rangos para datos cualitativos.
  3. Utilice la prueba de Pearson para los análisis de correlación entre datos paramétricos, con los coeficientes de correlación expresados ​​como "r" y el test de Spearman para valores no paramétricos, con tCoeficientes de correlación expresados ​​como " r s ". Considere la significación estadística para ser cuando P- valores <0,05.

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Resultados

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El analizador de inmunoensayo totalmente automatizado utilizado en este estudio tiene una estructura de fase sólida cubierta con alergenos de acoplamiento covalente o componentes alérgenos que reaccionan con las moléculas de interés (sIgE) en muestras de suero del paciente. Con un programa automático, el analizador elimina todas las IgE no específicas con 150 μl de solución de enjuague y lo repite 5 veces. A continuación, agrega anticuerpos anti-IgE marcados con enzima (50 μl) para gener...

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Discusión

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Los analizadores de inmunoanálisis totalmente automatizados pueden ofrecer una consistencia satisfactoria entre regiones, laboratorios e instituciones y con el tiempo. Se ha descubierto que un procedimiento automático de este tipo respalda sustancialmente la investigación de laboratorio y los estudios clínicos, permite la detección estandarizada de muchos alergenos y / o componentes de alérgenos e identifica probables reacciones cruzadas de alergenos que no se habrían revelado fácilmente antes del advenimiento de los CR...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Damos las gracias a Yueming Su por su ayuda en la preparación de la figura. Este estudio fue financiado por la Fundación Guangdong de Ciencia y Tecnología (Proyecto No .: 2014A020212352), la Oficina de Educación de Guangzhou (1201630044; 1201630393) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 81572063; NSFC 81601394).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumento ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)12-3800-01
Paquete de software de gestión de datos de información de PhadiaThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)12-3801-11
Paquete de software, ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)12-3801-12
g2
( Hierba Bermuda)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)14-4131-01
g6
(hierba Timothy)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)14-4100-01
w22
(lúpulo japonés)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)14-4452-01
g216
(nCyn d 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)14-4972-01
g205
(rPhl p 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)14-5234-01
g208
(nPhl p 4)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)14-5288-01
g215
(rPhl p 5b)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)14-5338-01
g209
(rPhl p 6)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)14-5289-01
g210
(rPhl p 7)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)14-5290-01
g211
(rPhl p 11)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suecia)14-5291-01
g212
(rPhl p 12)		Thermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala, Suecia)14-5292-01
O214
Determinantes de carbohidratos de reacción cruzada (CCD)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)14-5339-01
Conjugado de IgE específica 400Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9310-08
Tira calibradora de IgE específicaThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9459-08
Tira de control de curva de IgE específicaThermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala Suecia)10-9312-08
IgE específica Anti-IgE ImmunoCAPThermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala Suecia)14-4417-01
ImmunoCAP Control negativo de IgEThermo Fisher Scientific Inc. (Phadia AB, Uppsala Suecia)10-9445-01
Control de IgE específica de ImmunoCAP LThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9528-01
Control de IgE específica de ImmunoCAPM Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9529-01
Control de IgE específica de ImmunoCAP HThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9530-01
Soluciónde desarrolloThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9439-08
Solución de paradaThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)34-2271-58
Solución de lavadoThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9202-08
FluoroCThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9264-01
Kit de solución de mantenimientoThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suecia)10-9476-01
específica

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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