Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de Rhipicephalus microplus Células epiteliales intestinales

Resumen

Se utilizó una metodología basada en gradiente de densidad de densidad modificada para aislar células epiteliales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus . Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y se purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones aguas abajo.

Resumen

Rhipicephalus microplus es el ectoparásito más significativo en términos de impacto económico en el ganado como vector de varios patógenos. Se han dedicado esfuerzos al control de garrapatas para disminuir sus efectos deletéreos, centrándose en el descubrimiento de vacunas candidatas, como la BM86, localizada en la superficie de las células epiteliales de la garrapata. La investigación actual se centra en la utilización de cDNA y bibliotecas genómicas, para seleccionar otras vacunas candidatas. El aislamiento de las células intestinales de garrapatas constituye una ventaja importante en la investigación de la composición de las proteínas de superficie sobre la membrana de las células del intestino de garrapatas. Este trabajo constituye un método novedoso y factible para el aislamiento de células epiteliales, a partir de los contenidos de intestino de garrapata de R. microplus. Este protocolo utiliza TCEP y EDTA para liberar las células epiteliales de los tejidos de soporte subepiteliales y un gradiente de densidad discontinua gradieNt para separar las células epiteliales de otros tipos de células. Las proteínas de la superficie celular fueron biotiniladas y aisladas de las células epiteliales de la tripa de la garrapata, usando perlas magnéticas unidas a estreptavidina permitiendo aplicaciones posteriores en análisis FACS o LC-MS / MS.

Introducción

Rhipicephalus microplus es la ectoparásita más significativa en términos de impacto económico en la industria ganadera de las regiones tropicales y subtropicales, ya que vectores de la fiebre de la garrapata bovina (babesiosis), la anaplasmosis y la piroplasmosis equina ^{1 , 2 , 3 , 4} . Sin embargo, los métodos convencionales como el uso de acaricidas químicos tienen inconvenientes implícitos, como la presencia de residuos químicos en la leche y la carne, y el aumento de la prevalencia de garrapatas químicamente resistentes ^{5 , 6 , 7} . En consecuencia, se ha estudiado el desarrollo de métodos alternativos de control de garrapatas, como el uso de resistencia natural bovina, el control biológico (biopesticidas) y la vacunaInes ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

En la búsqueda de proteínas capaces de ser utilizadas como vacunas candidatas, la investigación actual se centra en la garrapata intestinal. La pared del intestino medio se construye a partir de una sola capa de células epiteliales descansando sobre una fina lámina basal, con el exterior de la lámina basal formando una red de músculos. Las observaciones del microscopio electrónico y de luz indican que el intestino medio consiste en tres tipos de células: reserva (indiferenciada), secretora y digestiva. El número de tipos de células varía considerablemente dependiendo de la fase fisiológica. Las células secretoras y digestivas proceden de células de reserva ^{18 , 19 , 20} .

La construcción de bibliotecas de cDNAPara examinar la composición de la tripa de la garrapata ha llevado a la identificación de proteínas antigénicas, como Bm86, como potencial vacuna candidatos ^{2 , 3 , 4} . La glicoproteína Bm86 se localiza en la superficie de las células de la garrapata e induce una respuesta inmune protectora contra la garrapata del ganado vacuno ( R. microplus ). Las IgG anti-Bm86 producidas por el huésped inmunizado son ingeridas por la garrapata, reconocen este antígeno en la superficie de las células del intestino de garrapatas y, posteriormente, alteran la función e integridad del tejido del intestino de garrapata. Las vacunas basadas en antígenos Bm86 han mostrado un control efectivo de R. microplus y Rhipicephalus annulatus, al reducir el número, el peso y la capacidad reproductora de las hembras engorciadoras, lo que resulta en una infestación larval reducida en las generaciones subsiguientes de garrapatas ⁴ . Sin embargo, las vacunas basadas en Bm86 no son eficaces contra todas lasDemostró una eficacia insatisfactoria frente a algunas cepas geográficas de R. microplus , por lo que las industrias lecheras y de vacuno han adoptado mal estas vacunas ^{2 , 4} .

La capacidad de aislar las células epiteliales de la tripa de la garrapata es una innovación significativa que permitiría la progresión de la investigación para determinar la composición de la membrana de proteínas, incluyendo la morfología y la fisiología en diferentes condiciones ambientales. El método aquí descrito utiliza el agente quelante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el agente reductor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para liberar el epitelio de sus tejidos de soporte subepitelial ¹⁰ . El epitelio se recupera tras la interrupción mecánica de los tejidos por agitación, seguido de centrifugación discontinua en gradiente en Percoll. Este artículo describe una técnica factible y novedosa para el aislamiento de la epi de garrapatasLas células celulares. Las proteínas de superficie celular biotiniladas, aisladas de la superficie de estas células epiteliales pueden analizarse subsiguientemente en aplicaciones aguas abajo tales como análisis FACS y / o LC-MS / MS.

Protocolo

1. Disección del epitelio intestinal de R. microplus

1. Recoger las garrapatas semi-engorged de ganado en el día del experimento. Diseccionar las garrapatas dentro de las 24 h después de la remoción del huésped.
2. Adhiera una tira de cinta adhesiva al fondo de la placa de Petri de 92 mm x 16 mm. Añadir una gota de super pegamento a la cinta. Coloque la garrapata, lado ventral hacia abajo sobre el super pegamento, deje que se seque durante 2 min.
3. Verter 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la placa de Petri, o hasta que la garrapata esté completamente sumergida.
4. Utilizando un bisturí de tamaño 11, corte desde la parte superior de los ojos hasta los festones inferiores, a ambos lados de la garrapata.
5. Usando fórceps estériles, quite completamente el scutum y alloscutum , para exponer los órganos internos.
6. Retire los órganos finos como rosca blanca (tráquea) y otras membranas para prevenir la contaminación.
7. Quitar el intestino usando fórceps, pinzando la región superior y tirando de lacuerpo. Quite cualquier resto de tejido intestinal, asegurando que no se han disecado otros tejidos.
8. Guarde el intestino en una solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) helada sin cloruro de calcio y sulfato de magnesio con un cóctel inhibidor de proteinasa (PIC). Snap congelar las tripas en hielo seco y guardar a -20 ° C.
   Nota: Para ayudar con la disección intestinal y los detalles de los órganos internos de la garrapata, consulte el Capítulo 3.1 de D. Sonenshine, "Biology of Ticks" ¹⁹ .

2. Disociación de células epiteliales

1. Vierta el intestino diseccionado en un colador de células de 70 μm dentro de un tubo de 50 ml.
2. Enjuague el tejido intestinal con 50 mL de HBSS helado con PIC hasta que la solución se aclare y las tripas tomen un aspecto blanco / transparente.
3. Vuelva a suspender las tripas en 30 mL de HBSS frío con hielo con PIC, mezclar suavemente y centrifugar a 500 xg a 4 ° C durante 10 minutos para sedimentar el intestino. Retire el sobrenadante y repita el proceso de lavado tres veces.
5. Filtrar la suspensión a través de un colador de células de 250 μm, vórtice el flujo a través y filtrar a través de un colector de células de 70 μm recolectando el flujo de flujo restante.
6. Centrifugar la suspensión a 500 xg a 4 ° C durante 20 minutos para sedimentar las células individuales.

3. Aislamiento de células epiteliales simples usando un gradiente de densidad de centrifugación

1. Preparar el gradiente de densidad de centrifugación ( por ejemplo , Percoll) filtrando a través de un papel pre-filtro AP15. Preparar 40% y un 20% Percoll en mqH ₂ 0 (v / v) y enfriar a 4 ° C durante 1 h antes de la capa del gradiente.
2. Utilizando un sistema peristálticoBomba ajustada a la velocidad más baja, aplicar 3 mL de gradiente de concentración de densidad al 40% en un tubo de ultracentrífuga de 16 mL, dejándolo reposar en hielo durante 15 min. La velocidad de la bomba debe conducir a un caudal <1 ml por minuto.
3. Inclinando el tubo a un ángulo de 45 °, utilice la bomba peristáltica para cubrir el gradiente de centrifugación de 20% de densidad sobre la capa de 40%. La velocidad de la bomba debe conducir a <1 ml por minuto de caudal. Deje que las capas se depositen en hielo durante 15 min.
4. Utilice la bomba peristáltica a una velocidad de flujo de <1 ml por minuto a la capa 3 ml de medio DMEM que contiene células intestinales de garrapatas sobre el gradiente de 20-40% de densidad de centrifugación.
5. Programe la centrífuga para obtener una aceleración máxima y una desaceleración mínima. Centrifugar a 600 xg durante 10 min. Recoja las interfases entre el gradiente de DMEM: 20% de densidad y los gradientes de centrifugación de 20%: 40% de densidad para aislar células individuales epiteliales. Almacene las interfases recogidas a 4 ° C para los análisis posteriores.

4. Evaluación del aislamiento celular

1. Hemocitómetro
   1. Limpie la diapositiva del hemocitómetro con alcohol.
   2. .Re-suspende las células pipeteando suavemente las células hacia arriba y hacia abajo. Pipetear 100 μl de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Añadir 400 μl de azul Trypan al 0,4%. Mezcle suavemente agitando el tubo.
   4. Pipetear 100 μl de la suspensión de células tratadas con Blue Trypan para llenar lentamente ambas cámaras del hemocitómetro.
   5. Coloque el hemocitómetro bajo un microscopio óptico, centrándose en las líneas de cuadrícula del hemocitómetro con un objetivo de 10X.
   6. Utilizando un contador de recuento manual, cuente las células vivas no teñidas dentro de un conjunto de 16 cuadrados. Dentro de la misma plaza, cuente las células muertas de color azul. Continúe contando hasta que se cuenten cuatro series de 16 cuadrados.
   7. Calcular las células totales por ml usando la fórmula:
      47eq1.jpg "/>
   8. Calcular el porcentaje de viabilidad celular usando la fórmula:
      
2. Visualización de aislamiento celular
   1. Diluir 1 μl de las células aisladas en 9 μl de HBSS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agite suavemente el tubo de microcentrífuga para mezclar.
   2. Pipetear 5 μl de células aisladas en HBSS en el centro de un portaobjetos de vidrio. Aplicar tres gotas de medio de montaje con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
   3. Incubar el portaobjetos a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque cuidadosamente una cubierta sobre la preparación, evitando burbujas de aire.
   4. Visualizar células teñidas con DAPI a 360 nm de excitación y emisión a 460 nm bajo un microscopio fluorescente.

5. Biotinilación de Proteínas de Superficie Celular

1. Biotinilato 100 μL de células epiteliales de célula única usando Biotina (Tipo A) ConjugaciónKit, en una proporción molar de proteína de superficie 1: 1 para conjugar, según las instrucciones del fabricante
2. Para la lisis celular, añadir 100 μL de PBS, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, 100 μM de glutatión oxidado y PIC a las células biotiniladas. Incubar en hielo durante 1 h con una mezcla suave cada 10 min.
3. Centrifugar las células biotiniladas a 20.000 xg a 4 ° C durante 20 minutos para sedimentar el material insoluble. Recoger el sobrenadante que contiene proteínas de membrana citoplásmicas y biotiniladas.
4. Determine la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford.

6. Aislamiento de proteínas de superficie biotiniladas

1. Agregue 50 μL de Perlas Magnéticas de Estreptavidina en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Coloque el tubo en un soporte magnético, recogiendo las perlas contra el lado del tubo. Eliminar y desechar el sobrenadante.
3. Añadir 1000 μl de TBS, 0,1% de Tween-20 al tubo. Mezclar suavemente y recoger las perlas con el stan magnéticore. Eliminar y desechar el sobrenadante.
4. Combinar 40 μg de proteínas de superficie celular biotiniladas, diluidas a 300 μl en 1x PBS con perlas magnéticas lavadas. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente con agitación.
5. Recoger las perlas con un soporte magnético, eliminar y descartar el sobrenadante.
6. Añadir 300 μl de TBS, 0,1% de Tween-20 al tubo, mezclando suavemente para volver a suspender las perlas. Recoger bolas, eliminar y desechar el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.
7. Añadir 100 μl de glicina 0,1 M pH 2,0 a las perlas magnéticas, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Recoger bolas y eliminar el sobrenadante que contiene proteínas de superficie biotiniladas eluidas.
8. Visualizar las proteínas de superficie aisladas en un gel SDS-PAGE Tris-MOPS al 4-20%.

7. Evaluación de la proteína de superficie biotinilada

1. Mancha de puntos
   1. Corte una tira de membrana de nitrocelulosa de 7 cm x 3 cm.
   2. Aplicar 10 μg de garrapata totalT (de 1,8 anterior), y 10 μg de proteína de superficie biotinilada a la membrana. Dejar secar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   3. Transferir a un recipiente y sumergirlo en 100 ml de tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente con agitación durante una hora. Descartar el buffer de bloqueo.
   4. Lavar la membrana de nitrocelulosa en 100 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 minutos con agitación. Deseche el tampón de lavado y repita los lavados por tres veces.
   5. Incubar en 1/5000 Streptavidin-peroxidasa de rábano picante (HRP) en 100 μL de PBS, Tween-20 al 0,05% durante 2 h con agitación a temperatura ambiente, y descartar cualquier solución restante.
   6. Lavar la membrana de nitrocelulosa en 100 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 minutos con agitación. Deseche el tampón de lavado y repita el lavado tres veces.
   7. Para la detección, disolver 1 comprimido de 4-cloro-1-naftol en 10 ml de metanol enfriado con hielo. Añadir 4 ml de concentrado de metanol a 20 ml de TBS. Añadir 10 μl de peróxido de hidrógeno al 30% fresco yLa membrana de nitrocelulosa.
   8. Incubar con agitación a temperatura ambiente hasta que el sustrato produzca un producto final azul insoluble. Esto puede tomar entre 2-15 min.
   9. Desechar la solución de detección y lavar la membrana tres veces en 100 μL mqH ₂ O.
2. Ensayo ELISA
   1. Diluir 200 ng de cada muestra con 400 μl de tampón de revestimiento de carbonato 100 mM y cubrir 2 carriles de la primera fila (A #) de la placa ELISA (pocillos de fondo plano)
   2. Añadir 100 μl de tampón de revestimiento de carbonato 100 mM a todos los demás pocillos correspondientes en filas (BH).
   3. Preparar diluciones en serie de cada muestra pipeteando 100 μL de cada pocillo en la fila A y transfiriéndolo a la fila B. Mezcle suavemente pipeteando y evite producir burbujas. Repetir las diluciones en cada fila, descartando los 100 μL finales de cada pocillo en la hilera H.
   4. Cubrir la placa con parafilm e incubar a 4 ° C durante la noche.
   5. Lavar la plataformaE con 200 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 por pocillo tres veces.
   6. Añadir 200 μl de tampón de bloqueo a los pocillos revestidos, cubrir con Parafilm e incubar a 4 ° C durante la noche.
   7. Diluir 1 / 15.000 Streptavidin-HRP en tampón de bloqueo y añadir 100 μL a cada pocillo de la placa. Cubrir con parafilm e incubar a 4 ° C durante la noche.
   8. Lave la placa en 200 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 por pocillo cinco veces.
   9. Para detectar, añada 100 μl de reactivo TMB por pocillo. Después de suficiente desarrollo del color, usualmente entre 10-15 minutos, agregue 100 μl de ácido fosfórico 1 M para detener la reacción.
   10. Leer la absorbancia de cada pocillo a λ = 450nm.

Resultados

Se aislaron células epiteliales de los tejidos intestinales de R. microplus según el esquema presentado en la Figura 1 . Las imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de las células epiteliales de la tripa de la garrapata preparadas usando este protocolo se muestran en la Figura 2A Y 2B. Como el aislamiento celular se realiza sobre ...

Discusión

Las infestaciones de garrapatas de ganado constituyen un problema importante para la industria ganadera en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, con el método de control más común dependiente del uso de acaricidas ^{1 , 4} . Bm86 fue identificado previamente dentro de la superficie epitelial del intestino de garrapata como un antígeno protector contra la infestación ^de R. microplus ¹⁰ , con éxito...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,4% Azul Trypan	ThermoFisher Scientific	15250061
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	3322
		carbonato de 100 mM	3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml de agua destilada pH 9,6
Tubos de centrífuga de 16 ml con tapa de sellado	Thermo Scientific	3138-0016	Enfriar en hielo antes del gradiente
250 y micro; M filtro de celdas	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetrametilbencidina (TMB) Sistema de sustrato líquido para ELISA	Sigma	T0440	almacenado a 4C
30% peróxido de hidrógeno	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-cloro-1-naftol tableta	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Tubo Halcón	Corning Azul		30 x 115mm estilo. Tubo cónico de polipropileno.
70 y micro; M filtro de células	BD Falcon	352350
AP15 papel de filtro	Millipore	AO1504200
Biotina (Tipo A) Kit de conjugación	Abcam	Ab102865
Microscopio de disección	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Software de imágenes celulares
Cinta adhesiva	Home Handyman		48 mm x 25 mm Cinta adhesiva
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - helado para el protocolo
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Microscopio de fluorescencia	Olimpo	BX51
Fluoroshield con DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML
Pinzas	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glicerol para biología molecular >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Mostrador de mano	Officeworks	JA0376230
Hank' s Solución salina equilibrada	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – hielo frío para protocolo
Hemacitómetro	Optik Lakor	-
L-Glutatión oxidado	Sigma-Aldrich	G4376
Soporte de separación magnética	Novagen-4-Tubo		Estante de separación magnética
Metanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Sistema integral de purificación de agua para agua ultrapura
Membrana de nitrocelulosa Life	Sciences	66485	Membrana de nitrocelulosa pura de 30 cm x 3 m
PageRuler Escalera de proteínas preteñidas	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml de agua destilada) pH 7,4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Bomba peristáltica	Masterflex	7518-10
Ácido fosfórico	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce T20 PBS sin proteínas T20 tampón de bloqueo	Thermo-Scientific	37573	almacenado a 4C. Tampón de bloqueo
Cóctel de inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – almacenado a -20 ° C
Reactivo de tinte Bradford de inicio rápido 1x	Biorad	500-0205	para Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standards for Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrífuga	Thermo Scientific	46910
Estreptavidina (HRP)	Abcam	AB7403
Estreptavidina Perlas Magnéticas	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Rápido Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Mini
Centrífuga de Mesa	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Mezclador de vórtice	Ratek	VM1
Baño de agua	Grant	GD100