Artículo de método

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

DOI:

10.3791/55738

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1 de junio de 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) transduce la energía derivada de la descomposición de varios combustibles en la moneda bioenergética de la célula, ATP. El ETC se compone de 5 complejos masivos de proteínas, que también se agrupan en supercomplejos llamados respirasomes (CI, C-III y C-IV) y synthasomes (CV) que aumentan la eficiencia del transporte de electrones y la producción de ATP. Se han utilizado varios métodos durante más de 50 años para medir la función ETC, pero estos protocolos no proporcionan información sobre el ensamblaje de complejos individuales y supercomplejos. Este protocolo describe la técnica de electroforesis en gel de gel de poliacrilamida nativa (PAGE), un método que fue modificado hace más de 20 años para estudiar la estructura compleja de ETC. La electroforesis nativa permite la separación de los complejos ETC en sus formas activas, y estos complejos pueden entonces estudiarse usando inmunotransferencia, ensayos en gel (IGA) y purificación por electroelución. Combinando el reLos resultados de PAGE PAGE nativo con los de otros ensayos mitocondriales, es posible obtener una imagen completa de la actividad ETC, su ensamblaje dinámico y desmontaje, y cómo esto regula la estructura y función mitocondrial. Este trabajo también discutirá las limitaciones de estas técnicas. En resumen, la técnica de PAGE nativo, seguida de immunoblotting, IGA y electroelución, presentada a continuación, es una poderosa manera de investigar la funcionalidad y composición de los supercomplexos mitocondriales ETC.

Introducción

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La energía mitocondrial en forma de ATP no sólo es esencial para la supervivencia celular, sino también para la regulación de la muerte celular. La generación de ATP por fosforilación oxidativa requiere una cadena funcional de transporte de electrones (ETC, Cx-I a IV) y ATP sintasa mitocondrial (Cx-V). Estudios recientes han demostrado que estos grandes complejos de proteínas están organizados en supercomplejos, llamados respirasomes y synthasomes 1 , 2 . Es difícil analizar la asamblea, la dinámica y la regulación de la actividad de estos complejos y supercomplejos masivos. Mientras que las mediciones del consumo de oxígeno tomadas con un electrodo de oxígeno y los ensayos enzimáticos llevados a cabo utilizando un espectrofotómetro pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad compleja de ETC, estos ensayos no pueden proporcionar información con respecto a la presencia, tamaño y composición de subunidades del complejo proteico o supercomplejos implicados. Sin embargo, el desarrollo de azul y claro nativo (BN y CN, respectivamente) PAGE 3 ha creado una potente herramienta para revelar información importante sobre la composición compleja y el montaje / desmontaje y sobre la regulación dinámica de la organización supramolecular de estos complejos respiratorios vitales en condiciones fisiológicas y patológicas 4 .

El montaje de estos complejos en supercomplejos de orden superior parece regular la estructura y función mitocondrial 5 . Por ejemplo, el montaje respirasome aumenta la eficiencia de la transferencia de electrones y la generación de la fuerza motriz del protón a través de la membrana interna mitocondrial 5 . Además, el montaje de los sintomas no sólo aumenta la eficiencia de la producción de ATP y la transferencia de equivalentes de energía al citoplasma 2 , sino que también moldea la membrana interna mitocondrial en las crestas tubulares 6 ,/ Sup> 7 . Estudios de montaje supercompleto durante el desarrollo cardíaco en embriones de ratón muestran que la generación de Cx-I que contienen supercomplejos en el corazón comienza en alrededor del día embrionario 13,5 8 . Otros han demostrado que la cantidad de supercomplexos que contienen Cx-I disminuye en el corazón debido al envejecimiento o lesiones por isquemia / reperfusión 9 , 10 o pueden jugar un papel en la progresión de enfermedades neurodegenerativas 11 .

Este protocolo describe métodos para gel PAGE nativo que puede usarse para investigar el montaje y la actividad de los complejos ETC y supercomplejos. El peso molecular aproximado de los supercomplejos mitocondriales puede evaluarse separando los complejos proteicos en geles de poliacrilamida CN o BN. CN PAGE también permite la visualización de la actividad enzimática de todos los complejos mitocondriales directamente en el gel (ensayos en gel;IGA) 12 . Este trabajo demuestra la actividad de respirasomes resaltando la capacidad de Cx-I para oxidar NADH a través de IGA y la presencia de synthasomes debido a la actividad de hidrolización de ATP de Cx-V por IGA. Los múltiples complejos y supercomplejos que contienen Cx-I y Cx-V también pueden demostrarse transfiriendo las proteínas sobre membranas de nitrocelulosa y realizando inmunotransferencia. La ventaja de este enfoque es que BN o CN PAGE generalmente separa complejos proteicos basados ​​en su tamaño fisiológico y composición; La transferencia a una membrana conserva este patrón de bandas. Análisis de complejos de proteínas en un BN o CN PAGE también se puede hacer utilizando 2D-PAGE (véase Fiala et al 13 para una demostración) o por centrifugación de densidad de sacarosa [ 14 , 15] . Para analizar más a fondo una banda específica, puede ser extirpada de la BN PAGE, y las proteínas de este complejo de proteínas pueden ser purificadasD electroelutándolos bajo condiciones nativas. La electroelución nativa puede realizarse en pocas horas, lo que podría hacer una diferencia significativa en la difusión pasiva (tal como se utiliza en la Referencia 16) de proteínas desde un gel al tampón circundante.

En resumen, estos métodos describen varios enfoques que permiten la caracterización adicional de los supercomplexos de alto peso molecular de las membranas mitocondriales.

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Protocolo

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Todos los experimentos se realizaron utilizando corazones de ratones C57BL / 6N (tipo salvaje). Los ratones fueron anestesiados con CO 2 antes de la dislocación cervical, y todos los procedimientos se realizaron en estricta conformidad con la División de Laboratorio de Medicina Animal en la Universidad de Rochester y en cumplimiento con la ley estatal, estatuto federal y NIH política. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rochester (Comité Universitario de Recursos Animales).

1. CN y BN PAGE

NOTA: Todos los equipos utilizados para BN y CN PAGE deben estar libres de detergente. Para asegurar esto, lave todo el equipo con ácido clorhídrico 0,1 M, seguido de enjuague extensivo con H2O desionizada.

  1. Preparación
    1. Preparar un tampón anódico consistente en imidazol 25 mM, pH 7,0, a 4ºC; Almacenar a 4 ° C.
    2. Preparar buffer de cátodo para CN o BN PAGE.
      1. Para CN PAGE, usar imidazol 7,5 mM y tricina 50 mM; Añadir 0,5 g de desoxicolato de sodio y 0,2 g de lauril maltosida por litro de tampón. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
      2. Para BN PAGE, usar imidazol 7,5 mM y tricina 50 mM y ajustar el pH a 7,0 a 4ºC. Almacenar a 4 ° C.
      3. Para el tampón de cátodo BN de color azul claro, utilice imidazol 7,5 mM y tricina 50 mM. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y añadir 20 mg de Coomassie por litro de tampón. Almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar el tampón de extracción (EB) con 50 mM de NaCl, 50 mM de imidazol, 2 mM de ácido aminocaproico y 1 mM de EDTA. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
    4. Preparar tampón de gel 3x (utilizado para geles BN y CN) con imidazol 75 mM y ácido aminocaproico 1,5 M. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
    5. Preparar un tampón de carga (LB) de 0,01 g de Ponceau S, 5 g de glicerol y 5 ml de H 2 O. Almacenar en la habitacióntemperatura.
    6. Preparar azul de Coomassie añadiendo 50 mg de Coomassie a 1 ml de ácido 6 - aminohexanoico 500 mM. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
    7. Preparar 20 mM y 200 mM de lauril maltosida en H 2 O. Hacer alícuotas de 200 μL y almacenarlos congelados. Descongele el detergente antes de usarlo.
3% a 8% (mini) 4% a 10% (maxi)
0,5 geles (luz) 0,5 geles (pesados) 0,5 geles (luz) 0,5 geles (pesados)
AAB (ml) 0,42 1.3 2,5 7,7
Tampón CN / BN (ml) 1,6 1,6 8.5 8.5
H $ ₂ $ O (ml) 2.7 1,4 14 6,3
Glicerol (g) 0 0,47 0 2,5
Volumen (ml) 4,72 4,77 25 25
APS (μL) 27 27 sesenta y cinco sesenta y cinco
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabla 1: Cantidad de Ingredientes Necesarios para Verter 1 Mini- o Maxi-PAGE. Los volúmenes utilizados en esta tabla se calculan para 1 mini- o 1 maxi-gel, de 1,5 mm de espesor. El volumen de AAB se basa en una solución madre al 40%. Luz y pesado se refieren a la concentratIon de AAB. APS y TEMED se añaden después de que cada columna del mezclador de gradiente se llena con solución de AAB.

  1. Geles para colar y correr
    NOTA: Utilizar gradiente de 3-8% o 4-10% de acrilamida / bisacrilamida (AAB) para los geles CN o BN, respectivamente. La Tabla 1 resume las cantidades de tampón, AAB, H2O, glicerol, persulfato de amonio (APS) y tetrametiletilendiamina (TEMED) utilizado para un mini gel (85 mm de ancho x 73 mm de alto x 1,5 mm de espesor) o maxi-gel Mm de ancho x 200 mm de alto x 1,5 mm de espesor). Los ensamblajes de placas de vidrio con geles CN o BN se pueden refrigerar en una bolsa con unos pocos ml de tampón de gel 1x o envueltos en una toalla de papel mojada con 1x tampón de gel para almacenamiento. Los geles son estables para su uso por hasta una semana.
    1. Para verter el gel, coloque el mezclador gradiente sobre una placa de agitación elevada para asegurar que el gel fluirá por gravedad hacia la cámara de gel preparada.
    2. Llenar la cámara de salida del mezclador de gradiente con 4,77 / 25 mL (Mini / maxi) de la solución pesada (con una mayor concentración de AAB).
    3. Abra suavemente la conexión del grifo de parada entre la cámara pesada y ligera y permita que una gota de solución pase al otro lado.
      NOTA: Esto empuja burbujas de aire del tubo de conexión y del grifo, lo que evitará el flujo entre las dos cámaras. Esto no puede hacerse si ambos lados ya han sido llenados, porque la presión igual evitará que la burbuja se mueva a través.
    4. Llene la otra cámara del mezclador de gradiente con 4,72 / 25 mL (mini / maxi) de la solución ligera.
    5. Coloque una barra de agitación en la cámara de salida con la solución pesada y comience a agitar. Utilice una velocidad de barra de agitación que no cause burbujas.
    6. Agregue rápidamente APS y TEMED a cada cámara para iniciar la polimerización.
    7. Abrir la conexión entre las dos cámaras del mezclador de gradiente y permitir la mezcla durante unos segundos antes de abrir la cámara de salida para verter el gel.
      NOTA: Gravedad wiLl drenar ambas cámaras por igual, y la mezcla de la luz en la solución pesada disminuirá lentamente la densidad de acrilamida desde el fondo hasta la parte superior del gel. Utilice todo el contenido que está en el mezclador de degradado para verter el gel.
      1. Al final, monte cuidadosamente el peine, con los pocillos dentro del gel para evitar burbujas y mezcla de capas.
    8. Lavar inmediatamente el mezclador de gradiente con etanol para enjuagar cualquier gel. Enjuague con agua y vierta el segundo gel. Deje que los geles se polimerizan (normalmente se necesitan menos de 20 min para mini-geles).
    9. Para hacer funcionar los geles, montarlos en la abrazadera del ensamblaje del electrodo y llenar la cámara central / superior con tampón catódico CN o azul claro. Espere unos minutos para verificar si hay fugas antes de añadir tampón anódico a la cámara externa / inferior.
      1. Tire suavemente de los peines de los pocillos y lave los pocillos con tampón de cátodo utilizando una jeringa o una pipeta.
      2. Ejecutar los geles en una habitación fría (4 ° C) o completamente envasados ​​en hielo.
        1. Para CN mini-PAGE, utilice 100 V durante la primera hora y 200 V hasta que termine, usualmente un adicional de 1-1,5 h. Alternativamente, ejecute la mini-PAGE CN a 30-40 V durante la noche.
          NOTA: El enfoque aquí es sobre complejos de proteína de alto peso molecular, por lo que los complejos de proteína con un peso molecular de menos de 140 kDa saldrán del gel. Pueden usarse tiempos de funcionamiento más cortos para la electroforesis para retener complejos de bajo peso molecular.
        2. Para BN maxi-PAGE, utilizar 100 V y administrar los geles durante la noche (aproximadamente 18 h).
          NOTA: La corriente será muy baja (<15 mA), por lo que se necesita una fuente de alimentación que pueda manejar estas condiciones. En este punto, los geles pueden usarse para IGA o inmunotransferencia. En algunos casos, bandas o carriles se pueden cortar de los geles usando una cuchilla de afeitar sobre una placa de vidrio para electroelución.
  2. preparación de la muestra
    NOTA: Los supercomplexos mitocondriales unidos a membranas deben ser extraídos deE membrana mitocondrial interna. Para preservar los supercomplexos mitocondriales, utilice mitocondrias recién aisladas o muestras que hayan sido congeladas y descongeladas sólo una vez. Los cálculos / volúmenes siguientes se dan para mini-geles (el pocillo de un peine de 10 pocillos en un gel de 1,5 mm de grosor sostiene hasta 35-40 μL) y maxi-geles (el pocillo de un peine de 15 pocillos 200 mu L). Además, guarde una alícuota de cada muestra (usualmente 10 μl), para que se ejecute en un gel SDS desnaturalizante para la detección del canal aniónico dependiente de la tensión (VDAC), como un control de carga.
    1. Coloque una cantidad apropiada ( por ejemplo, 10-50 μg de proteína para mini-geles y 50 - 200 μg para maxi-gels) de mitocondrias aisladas o homogeneizado de tejido en microtubos y centrifugue a 17.000 xg durante 10-15 min a 4 ° C.
      NOTA: Este paso elimina parte de la matriz mitocondrial soluble y / o proteínas citosólicas.
    2. Aspirar y desechar el sobrenadante y añadir tampón de extracción a la cantidad deseadaPara cargar sobre el gel. Resuspender suavemente el sedimento sobre hielo. Si se desea, añada una mezcla general de inhibidores de proteasa en este punto.
      NOTA: En base al equipo utilizado, se utilizaron 30 μl para un mini-gel y 100 μL para un maxi-gel, limitando la relación proteína / buffer a no más de 2 μg de proteína a 1 μl de tampón.
    3. Añada detergente ( por ejemplo, 2 μg de lauril maltosida / 1 μg de proteína, consulte los resultados representativos y la discusión para obtener más información).
      NOTA: Generalmente, se usa lauril maltosida, pero también se puede usar digitonina.
    4. Incubar en hielo durante 20 min. Mezclar suavemente al principio y ocasionalmente durante la incubación triturando y / o agitando el tubo.
    5. Centrifugar a 17.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar cualquier membrana y fragmentos de tejido.
    6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Para las muestras de CN, añada 1 μl de LB por cada 10 μl de volumen de la muestra; El volumen total de la muestra debe ser appAproximadamente 40 μl para un mini-gel y 130 μL para un maxi-gel. Para las muestras BN, añada Coomassie a las muestras de modo que la proporción de colorante a detergente sea de 1: 4 (p / p).
    7. Cargar 30 y 120 μL de las muestras en los pocillos del mini- o maxi-gel, respectivamente. Utilice los 10 μL restantes de cada muestra para el gel SDS desnaturalizante para detectar VDAC como control de carga.
    8. Para preparar los marcadores de peso molecular, disolver 1 vial de una mezcla de calibración de alto peso molecular (ver la Tabla de Materiales para obtener más información) en 60 μL de tampón de gel BN / CN y añadir 120 μl de H2O y 20 μl de LB. Carga de 15 μL por carril.
    9. Ejecutar los geles como se describe en el paso 1.2.9.2.

2. Ensayos en gel para Cx-I y Cx-V

NOTA: Los ensayos se realizan a temperatura ambiente. Tome fotos, escaneos o imágenes de bandas en desarrollo para documentación. (Importante) Las proteínas no pueden ser transferidasO membranas de nitrocelulosa después de completar una IGA.

  1. Ensayo Cx-I
    1. Preparación.
      1. Preparar un tampón de ensayo de Tris 5 mM en H $ ₂ $ O, con un pH de 7,4; almacenar a temperatura ambiente.
      2. Disolver 10 mg de NADH en 1 mL de tampón de ensayo. Almacenar en alícuotas de 100 μl a -20 ° C hasta su uso; Evite congelar y descongelar.
      3. Pesar 25 mg de Nitroblue tetrazolium en un microtubo.
      4. Preparar el fijador diluyendo 5 mL de ácido acético en 95 mL de H2O; almacenar a temperatura ambiente.
    2. Realización del ensayo.
      1. Se combinan 10 ml de tampón de ensayo con 25 mg de Nitroblue tetrazolium (concentración final: 2,5 mg / ml) y 100 μl de NADH 10 mg / ml (0,1 mg / ml). Añadir esto a todo el gel, un carril o un área de interés extirpada de un gel de CN.
        NOTA: Esto se puede hacer en un recipiente de plástico o vidrio transparente. Tenga en cuenta que este ensayo no se puede realizar después de BN PAGE.
      2. Seguir el desarrollo de bandas azules después de agitación suave (rocker) durante> 3 min.
      3. Fijar el gel en 10-20 mL de solución de ácido acético o lavar en Tris 5 mM, pH 7,4 para detener la reacción. Tome fotografías para documentación (vea la Tabla de Materiales).
  2. Ensayo Cx-V
    NOTA: El ensayo de Cx-V debe realizarse usando geles duplicados de CN o BN, donde se incuba con 5 μg / mL de oligomicina (un inhibidor de Cx-V) para demostrar actividad independiente de Cx-V.
    1. Preparación.
      1. Preparar un tampón de ensayo con Tris 35 mM y glicina 270 mM; Ajustar el pH a 8,3 a temperatura ambiente. Guarde el tampón congelado en alícuotas de 50 ml, pero compruebe el pH después de congelar y descongelar.
      2. Preparar MgSO $ ₄ $ 1 M en H $ ₂ $ O; Guardar a 4 ° C hasta su uso.
      3. Pesar 27,28 mg de Pb (NO3) 2 en un microtubo.
      4. Pesar 60 mg de ATP en un microtube.
      5. Disolver 1 mg de oLigomicina en 1 ml de etanol. Guarde a -20 ° C hasta su uso.
      6. Preparar un fijador mezclando 50 mL de metanol con 50 mL de H2O; almacenar a temperatura ambiente.
    2. Realización del ensayo.
      1. Incubar un gel, un carril o un área de interés de un gel de BN o CN durante 2 h con agitación suave (rocker) en 10-20 mL de tampón de ensayo ± 5 μg / mL de oligomicina (50-100 μl de 1 mg / Ml en etanol) a temperatura ambiente.
      2. Después de la incubación, se sustituye el tampón por 14 ml de tampón de ensayo nuevo y se añaden, en orden, 190 μl de MgSO4 1 mM (14 mM), 27,28 mg de Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg de ATP 8 mM) y 75 μL de oligomicina (cuando sea necesario).
      3. Incubar con agitación suave (rocker) y observar un precipitado blanco, como bandas de geles tratados con oligomicina dará non-Cx-V dependientes bandas.
        NOTA: La aparición del precipitado puede tardar varias horas.
      4. Fijar el gel en metanol-( Por ejemplo, metanol al 50%), porque las soluciones ácidas disolverán el precipitado de plomo. Fotografíe los resultados.
        NOTA: El precipitado de plomo no interfiere con la tinción con Coomassie de los geles.

3. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF)

  1. Preparar un tampón de transferencia de Tris 25 mM y glicina 200 mM. Ajustar el pH a 8,3 y añadir SDS 0,0005 g / L y metanol 200 ml / l. Almacenar a temperatura ambiente.
    1. Cortar una membrana de nitrocelulosa o PVDF (tamaño de poro: 0,45 μm) con una cuchilla de afeitar o unas tijeras hasta un tamaño ligeramente mayor que el del gel.
      NOTA: Las membranas de nitrocelulosa permiten la tinción con Ponceau S para evaluar la carga de proteínas, mientras que las membranas de PVDF producen bandas más definidas.
  2. Protocolo.
    1. Remojar la membrana de nitrocelulosa, el papel de filtro y las esponjasAl menos 10 min en tampón de transferencia. Colocar la membrana de PVDF en metanol al 100% durante 15 s o según la recomendación del fabricante antes de colocarla en tampón de transferencia. Coloque el casete abierto del kit de transferencia en un recipiente plano con tampón de transferencia.
    2. Coloque la esponja y 1-2 capas de papel de filtro en la parte posterior del cassette. Quite las burbujas.
    3. Coloque el gel en el papel de filtro. Indicar la orientación del gel recortando una esquina del gel y / o la membrana.
    4. Coloque la membrana en la parte superior del gel. Quite todas las burbujas.
    5. Coloque papel de filtro y una esponja encima de la membrana. Quite todas las burbujas en este sándwich.
    6. Cierre el cassette y colóquelo en el portacartucho del kit de transferencia.
    7. Transferir las proteínas a 25 V durante aproximadamente 12-18 h.

4. Inmunotransferencia

  1. Preparación.
    1. Preparar una tinción de Ponceau (500 ml) añadiendo 25 mlDe ácido acético y 0,5 g de Ponceau S a 475 ml de H2O; Almacenar a temperatura ambiente (se puede reutilizar).
    2. Preparar solución salina tamponada con Tris (TBS) con NaCl 200 mM, Tris-Base 25 mM y KCl 2,7 mM. Ajustar el pH a 8,0 y almacenar a temperatura ambiente.
    3. Preparar TBS-tween (TBST) mediante la adición de 0,5 mL / L de Tween 20 a TBS; almacenar a temperatura ambiente.
    4. Preparar sólidos de leche / TBST disolviendo 5 g de sólidos de leche en 100 mL de TBST. Almacenar a 4 ° C y utilizar en el plazo de 3 días.
    5. Preparar BSA / TBST disolviendo 3 g de albúmina de suero bovino (BSA, fracción V) en 100 ml de TBST. Almacenar a 4 ° C y utilizar en el plazo de 3 días.
  2. Protocolo.
    1. Una vez finalizada la transferencia, coloque la membrana en la solución Ponceau S para visualizar todas las proteínas transferidas. Etiquetar la posición de los marcadores en la membrana con un lápiz y documentar la membrana manchada de Ponceau-S por fotografía o escáner.
    2. Lavar la membrana 3 veces durante 10 min cada unaDe TBS bajo agitación suave.
    3. Bloquear la membrana con sólidos de leche / TBST durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche en una habitación fría con agitación suave.
    4. Lavar la membrana durante 10 min con TBST bajo agitación suave.
    5. Incubar con anticuerpo primario durante la noche en la habitación fría bajo agitación suave. Diluir el anticuerpo ( por ejemplo, 1: 1.000 para anti-ATP5A y -NDUFB6) en BSA / TBST.
      NOTA: La mayoría de los anticuerpos proporcionan una mejor señal en las membranas de los geles nativos cuando se incuban durante la noche.
    6. Lavar la membrana durante 10 min con TBST bajo agitación suave.
    7. Incubar con anticuerpo secundario durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente y agitación suave. Diluir el anticuerpo (1: 5.000 a 1: 50.000) en sólidos de leche / TBST.
    8. Lavar la membrana 3 veces durante 10 min a temperatura ambiente con TBST una agitación suave.
    9. Durante el último lavado, preparar el substrato mejorado de quimioluminiscencia (ECL) de acuerdo con las instrucciones de la manufaCturer
    10. Incube la membrana con sustrato ECL siguiendo las instrucciones del fabricante.
    11. Detectar la señal en la película utilizando las instrucciones proporcionadas por el fabricante del sustrato ECL.

5. Electroelución

  1. Preparación.
    1. Preparar un tampón de elución de tricina 25 mM, imidazol 3,75 mM (pH 7,0 a 4 ° C), y ácido 6 - aminohexanoico 5 mM.
      NOTA: Use guantes en todo momento mientras maneja el electroeluter y las tapas de la membrana para prevenir la contaminación con proteínas externas.
  2. El día antes de usar el electroeluter para la electroelución nativa, realice lo siguiente:
    1. Remoje las tapas de la membrana (corte: 3,5 kDa) en tampón de elución durante 1 h a 60 ° C. Transferir las tapas a tampón de elución fresco y dejarlas en remojo durante 12 h o más en el refrigerador.
      NOTA: Un peso molecular de corte de 3,5 kDa previene la pérdida de pRotenas que pueden disociarse fácilmente del complejo de proteínas de interés.
    2. Lave el módulo de electroeluero, los tubos de vidrio, el tanque y la tapa a fondo con etanol. Enjuague con agua y deje que el equipo se seque.
  3. El día de la electroelución nativa, haga lo siguiente.
    1. Coloque una frita en el fondo (helada) de cada tubo de vidrio para ser utilizado. Si es necesario, coloque el tubo de vidrio en tampón de elución y empuje la frita desde el interior hasta el fondo del tubo.
    2. Empuje el tubo de vidrio con la frita en el módulo del electroeluter. Humedezca el ojal con tampón de elución y deslice el tubo de vidrio en su lugar. Asegúrese de que la parte superior de los tubos de vidrio son incluso con el ojal.
    3. Cierre las arandelas vacías con tapones.
    4. Coloque una tapa de membrana húmeda en la parte inferior del adaptador de silicona y llene el adaptador con tampón de elución. Lentamente pipetee el buffer en el adaptador hacia arriba y hacia abajo para eliminar cualquier burbuja de aire alrededor de la membrana de diálisis.Li
    5. Deslice el adaptador lleno de tampón a la parte inferior del tubo de vidrio. Retire todas las burbujas que aparecen en la frita dentro del tubo de vidrio.
    6. Llenar cada tubo de vidrio con tampón de elución.
    7. Coloque las bandas escindidas de la BN PAGE en los tubos de vidrio (ver paso 1.2.9.3). Corte piezas grandes en pedazos más pequeños. Asegúrese de que la altura de llenado dentro del tubo de vidrio es de aproximadamente 1 cm.
    8. Coloque todo el módulo en el tanque.
    9. Añadir aproximadamente 600 mL de tampón de elución en frío al tanque. Asegúrese de que las tapas del adaptador de silicio estén en el buffer para evitar burbujas en la membrana de diálisis.
    10. Coloque una barra de agitación en la parte inferior del tanque.
      NOTA: La agitación evitará que las burbujas se peguen al fondo de la membrana de diálisis.
    11. Eluir las proteínas durante 4 h a 350 V en una habitación fría.
    12. Una vez completada la elución, retire el módulo de electroeluero del tanque de almacenamiento y colóquelo en un fregadero o en un recipiente.
    13. Si se utilizó un tapón, retírelo paraEn la cámara amortiguadora superior. De lo contrario, utilice una pipeta grande para eliminar el búfer.
    14. Retire el tampón de cada tubo de vidrio y deséchelo. Asegúrese de que el adaptador de silicona permanece en su lugar y de que el líquido por debajo de la frita no se altera o se sacude.
    15. Retire cuidadosamente el adaptador de silicona, junto con la tapa de la membrana de la parte inferior del tubo de vidrio. Pipetear el contenido (aproximadamente 400 μl) de la tapa de silicona en un microtubo. Con otros 200 μl de tampón de elución, enjuague el tapón de silicona y añada al microtubo. Repetir para todos los tubos de vidrio.
    16. Como las tapas de membrana pueden reutilizarse, conservar las tapas de la membrana colocándolas en tampón de elución que contiene 0,5 mg / ml de azida sódica. Refrigerarlos.
      NOTA: El eluato tiene baja concentración de proteína y puede concentrarse usando un dispositivo de filtro centrífugo.

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Resultados

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Para visualizar supercomplexos mitocondriales, se utilizaron mitocondrias recién aisladas de ratones 17 , 18 . Los supercomplejos mitocondriales son sensibles a ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que conduce a su desintegración, aunque esto puede ser tolerable para algunos investigadores. Si la congelación es necesaria para el almacenamiento, para asegurar mejores resultados, las muestras no deben someterse a má...

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Discusión

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Un ETC funcional es necesario para la generación de ATP mitocondrial. Los complejos del ETC son capaces de formar dos tipos de supercomplejos: los respirasomes (Cx-I, -III, y -IV) 1 y los sintomas (Cx-V) 2 . El montaje de cada complejo es necesario para un ETC intacto, mientras que la organización de la ETC en supercomplexes se cree que aumentar la eficiencia global ETC [ 5 , 22] . No se conocen bien cómo se montan...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de la American Heart Association Afiliado [12GRNT12060233] y el Centro de Investigación de Niños fuertes de la Universidad de Rochester.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cámara de minigel Protean IIBiorad1658004Set completo para verter y ejecutar electroforesis de mini-gel
Maxi-gel Protean XLBiorad 1653189Set completo para verter y ejecutar electroforesis de maxi-gel
Generador de degradados, Hoefer SG15VWR95044-704Vertido de degradados de minigel
Creador de degradados, maxi-gelVWRGM-100Maxi-gel de vertido gradientes
Kit de transferenciaBiorad1703930Conjunto completo para la transferencia húmeda de proteínas a membranas
Electroeluter modelo 422Biorad1652976Electroelución de proteínas a partir de páginas nativas o SDS Placas
de vidrioBiorad1653308Placas cortas
Placas de vidrioBiorad1653312Placas espaciadoras
Placas de vidrioBiorad1651823Placas interiores Placas
de vidrioBiorad1651824 Placas exteriores Fuente de
alimentaciónBiorad1645070Fuente de alimentación adecuada para electroforesis nativa
ECL-Western Thermo Scientific32209Sustrato de quimiolumniscense
SuperSignal-WestDura Thermo Scientific34075Sustrato de quimiolumniscense mejorado
Película/película de autorradiografíaGE Health Care28906845Documentación de Western blots Procesador de
película CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNAToma de fotografías para documentar geles, membranas y manchas.
Parasol de cámara Canon Power Shot 640 Canonpara fotos tomadas en una mesa de luz
Acrilamida/bisacrilamidaBiorad1610148solución premezclada al 40%
GlycineSigmaG7403
SDS (dodecil sulfato de sodio)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Tampón
TricineSigmaT0377
Desoxiquelato de sodioSigmaD66750Detergente
EDTASigmaE5134
SacarosaSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Tampón
ImidazolSigmaI15513Tampón
Lauril maltósidoSigmaD4641Detergente
Coomassie G250Biorad161-0406
Ácido aminohexanoicoSigmaO7260
Nativo  kit de peso molecularGE Cuidado de la salud 17-0445-01 Kit decalibración de alto peso molecular para electroforesis nativa.
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazolioSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   SigmaA2383
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Lead(II) nitrato (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomicinaSigmaO4876
NombreCompany>Número de catálogoComments
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748anticuerpo contra la subunidad ATP sintasa ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244anticuerpo contra la subunidad Cx-1 NDUFB6
anti-VDACCalbiochem529534anticuerpo contra el VDAC
ECL anticuerpo ligado a HRPGE Health CareNA931Vanticuerpo secundario contra ATP5A, NDUFB6 y VDAC
Reactivo bloqueanteBiorad170-6404
BSA
cloruro de sodioSigmaS9888
cloruro de potasioSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Silver staining KitInvitrogenLC6070
Cámara blindada

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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