La perfusión como un método para la visualización vascular Ambystoma mexicanum

Resumen

Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura.

Resumen

Las técnicas de perfusión se han utilizado durante siglos para visualizar la circulación de los tejidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) es una especie de salamandra que ha surgido como un modelo esencial para los estudios de regeneración. Poco se sabe acerca de cómo se produce la revascularización en el contexto de la regeneración en estos animales. Aquí presentamos un método simple para la visualización de la vasculatura en axolotl vía perfusión de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI). DiI es un colorante de carbocianina lipofílico que se inserta en la membrana plasmática de las células endoteliales instantáneamente. La perfusión se realiza usando una bomba peristáltica de tal manera que DiI entra en la circulación a través de la aorta. Durante la perfusión, el colorante fluye a través de los vasos sanguíneos del axolotl e incorpora en la bicapa lipídica de las células endoteliales vasculares al contacto. El procedimiento de perfusión dura aproximadamente una hora para un axolotl de ocho pulgadas. Inmediatamente después de la perfusión,Th DiI, el axolotl se puede visualizar con un microscopio confocal fluorescente. El DiI emite luz en el rango naranja-rojo cuando se excita con un filtro fluorescente verde. Este procedimiento de perfusión DiI puede usarse para visualizar la estructura vascular de los axolotes o para demostrar patrones de revascularización en tejidos regeneradores.

Introducción

La visualización de la vasculatura desempeña un papel vital en la comprensión de la estructura y función de los organismos a través de muchas especies. A partir ^del siglo XVI con Leonardo da Vinci, se han estudiado modelos y representaciones gráficas de la circulación ¹ . Usando ceras y moldes de caucho, los tejidos fueron perfundidos para crear modelos tridimensionales de la vasculatura, lo que permitió el estudio de la organogénesis y la patogénesis [ ^{1 , 2]} . Las resinas y las ceras se colorearon con tintes tales como tinta India o rojo carmín para permitir su fácil visua....

Protocolo

Todos axolotl experimentación se realizó de acuerdo con Brigham y Women's Hospital (BWH) Institucional Cuidado de Animales y el Comité de Uso.

1. Configure Experimento de Perfusión

1. Coloque un axolotl adulto en un recipiente de plástico lleno de solución de tricaína al 0,1% (MS222) durante 15-20 min o hasta anestesiar completamente. Asegúrese de que el recipiente esté lleno de suficiente solución de tricaína de modo que el axolotl esté completamente sumergido.
   Nota: Todos los procedimientos deben realizarse de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado de los animales. En BWH, un axolotl se considera anestesiad....

Resultados

Con la tinción DiI, la vasculatura del axolotl se puede visualizar fácilmente. Los vasos sanguíneos de los animales perfundidos con el colorante lipófilo son inmediatamente visibles bajo un microscopio fluorescente confocal. La figura 1 .1-1.5 es una representación esquemática del protocolo de perfusión. Después de la perfusión con el colorante rosa brillante, un axolotl perfectamente perfundido aparecerá rosa. Usando un filtro fluorescente .......

Discusión

La visualización de la vasculatura del axolotl puede lograrse con éxito mediante la perfusión con el colorante de carbocianina lipófilo, DiI. En este estudio se describe un nuevo protocolo para la perfusión del axolotl con DiI utilizando una bomba peristáltica. También se muestra la posterior visualización de la vasculatura axolotl utilizando un microscopio confocal fluorescente. Este protocolo fue una adaptación del protocolo de perfusión DiI de roedor observado en Li et al. ⁷ , sin emb.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba peristáltica	Marshall Scientific	RD-RP1
Tubo de perfusión	Excelon Lab & Tubo de vacío	436901705	tamaño S1A
27g aguja de mariposa	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Agua
HCl AmericanBio		7647-01-0
Glucosa	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′- perclorato de tetrametilindocarbocianina	Sigma Aldrich	468495
Etanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Foreceps quirúrgicos	Medline	MDG0748741
Marco de espuma de poliestireno	cualquier cuadrado
Tijeras quirúrgicas	Medline	DYND04025
Bisturí	Medline	MDS15210
Almohadilla absorbente	Avacare Medical	PKUFSx
Toallas de papel Pipeta
de transferencia desechable estándar	Fisherbrand	50216954
Soporte de abrazadera	Adafruit	291
Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine polvo
Ajolote
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Tanques de			Tamaño variable apropiado para el ajolote
Paraformaldehído	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Microscopio Leica Leica		M165 FC
ET-CY3 Filtro fluorescente	Leica	M205FA/M165FC
MS-222