Preparación de vesículas de membrana plasmática de células madre mesenquimales de médula ósea para terapia potencial de reemplazo de citoplasma

Resumen

Enfermedades relacionadas con la edad se asocian con múltiples defectos en los componentes del citoplasma. Aquí, presentamos un protocolo para preparar vesículas de membrana plasmática de células madre mesenquimales de médula ósea. Esta técnica podría utilizarse potencialmente como medio de terapia de reemplazo del citoplasma para mejorar o incluso revertir los fenotipos asociados a la edad.

Resumen

Hemos informado anteriormente sobre la generación de vesículas de membrana plasmática (PMVs) a través de la extrusión mecánica de células de mamíferos. La fusión de PMVs con células Rho0 deficientes mitocondriales restauró la actividad mitótica en condiciones normales de cultivo. La aterosclerosis, la diabetes tipo 2, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer son enfermedades relacionadas con la edad que se ha informado que están asociadas con múltiples defectos mecánicos y funcionales en el citosol y organelos de una variedad de tipos celulares. Las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC) representan una población celular única de la médula ósea que posee capacidades de auto-renovación mientras mantiene su multipotencia. La suplementación de células de senescencia con citoplasma joven de BMSC autóloga a través de la fusión de PMVs proporciona un enfoque prometedor para mejorar o incluso revertir los fenotipos asociados a la edad. Este protocolo describe cómo preparar PMVs de BMSCs a través de la extrusión a través de una membrana de policarbonato con 3Determinan la existencia de mitocondrias y examinan el mantenimiento del potencial de membrana dentro de PMVs usando un microscopio confocal, concentran PMVs por centrifugación y llevan a cabo la inyección in vivo de PMVs en el músculo gastrocnemio de ratones.

Introducción

Se ha dedicado una tremenda cantidad de esfuerzo a establecer enfoques para terapias de reemplazo de genes, enzimas y células. Esto ha dado lugar a grandes avances e incluso aplicaciones clínicas ^{1 , 2 , 3} . Recientemente, una terapia de reemplazo de mitocondrias polémica basada en la tecnología de transferencia de núcleo se aplicó a la fecundación in vitro para las mujeres de edad avanzada o portador de una mutación mitocondrial letal del ADN [ ^4] . Los defectos encontrados en enfermedades relacionadas con la edad, como la ate....

Protocolo

Se compraron ratones BALB / c de 8 a 12 semanas de edad de Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China) y se criaron en una instalación de animales específicos libres de patógenos y con aire acondicionado. El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales cumplieron con las directrices para el uso y cuidado de animales de laboratorio establecidos por la Universidad de Shantou.

1. Montaje del aparato

1. Para asegurar la esterilidad, encienda la luz UV de una campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos antes de usar.
2. Desatornille una unidad de filtro desechable de 25 mm y sumerja la tapa y el fon....

Resultados

La clave para una preparación exitosa de los PMVs depende en gran medida del montaje correcto de la unidad de filtro ( Figura 1 ), que se puede probar empujando 1 mL de PBS a través de la membrana. Si se produce una fuga, vuelva a montar la unidad de filtro y vuelva a probar. Sin embargo, la fuga sólo se puede probar confiablemente cuando las células son empujadas a través de la membrana. Si sólo se detectan unos PMVs bajo un microscopio regular usando el objetivo 10X, o.......

Discusión

La terapia de reemplazo de citoplasma como se propone en este manuscrito tiene ventajas únicas sobre otros enfoques informados, como la terapia génica, molecular y celular. Los PMV generados a partir de BMSC encapsulan no solo los productos de los genes de stemness, sino también los orgánulos celulares intactos, que son esenciales para remediar los fenotipos de envejecimiento asociados con la senescencia. Cuando el citoplasma joven se entrega a las células senescentes, los mecanismos de mal funcionamiento pueden obtener .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Membranas IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	3 mm de poro
Unidad de filtro desechable	Xinya, Shanghai, China	25 mm	Polipropileno de grado médico
Jeringa de insulina	BD 328446		1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
Sondas moleculares	MitoTracker	M7514	verde FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75.000
Microscopio de fluorescencia	Nikon	Eclipse TE 2000	con cámara CCD
Microscopio Confocol	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	para la transfección celular