Presentamos dos protocolos de sincronización celular que proporcionan un contexto para el estudio de eventos relacionados con fases específicas del ciclo celular. Mostramos que este enfoque es útil para analizar la regulación de genes específicos en un ciclo celular no perturbado o en la exposición a agentes que afectan el ciclo celular.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El programa de expresión génica del ciclo celular representa un paso crítico para comprender los procesos dependientes del ciclo celular y su papel en enfermedades como el cáncer. El análisis de expresión de genes regulado por el ciclo celular depende de la sincronización celular en fases específicas. Aquí se describe un método que utiliza dos protocolos de sincronización complementarios que se utiliza comúnmente para estudiar la variación periódica de la expresión génica durante el ciclo celular. Ambos procedimientos se basan en el bloqueo transitorio del ciclo celular en un punto definido. El protocolo de sincronización mediante el tratamiento con hidroxiurea (HU) conduce a la detención celular en la fase tardía G1 / S temprana, y la liberación de la detención mediada por HU proporciona una población celular que progresa uniformemente a través de S y G2 / M. El protocolo de sincronización mediante el tratamiento con timidina y nocodazol (Thy-Noc) bloquea células en mitosis temprana y la liberación de la detención mediada por Thy-Noc proporciona una población celular sincronizada adecuada para la fase G1 y la fase SIntente estudios La aplicación de ambos procedimientos requiere la monitorización de los perfiles de distribución del ciclo celular, que se realiza típicamente después de la tinción con yoduro de propidio (PI) de las células y el análisis mediado por citometría de flujo del contenido de ADN. Se muestra que el uso combinado de dos protocolos de sincronización es un enfoque robusto para determinar claramente los perfiles transcripcionales de los genes que se regulan diferencialmente en el ciclo celular ( es decir, E2F1 y E2F7), y por lo tanto para tener una mejor comprensión de su papel en el ciclo celular Procesos. Además, se demuestra que este enfoque es útil para el estudio de los mecanismos subyacentes a las terapias basadas en fármacos ( es decir, la mitomicina C, un agente anticancerígeno), ya que permite discriminar los genes que responden al agente genotóxico de los afectados exclusivamente por las perturbaciones del ciclo celular Impuesto por el agente.
Introducción
La transición a través de todas las fases del ciclo celular se acopla a un programa de expresión génica fuertemente regulado. Se supone que esta coordinación "en y fuera" de la transcripción de genes a lo largo del ciclo celular está bajo el control de sistemas reguladores transcripcionales complejos, regulando no sólo el momento sino también los niveles de expresión génica. Se sabe que la desregulación de los componentes clave del ciclo celular contribuye al desarrollo de varias enfermedades y es un sello bien establecido de la tumorigénesis 1 , 2 . Los análisis transcriptómicos de todo el genoma llevados a ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Sincronización Celular, Liberación y Monitoreo de la Progresión del Ciclo Celular
- Timidina y nocodazol (Thy-Noc) sincronización y liberación de células U2OS de la mitosis
- Preparar el medio de cultivo celular requerido. Las células U2OS se cultivan rutinariamente en medio DMEM-Glutamina complementado con FBS al 10% (vol / vol) (opcional: penicilina al 1% / estreptomicina). Realizar toda la preparación y manipulación del medio en condiciones estériles y calentar el medio complementado (de ahora en adelante denominado "medio completo") a 37 ° C antes de su uso.
- Sembrar 2 x 106 células U2OS por placa de 100 mm en 10 ml de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Representación esquemática de los protocolos Thy-Noc y HU para la sincronización celular.
La Figura 1 resume los pasos requeridos para la sincronización de células U2OS y la posterior recogida de muestras con el fin de verificar la progresión a través del ciclo celular y realizar análisis de expresión génica.
Phospho-H3 y tinción PI son buenos parámetros .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El análisis de la regulación fina de los genes regulados implicados en papeles transitorios y específicos en el ciclo celular requiere una población celular uniforme. Muchos investigadores usan rutinariamente líneas de células tumorales establecidas desde hace mucho tiempo para estos propósitos, y se han desarrollado una variedad de métodos para obtener poblaciones de células síncronas (o parcialmente sincrónicas), con el objetivo de acumular tantas células como sea posible en fases definidas de ciclo celular. Además, s.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros de los laboratorios Zubiaga y Altmeyer por sus útiles debates y por su apoyo técnico. Este trabajo ha contado con el apoyo del Ministerio Español (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), el Gobierno Vasco (IT634-13 y KK-2015/89) y la Universidad del País Vasco UPV / EHU UFI11 / 20).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM, glucosa alta, suplemento GutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, calificado, aprobado por la UE, origen de América del Sur | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Tripsina-EDTA (1x), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Recién preparado. Un ligero calentamiento podría ayudar a disolver la timidina. |
| Nocodazol | SIGMA | M-1404 | Solución madre en DMSO almacenada a -20 º C en pequeñas alícuotas |
| Hidroxiurea | SIGMA | H8627 | Mitomicina C recién preparada |
| de Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1,5 mM solución madre en H2O estéril protegida de la luz y almacenada a 4 º C |
| Dimetilsulfóxido | SIGMA | D2650 | |
| Yoduro de propidio | SIGMA | P4170 | Solución madre en PBS estéril a 5 mg/ml, almacenado a 4 º C protegido de la luz. |
| PBS pH 7.6 | Etanol casero | ||
| PANREAC | A3678,2500 | ||
| Cloroformo | SIGMA | C2432 | |
| Citrato de sodio | PANREAC 131655 | ||
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| ARNasa A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Reactivo | TRIzolLifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 Anti-Cyclin E1 | Cell Signaling | 4129 | dilución 1:1000 en leche al 5%, o/n, 4 º C |
| Anticiclina B1 anticuerpo | Cell Signaling | 4135 | dilución 1:1000 en leche al 5%, o/n, 4 º C |
| Anti-β-actina | SIGMA | A-5441 | dilución 1:3000 en leche al 5 %, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Especificado en el protocolo |
| Anticuerpo anti-conejo AlexaFluor 488 | Invitrogen | R37116 | Especificado en el protocolo |
| Anticuerpo secundario anti-ratón-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | Dilución 1:3000 en leche al 5 %, 1 hora, |
| anticuerpo RT Forward E2F1 (humano) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Anticuerpo E2F1 inverso (humano) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 anticuerpo (humano) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Anticuerpo E2F7 inverso (humano) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 anticuerpo (humano) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverso p21Cip1 anticuerpo (humano) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (humano) gen de referencia | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Anticuerpo TBP inverso (humano) | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L anticuerpo (humano) gen de referencia CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Diseñado por la herramienta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Oxa1L inverso anticuerpo (humano) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Diseñado por PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Placa de reacción óptica de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100 mm Placa de cultivo con TC | Corning | ||
| Corning Costar placas de cultivo celular Corning 3506 de 6 pocillos | Microcentrífuga | 3506 | |
| Eppendorf | 5415 R | ||
| centrífuga refrigerada de sobremesa Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite espectrofotómetro | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur citómetro de flujo | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Sistema de PCR en tiempo real | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
Referencias
- Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
- Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
- Cho, ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
