Este artículo presenta una pantalla de estrógeno levadura optimizado para la cuantificación de ligandos en productos de Cuidado Personal (PCP) que se unen de estrógenos receptores alfa (ERα) o beta (ERβ). El método incorpora dos opciones de sustrato colorimétrico, una incubación refrigerada de seis días para su uso en cursos de pregrado y herramientas estadísticas para análisis de datos.
Artículo de método
Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado
En este artículo
Resumen
Resumen
La pantalla de estrógeno de levadura (YES) se utiliza para detectar ligands estrogénicas en muestras ambientales y ha sido ampliamente aplicado en los estudios de disrupción endocrina. Ligandos estrogénicos incluyen tanto naturales como provocados por el hombre "los estrógenos medioambientales" (EEE) en muchos bienes de consumo, incluyendo productos de Cuidado Personal (PCP), plásticos, plaguicidas y alimentos. EEs interrumpen hormona de señalización en los seres humanos y otros animales, potencialmente reduciendo la fertilidad y aumento de riesgo de la enfermedad. A pesar de la importancia de EEs y otros químicos interrupción endocrina (EDCs) para la salud pública, disrupción endocrina por lo general no está incluido en los programas de pregrado. Esta deficiencia en parte debido a la falta de actividades de laboratorio relevantes que ilustran los principios participa al mismo tiempo accesible a estudiantes de pregrado. Este artículo presenta una optimizada sí para la cuantificación de ligandos en productos de cuidado personal que se unen de estrógenos receptores alfa (ERα) o beta (ERβ). El método incorpora uno de los dos sustratos colorimétricos (Orto- nitrofenil-β-D-galactopiranosida (ONPG) o clorofenol rojo-β-D-galactopiranosida (CPRG)) que están divididos por β-galactosidasa, una incubación de 6 días refrigerada paso a facilitar el uso en cursos de pregrado laboratorio, una aplicación automatizada para cálculos de LacZ y código de R para el análisis de regresión logística de 4 parámetros asociados. El protocolo ha sido diseñado para permitir a estudiantes a desarrollar y llevar a cabo experimentos en que pantalla de productos de su elección para imitadores de estrógeno. En el proceso, aprenden sobre la disrupción endocrina, cultivo celular, atascamiento del receptor, la actividad enzimática, genética, estadística y diseño experimental. Al mismo tiempo, también practican destrezas de laboratorio fundamental y ampliamente aplicables, tales como: cálculo de concentraciones; fabricación de soluciones; demostrando una técnica estéril; dilución en serie de normas; construcción e interpolando curvas estándar; identificación de variables y controles; recoger, organizar y analizar datos; construir e interpretar gráficos; y el uso de equipo de laboratorio común como micropipettors y espectrofotómetros. Por lo tanto, aplicar este ensayo anima a los estudiantes a participar en el aprendizaje basado en la investigación mientras que la exploración de cuestiones emergentes en ciencias ambientales y salud.
Introducción
La pantalla de estrógeno de levadura (YES) es ampliamente utilizado para cuantificar ligandos que imitan el estradiol (E2 o 17β-estradiol) en una variedad de matrices, incluyendo agua, tejidos vegetales, productos de consumo y alimentos1,2,3, 4. Colectivamente, estos ligandos se llaman "Los estrógenos medioambientales (EEs)." El sí fue desarrollado originalmente como un bajo costo, alternativa en vitro en vivo pruebas como análisis de lo roedor uterotrophic5,6 y la trucha de arco iris alimentación ensayo7. El objetivo de estas pruebas es determinar si un producto contiene sustancias químicas que estimulan o bloquean mecanismos dependientes de estrógenos. Detección de EEs es crítica, ya que pueden interferir con estrógenos endógenos normales de señalización, especialmente durante el desarrollo fetal. Esta interferencia compromete salud aumentando el riesgo de obesidad, infertilidad, cáncer y pérdida cognitiva8.
A pesar de la importancia de EEs y otros interruptores endocrinos a la salud pública, disrupción endocrina no es comúnmente incluido en los programas de pregrado. Esta deficiencia en parte debido a la escasez de actividades que ilustran los principios participa al mismo tiempo accesible a estudiantes de pregrado. Además, existen varias variantes del protocolo sí9,10,11,12,13, y esta diversidad hace optimización de análisis desperdiciador de tiempo para coordinadores de laboratorio no específicamente capacitados en las técnicas pertinentes. Finalmente, sí ensayos se suelen realizar más de 1 día o 2 días consecutivos con una incubación de O/N. Este momento no es compatible con el formato de cursos de pregrado laboratorio, que suelen quedar una vez / semana durante varias horas.
En respuesta a estas necesidades, este manuscrito informa un protocolo de sí 96-bien optimizado que incluye métodos de extracción de etanol para productos de Cuidado Personal (PCP)3 y a un paso de refrigeración de 6 días para acomodar reuniones semanales de laboratorio. Etanol absoluto es un solvente orgánico versátil que puede disolver una gran variedad de solutos polares y no polares. Por otra parte, es adecuado para cursos de graduación porque es fácilmente disponible, relativamente no tóxico, asequible y miscible con agua; también se evapora fácilmente sin un equipo especial. Sin embargo, el etanol no es ideal para la extracción de disruptores endocrinos fuertemente hidrofóbicas o muchos aceites y ceras, estos dos últimos ingredientes comunes en PCP. eficiencia de extracción pobre aumenta el riesgo de resultados negativos falsos. Con esta limitación en mente, investigadores deben elegir procedimientos de extracción (p. ej., extracción de etanol o extracción en fase sólida) características de la muestra de dirección y cumplir objetivos del estudio (investigación versus instrucción de pregrado).
El sí depende recombinante Saccharomyces cerevisiae creado originalmente por el Dr. Charles Miller en la Universidad de Tulane. Véase Miller et al. (2010) para un completo mapa del plásmido ingeniería14. Levadura transformada con estos plásmidos constitutivamente expresan humano ERα nuclear o ERβ (también llamado ESR1 y ESR2, respectivamente) cuando se cultiva en medios que contienen galactosa (de ERα) o glucosa o galactosa (de ERβ). Si productos químicos estrogénicos están presentes en los medios de comunicación, se unen a los receptores, creando complejos ligando-receptor que activan la expresión de β-galactosidasa (lacZ) a un nivel proporcional a la concentración de productos químicos estrogénicos. Las células de levadura son entonces lisis para liberar el β-galactosidase acumulado. El tampón de lisis contiene ONPG o CPRG, que están divididos por β-galactosidasa para producir productos de amarillos o rojos, respectivamente. Productos colorimétricos pueden cuantificarse midiendo absorbancia con un espectrofotómetro de la placa de micropocillos. El grado de cambio de color es proporcional a la concentración de ligandos estrogénicas a que estuvo expuesta la levadura.
La elección del sustrato (CPRG o ONPG) depende de las posibilidades de absorción de fondo derivados de las muestras. Por ejemplo, extractos de plantas a menudo agregará un tono amarillo a los medios de comunicación que inflan artificialmente las medidas estrogenicity si ONPG (cuantificado a 405 nm) se utiliza como sustrato para la β-galactosidasa. Con planta de extractos, CPRG (cuantificado en 574 nm) puede ser un sustrato colorimétrico más apropiado. CPRG es más caro que el ONPG pero se utiliza en una décima la molaridad. Este artículo presenta estrogenicities de PCP extractos cuantificados utilizando ONPG y CPRG.
Cuantificación de estrogenicity de muestras ambientales mediante ERα y ERβ es un enfoque más amplio que el uso de sólo uno de estos receptores. En animales, estos receptores exhiben afinidades de Unión para ligandos estrogénicos y anti-estrogénicos15, actividades reglamentarias y distribución diferencial del tejido. Por ejemplo, fitoestrógenos vegetales típicamente enlazar ERβ más fuertemente2, considerando que los productos químicos sintéticos pueden mostrar preferencia por ERα o ERβ o pueden enlazar ambos receptores igualmente bien15. Por lo tanto, atar a receptor del uno estrógeno no predice necesariamente obligatorio a la otra.
Aunque EEs se encuentran en muchos productos de consumo (p. ej., pesticidas, detergentes, adhesivos, lubricantes, plásticos, alimentos y productos farmacéuticos), así como las plantas, los datos presentados se obtuvieron mediante una selección de PCP. PCP son convincentes, fácilmente disponible, económico y ambientalmente relevantes para estudiantes de pregrado. Los estudiantes pueden invitados a traer su PCP favorito de su casa para probar en el laboratorio. También puede buscar la base de datos profunda de la piel desarrollado por el grupo de trabajo ambiental16 para generar comparaciones basadas en la hipótesis de PCP con alta y baja puntuación de toxicidad. De esta manera, los estudiantes pueden simultáneamente habilidades avanzados de laboratorio; participar en el aprendizaje autodirigido, basado en la investigación; y temas emergentes en ciencias ambientales y salud.
Protocolo
1. elaboración reactivos
- Preparar medios de glucosa y galactosa mediante la mezcla de 6,7 g levadura nitrógeno base, 20 g dextrosa o galactosa, 20 mg de sulfato de adenina (agregado como 10 mL de una solución stock acuosa de 200 mg/100 mL), uracil 20 mg (agregado como 10 mL de una solución stock acuosa de 200 mg/100 mL) , 60 mg leucina (agregado como 6 mL de una solución stock acuosa de 1 g/100 mL) e histidina 20 mg (agregado como 2 mL de una solución stock acuosa de 1 g/100 mL) en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. esterilizar por filtración (0,2 μm filtro). Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C durante varias semanas.
- Preparar el estradiol (E2) estándares de E2 en polvo disuelve en etanol anhidro y dilución de las concentraciones apropiadas de trabajo (227.5 nM & 9.75 nM) en etanol al 50%.
Nota: Si estradiol se adquiere como un vial de 1 mg, agregar 1 mL de etanol directamente en el vial para disolver el polvo de estradiol. Esto produce una acción de 3,67 mM #1. Diluir 10 μL del stock de #1 en 990 etanol μL para hacer 1 mL de caldo μM 36.71 #2. Luego, diluir 10 μL del stock de #2 en 990 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de stock nM 367.13 #3. Para realizar las acciones de trabajo, diluir 619.7 stock μL #3 de 380.3 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de 227,5 nM valores de trabajo permite crear curvas estándar con levadura expresión ERα. Diluir 26.56 stock μL #3 de 973.44 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de 9.75 nM stock de trabajo utilizado para crear curvas estándar con levadura expresando ERβ. Sello de normas con parafilm y almacenar a -20 ó -70 º C.
PRECAUCIÓN: E2 es un carcinógeno y tóxicos reproductivos. Es dañino si se inhala, se traga o absorbe por la piel. E2 puede causar daño a la lactancia de los niños y los fetos. E2 es muy tóxico para la vida acuática. Utilice protección personal adecuada (guantes, campana extractora, mascarilla) y evitar la exposición durante el embarazo y la lactancia. Deseche E2 como residuos peligrosos y no lo deje en el medio ambiente. - Preparar LacZ buffer mezclando 8,52 g de Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4cuadrados2O, 95,21 mg MgCl2, mg 745,5 KCl, sal de sodio 2 g N-lauroylsarcosine y ONPG (400 mg) o CPRG (77,7 mg) en agua desionizada a una final volumen de 1 L. tienda LacZ tampón en alícuotas de 20 mL a-20 ° C.
Nota: Una alícuota de 20 mL es suficiente para una placa de 96 pocillos. - Preparación de carbonato de sodio mezclando 105,9 g de carbonato de sodio en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. tienda a TA.
- Preparar 1 M dithiothreitol (DTT) en agua. Congelar alícuotas de 25 μl de la TDT a-20 ° C.
PRECAUCIÓN: TDT es un aguda de la piel y un irritante de los ojos. Utilizar equipos de protección individual adecuados (guantes, campana extractora, mascarilla) para evitar la piel y contacto con los ojos, inhalación e ingestión.
Nota: Cada alícuota es suficiente para una placa de 96 pocillos.
2. preparación de muestras y controles de extracción
- Seleccionar muestras para probar.
Nota: Este artículo presenta datos de para quince de PCP, incluyendo jabón, crema, champú, protector solar, bálsamo labial, Fundación, crema de afeitar, esmalte de uñas y loción. - Combinar 1 g de muestra con 10 mL de etanol anhidro en un tubo cónico de 15 mL. Preparar un control negativo de extracción de 11 mL de etanol en un tubo cónico de 15 mL. Preparar repeticiones según sea necesario.
Nota: Para el diseño experimental presentado, se prepararon tres alícuotas de 15 PCP y soluciones de control de la extracción por triplicado, dando un total de 48 muestras, cada una de ellas se analizó por triplicado utilizando el protocolo en la sección 4. Una sola placa puede alojar hasta 23 muestras en triplicado. Etanol anhidro se utiliza en este paso porque se evapora fácilmente. Utilice controles negativos de extracción para comprobar que los estrógenos no son lixiviación en las muestras de los tubos cónicos. - Homogeneizar el contenido del tubo durante 30 minutos por una combinación de agitación manual y de Vortex o agitando los tubos en un tubo Vortex.
- Tubos de centrífuga cónicos a la máxima velocidad permitida en una cubo la centrifugadora durante 10 minutos decantar el sobrenadante de cada tubo a través de un tamiz de 40 μm células en un tubo cónico de 50 mL. Vacíe el contenido de cada tubo de 50 mL en un vial de centelleo de vidrio.
- Frascos de licencia abierta en una campana de ventilación para una semana permitir que el etanol se evapore completamente. Alternativamente, seque las muestras en una campana ventilada bajo nitrógeno o con un evaporador rotatorio. Para evitar la degradación de los componentes sensibles luz, proteger muestras de secado de la luz (por ejemplo, coloque el tejido opaco sobre puerta campana ventilada).
- Reconstituya las muestras en 1,0 mL de etanol al 50% y de vortex para homogeneizar.
3. cultivo y subcultivo levadura14
- Mantener las culturas de levadura activa (recombinante W303a cepa de S. cerevisiae14) por incubación de levadura en medios de filtro esterilizado glucosa a 30 ° C. Subcultura levadura semanalmente en los medios de comunicación fresco esterilizado por filtro de glucosa.
- Dos noches (unos 42 h) antes de preparar las placas sí, subcultura de la levadura agregando 0,1 mL de cultivos de levadura activa a 10 mL de medio de filtro esterilizado de glucosa utilizando una técnica estéril. Incubar a 30 ° C durante dos noches. Agitación no es necesaria si la levadura se cultiva como cultivos superficiales en estéril de 250 mL Erlenmeyer frascos.
Nota: La levadura puede también almacenarse en placas de agar refrigerado durante varios meses. Para almacenaje de más largo plazo (años), se combinan las culturas O/N con 15-50% de glicerol estéril, vortex y congelar a-70 ° C. Para preparar el glicerol estéril, utilizar una jeringa para transferir glicerol μl 300 un cryovial y un autoclave con la tapa que se afloja. Luego añadir 1.200 μL O/N levadura la cultura utilizando una técnica estéril.
4. preparar las placas sí (día 1 del ensayo)
- En un vaso estéril y utilizando una técnica estéril, diluir la levadura en el paso 3.2 a una densidad óptica de 0.065 ±0.005 610 nm (OD610) en medios de filtro esterilizado de la galactosa.
- Confirmar la densidad óptica por pipeteo 120 μL de cada muestra de levadura por triplicado junto con espacios en blanco de galactosa por triplicado en una placa de poliestireno claro (placa no necesita ser estéril). Utilice un espectrofotómetro de placa para verificar que la cultura de la levadura diluida tiene una red de OD610 de 0,065 ±0.005 restar OD610 lecturas de espacios en blanco en la galactosa de lecturas de610 OD de levadura para determinar el neto del OD610 de la levadura. Preparar un volumen final de al menos 30 levadura mL diluido por cada placa de 96 pocillos.
Nota: Pueden utilizarse filtros de espectrofotómetro mide la absorbancia entre 595 y 610 nm para esta medida.
- Confirmar la densidad óptica por pipeteo 120 μL de cada muestra de levadura por triplicado junto con espacios en blanco de galactosa por triplicado en una placa de poliestireno claro (placa no necesita ser estéril). Utilice un espectrofotómetro de placa para verificar que la cultura de la levadura diluida tiene una red de OD610 de 0,065 ±0.005 restar OD610 lecturas de espacios en blanco en la galactosa de lecturas de610 OD de levadura para determinar el neto del OD610 de la levadura. Preparar un volumen final de al menos 30 levadura mL diluido por cada placa de 96 pocillos.
Nota: Las placas de polipropileno son esterilizadas por autoclave dos apiladas las placas envueltas en papel de aluminio. La placa superior sirve como una tapa para la placa de la muestra y puede ser lavado, re-autoclave y reutilizado.
Nota: Después de la dilución serial, deseche 205 μL de pozos G1 - 3. Al final de este paso, todos los pozos estándar deben contener 120 μL. La dilución seriada permite obtener las concentraciones finales de E2 enumeradas en la tabla 1. Para los pasos de dilución seriada, es útil usar una pipeta multicanal con puntas estériles.
Nota: Pozos de control de vehículos se utilizan para cuantificar la absorbancia de fondo asociada a medios de comunicación y las células de levadura. Además, citotoxicidad o crecimiento promover efectos de prueba de las muestras pueden detectarse mediante la comparación de los valores de OD610 de prueba de pozos con los pocillos de control del vehículo.
Nota: Tome nota de que muestras o controles negativos de extracción se añaden a cada pocillo. Seguimiento de que wells tienen muestras y que no, comenzar con una nueva caja de consejos y utilice sugerencias desde los mismos lugares en el cuadro que las ubicaciones de los pozos correspondientes en la placa. Una placa de 96 pocillos para alojar hasta 23 muestras por triplicado.
5. proceso sí placas (día 2 del ensayo)
- Después de la 17 h de incubación a 30 ° C, quitar las placas de la incubadora. Si las placas se procesarán inmediatamente, proceda al paso 5.1.1. Si las placas se procesarán en una fecha posterior, proceda al paso 5.1.2.
- Utilice una pipeta multicanal para mezclar el contenido de cada fila de pozos y entonces transfiera 50 μl de suspensión de levadura de cada pozo el correspondiente pozo de una microplaca clara, poliestireno, 96-well.
Nota: Las placas de poliestireno no necesita ser estéril pero deben tener una tapa. Use puntas de pipeta nueva para cada fila de pozos para evitar Cruz-contaminar pozos, aunque si pipeteo en triplicado con una pipeta multicanal de 8 puntas, puntas sólo necesitan cambiar entre sistemas por triplicado.- Etiqueta de la nueva placa. Continúe con el paso 5.2.
- Para almacenar las placas antes de procesar, envuélvalos en papel plástico. Refrigere envueltas placas a 4 ° C para 6 d. después, sacar las placas de la nevera, les saque y transferir el contenido de todos los pozos mediante pipeteo como en el paso 5.1.1. Continúe con el paso 5.2.
- Utilice una pipeta multicanal para mezclar el contenido de cada fila de pozos y entonces transfiera 50 μl de suspensión de levadura de cada pozo el correspondiente pozo de una microplaca clara, poliestireno, 96-well.
- Añadir 20 μl de DTT de 1 M a 20 mL de tampón de LacZ temperatura descongelado, para una concentración final de 1 mM TDT. Buffer de mezcla LacZ bien. Si con una pipeta multicanal, dispensar en un reservorio de reactivo.
PRECAUCIÓN: Use guantes y trabajar con TDT en una campana, si es posible - Usando ya sea una pipeta multicanal o pipeta de repetición, añadir 200 μL de tampón de LacZ que contienen TDT y ONPG o CPRG en todos los pocillos de la placa de poliestireno e inmediatamente Mida y registre el OD610 de todos los pozos utilizando un espectrofotómetro de placa. Repita según sea necesario para las placas adicionales.
Nota: Las lecturas de OD610 se utilizan en el denominador del cálculo del LacZ (paso 6.1). Por este motivo, obtener la lectura inmediatamente después de su uso y antes de colocar las células o son sometidas a lisis por buffer de LacZ. Si OD610 valores para pozos de muestra son notablemente superior o inferior de los valores de OD610 para pocillos de control del vehículo, los extractos de muestra son promover el crecimiento o citotóxico a levadura, respectivamente. El LacZ cálculo corregirá para pequeñas diferencias en las densidades de célula a través de pozos, pero si las diferencias superan el 30% en cualquier dirección, entonces diluir la muestra reconstituida (del paso 2.6) en etanol al 50% adicional y vuelva a probar la muestra volviendo al paso 3.2 12. - Placas con una tapa. Incube las placas que contienen levadura que expresa ERα14 a 30 ° C durante 40 minutos (de ONPG) o 3 h (para CPRG). Incube las placas que contienen levadura que expresa ERβ14 a 30 ° C durante 70 min (ONPG) o 4 h (para CPRG).
Nota: Cuando se trabaja con CPRG, tiempos de incubación son flexibles; Incubar durante 2-4 h produce resultados adecuados con los receptores, con incubaciones más aumentando la sensibilidad del ensayo. - Después de incubar las placas, utilice una pipeta multicanal o pipeta de repetición para agregar 100 μl de carbonato de sodio a cada pocillo. Carbonato de sodio eleva el pH y detiene la reacción de la β-galactosidasa.
- Mida y registre el OD405 (de ONPG) o OD574 (para CPRG) de todos los pozos utilizando un espectrofotómetro de placa.
6.Calcular valores de LacZ
Nota: Valores de LacZ cuantificar el grado de cambio de color para cada muestra y ofrecer un método normalizado de comparar valores entre ensayos separados por la contabilidad de varias variables (p. ej., densidad óptica levadura, densidad óptica media e incubación tiempo si Esto difiere entre pozos en la misma placa)12.
- Calcular medios triplicados OD610 valores de los medios de comunicación (galactosa) pocillos de control (H10-12) y calcular medios de triplicado OD405 o OD574 valores para el control del vehículo (etanol al 50%) (H1-3). Utilizar estos medios y el tiempo de incubación (t) en horas de la placa para cambiar color (paso 5.5) para calcular valores de LacZ (correspondiente al grado de cambio de color en cada pocillo) para todo el estándar y muestra los pozos utilizando las siguientes ecuaciones:
- Por otra parte, la aplicación automatizada en el Apéndice 1 para calcular valores de LacZ para estándares y muestras.
Nota: El diseño de la placa con la aplicación debe ser idéntico en el diseño del plato presentado en la figura 1. Si algunos pozos de muestra no se utiliza, mantener lecturas de absorbancia de los pocillos vacíos como los titulares de lugar en el conjunto de datos de absorbancia se pega en la aplicación de LacZ Apéndice 1 . Esto conserva la disposición espacial de la placa en la aplicación y asegura que pozos de control de los medios de comunicación están en la posición requerida. Además, la aplicación no se ejecutará si hay celdas vacías.
- Por otra parte, la aplicación automatizada en el Apéndice 1 para calcular valores de LacZ para estándares y muestras.
- Calcular medios de valores de LacZ por triplicado para cada muestra y cada estándar E2. Informe valores LacZ como μl-1h-1. Transformación de registro de las concentraciones de cada E2 estándar y generar un documento de hoja de cálculo con formato del fichero de template.csv (Apéndice 2).
7. interpolar muestras equivalentes de Estradiol (EEQs) mediante regresión logística 4 parámetros
Nota: EEQs se relacionan con valores de LacZ muestra (cambio de color) los valores de LacZ de la curva estándar con E2. EEQs así determinar cuánto muestra es necesaria para obtener la misma respuesta de cambio de color como una concentración conocida de E2.
- Para calcular el EEQs de las muestras de prueba, primero trazar la curva estándar. Ajuste valores LacZ E2 normas (eje y) y el registro-transformada E2 concentraciones correspondientes (eje x) a un modelo de regresión logística de cuatro parámetros.
- Usar el modelo para EEQs de interpolar para valores de LacZ de la muestra de prueba. Llevar a cabo cálculos de regresión logística de EEQs utilizando software estadístico, como se indica en el Apéndice 2.
8. normalización EEQs (ng/mL) a la masa de la muestra de PCP
- EEQs se relaciona con la cantidad de muestra de la PCP a cada bien en el paso 4.5, EEQ (ng/mL) se multiplican por el volumen total plateado en los pocillos de la muestra (325 μL) y entonces dividir por el volumen de muestra extraído agregó a cada pozo (5 μl).
Nota: Estos valores representan EEQ por mL de muestra extraída. Si las muestras se prepararon con 1 g de PCP, estos valores representan también EEQ por gramo de PCP (ng/g). Expresado de esta manera, valores EEQ (ng/g) pueden ser comparados a través de diferentes valores de PCP. EEQ (ng/g) para los productos de cuidado personal probados en este estudio se muestran en la tabla 2, y muestra datos recogidos en todo el conjunto del protocolo están incluidos en Apéndice 3.
Resultados
Las estrogenicities de las muestras por triplicado de 15 PCP fueron evaluados mediante este protocolo sí. Como se ha señalado por Miller et al. (2010), ensayos con levadura expresando ERβ fueron más que un orden de magnitud más sensible que los ensayos con levadura expresión ERα (figura 2)14. Por lo tanto, actividad estrogénica más a menudo se detectó con levadura expresando de ERβ (tabla 2). Ocho PCP exhibieron actividad estrogénica con ERβ y 5 PCP exhibieron actividad estrogénica con ERα. Crema, protector solar, loción y muestras de bálsamo del labio fueron estrogénicas con ambos receptores, mientras que Fundación, crema de afeitar y esmalte de uñas sólo fueron estrogénicos con ERβ en las concentraciones probadas. Siete otros PCP (4 champúes, 2 jabones y bálsamo para los 1 labios) no fueron estrogénicos con cualquier receptor en las concentraciones probadas.
Además de las diferencias de sensibilidad del receptor, EEQs para cada muestra difieren dependiendo del sustrato colorimétrico (ONPG o CPRG) utilizado en el ensayo (tabla 2). En todos sino una muestra, fueron mayores que las determinó la CPRG EEQs determinadas el ONPG. Además, variación entre los distintos recipientes de extracción fue más bajo para EEQs medidos con ERβ y CPRG y determinó mayor para EEQs con ERα y ONPG (tabla 2).
Además de comparar los sustratos colorimétricos, 1 objetivo del presente estudio fue probar incubación tiempos de duración que son compatibles con la programación de un curso de pregrado laboratorio. El ensayo sí típico requiere que una incubación 17 h seguido inmediatamente por la incubación en LacZ buffer de 40 min - 4 h, un horario que es imposible de aplicar en un laboratorio de enseñanza limitado por una sola sesión semanal. Para facilitar el uso de este ensayo en la docencia, el ensayo fue modificado mediante la introducción de un periodo de refrigeración de 6 d (paso 5.1.2) después de la incubación de 17 h. Curvas estándar de platos refrigerados fueron comparables a los de las placas no refrigerados (figuras 2 & 3), salvo que los errores estándar de los parámetros estimados mediante modelos de regresión logística cuatro parámetros fueron más pequeñas para las placas refrigeradas que para placas diferrentes (tabla 3). Así, las placas de 6 d de refrigeración reduce el error y mejora la precisión de las estimaciones de la EEQ.
Figura 1. Diseño de la placa de micropocillos y dilución estándar curvan de preparación para el ensayo sí. Normas de E2 (wells gris claros), muestras y negativa controles de extracción (pozos de blanco) y vehículo (H1 - 3) y los medios de la galactosa (H10 - 12) controles (pozos gris oscuros) se analizaron por triplicado. Una curva estándar de E2 (luz gris pozos) fue construida por placas 320 μl de levaduras en los pocillos A1 a A3 y 120 μl de levaduras en los pocillos B1 a través de G3. Entonces, 5 μl de E2 (227.5 nM para la levadura que expresan ERα; 9.75 nM para levadura que expresan ERβ) fueron agregados a la levadura en los pozos A1 a A3. La levadura + E2 suspensión se diluyó en serie transfiriendo 205 μl de cada pocillo al pozo por debajo de ella, produciendo las concentraciones finales de E2 enumeradas en la tabla 1. Tenga en cuenta que, al final del proceso de dilución seriada, 205 μl debe ser desechada de pozos G1 a G3 para alcanzar un volumen final de 120 μL en cada pocillo. Muestra y pocillos de control negativo de extracción se prepararon añadiendo 5 μl de cada extracto (disuelto en etanol al 50%) a 320 μl de levadura. Pozos de control de vehículo (H1 - 3) se prepararon añadiendo 5 μl de etanol al 50% a 320 μl de levadura. Todos los pozos de muestra y control se mezclaron mediante pipeteo y 205 μL fueron quitadas y desechado para ajustar volúmenes bien a 120 μl. Por último, controles de medios se prepararon placas 120 μl de medio de galactosa en pocillos H10 - 12. Para utilizar la calculadora de LacZ en Apéndice 1 y la aplicación de R que se describe en el Apéndice 2, el E2 curva estándar y controles de los medios de comunicación de vehículo y galactosa deben ser plateados como se muestra. Muestras y los controles negativos de extracción pueden ser plateados en cualquiera de los pozos de blanco como se observa el orden de las chapas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Curvas estándar para las placas sí generadas mediante regresión logística 4 parámetros. Dos sustratos (ONPG & CPRG) fueron analizadas usando levadura expresando uno de dos humano receptores del estrógeno (ERα o ERβ) ambos sin (A) y (B) una refrigeración 6 d periodo después de la 17 h de incubación con 17β-estradiol y muestra extractos. Todas las normas de E2 y controles de los medios de comunicación y vehículo se analizan por triplicado. Puntos representan medios de los valores de LacZ por triplicado, donde LacZ valores reflejan el grado de cambio de color inducido por β-galactosidasa. Parámetros del modelo de regresión logística figuran en la tabla 3. ONPG = Orto- nitrofenil-β-D-galactopiranosida; CPRG = clorofenol rojo-β-D-galactopiranosida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ejemplos de placas desarrolladas sí. Dos sustratos (ONPG & CPRG) fueron analizadas usando levadura expresando los receptores del estrógeno humano (ERα y ERβ) o sin (izquierda) o con el período (derecha) una refrigeración seis días después de la 17 h de incubación con 17β-estradiol o muestra extractos. Todas las normas E2, los medios de comunicación y vehículo controles fueron probados en triplicado. Las placas fueron arregladas con la mayor concentración de E2 en la fila superior de cada placa y controles (etanol al 50% + levadura en los medios de izquierda y galactosa a la derecha) en la fila inferior de cada placa según figura 1. ONPG = Orto- nitrofenil-β-D-galactopiranosida; CPRG = clorofenol rojo-β-D-galactopiranosida.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número estándar | [E2] para levadura ERα (pM) | [E2] para levadura ERβ (pM) |
| 1 | 3500 | 150 |
| 2 | 2208 | 94.6 |
| 3 | 1393 | 59.7 |
| 4 | 878 | 37.6 |
| 5 | 554 | 23.7 |
| 6 | 349 | 15 |
| 7 | 220 | 9,45 |
Tabla 1. Final las concentraciones de E2 normas utilizadas en el sí.
E2 en polvo fue disuelto en etanol anhidro y luego diluido a concentraciones comunes de 227.5 de trabajo nM (para la levadura que expresan ERα) y 9.75 nM (para la levadura que expresan ERβ) en etanol al 50%.Trabajo se adicionaron en pocillos de microplacas que contiene levadura en medios de galactosa y diluidos en serie a las concentraciones que se muestra en la tabla.
| Muestras analizadas | Condiciones del ensayo | Estrogénicas equivalentes (EEQs) de atención primaria | |||||
| PCP # | Tipo de muestra | Receptor de | Sustrato | 1 EEQ (ng/g) | EEQ 2 (ng/g) | 3 EEQ (ng/g) | Significa EEQ (ng/g) |
| 1 | Crema del pelo | ERΑ | ONPG | ND | 0.379 | ND | < 0.379 |
| 1 | Crema del pelo | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 1 | Crema del pelo | ERΒ | ONPG | 0.528 | 0.338 | 0.363 | 0.410 |
| 1 | Crema del pelo | ERΒ | CPRG | ND | 0,215 | ND | < 0.215 |
| 4 | Protector solar | ERΑ | ONPG | 6.803 | 1.390 | ND | < 4.097 |
| 4 | Protector solar | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 4 | Protector solar | ERΒ | ONPG | 1.321 | 0.838 | 0.818 | 0.992 |
| 4 | Protector solar | ERΒ | CPRG | 0.651 | 0.591 | 0.725 | 0.656 |
| 7 | Fundación | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | Fundación | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | Fundación | ERΒ | ONPG | ND | 0.158 | ND | < 0.158 |
| 7 | Fundación | ERΒ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Crema de afeitar | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Crema de afeitar | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Crema de afeitar | ERΒ | ONPG | ND | 0.256 | 0.295 | < 0.276 |
| 9 | Crema de afeitar | ERΒ | CPRG | 0.507 | 0.392 | 0.560 | 0.486 |
| 10 | Esmalte de uñas | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | Esmalte de uñas | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | Esmalte de uñas | ERΒ | ONPG | 0.916 | 0.503 | 0.554 | 0.658 |
| 10 | Esmalte de uñas | ERΒ | CPRG | 0.532 | 0.628 | 0.594 | 0.585 |
| 11 | Loción | ERΑ | ONPG | ND | ND | 2.327 | < 2.327 |
| 11 | Loción | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 11 | Loción | ERΒ | ONPG | Excede | 2.599 | 1.845 | > 2.222 |
| 11 | Loción | ERΒ | CPRG | -- | 1.986 | 1.236 | 1.611 |
| 13 | Protector solar | ERΑ | ONPG | 14.069 | 11.494 | 10.189 | 11.917 |
| 13 | Protector solar | ERΑ | CPRG | 4.773 | 5.790 | 5.850 | 5.471 |
| 13 | Protector solar | ERΒ | ONPG | Excede | 2.580 | Excede | > 2.580 |
| 13 | Protector solar | ERΒ | CPRG | 0.292 | 0.240 | ND | < 0.266 |
| 15 | Bálsamo para los labios | ERΑ | ONPG | ND | ND | 0.431 | < 0.431 |
| 15 | Bálsamo para los labios | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 15 | Bálsamo para los labios | ERΒ | ONPG | 1.202 | 1.060 | 0.887 | 1.050 |
| 15 | Bálsamo para los labios | ERΒ | CPRG | 0.820 | 0.871 | 0.851 | 0.847 |
Tabla 2. EEQs de atención primaria con cero EEQs. Tres alícuotas de 15 PCP y tres controles de extracción fueron homogeneizados en etanol anhidro se evaporó y reconstituidos en etanol al 50% para un total de 48 muestras, cada una de ellas se analizó por triplicado con el análisis de sí. Ocho PCP tenían al menos 1 EEQ de distinto de cero, mientras que 7 PCP no fueron encontrados para ser estrogénico en las concentraciones probadas. 1 EEQ, EEQ 2 y 3 de la EEQ se refieren a las tres alícuotas de cada PCP, cada uno se analizó por triplicado en un plato aparte. Valores para 1 EEQ, EEQ 2 y EEQ 3 son los medios de los triplicados para cada alícuota. Levaduras utilizadas en el análisis expresan 1 de las 2 isoformas de los receptores estrogénicos humanos (ERα o ERβ). Dos sustratos colorimétricos, ONPG y CPRG, fueron analizados usando el Protocolo no refrigerados. EEQs se determinaron utilizando regresiones logísticas cuatro parámetros (con R2 valores ≥ 0.98) de LacZ valores en cada uno de 7 concentraciones de E2. ND = por debajo del límite de detección del ensayo.--= repetición perdido.
| Condiciones del ensayo | Parámetros del modelo | ||||||
| Receptor de | Sustrato | Arresto a 4 ° C durante 6 d | Modelo R2 | Tasa de crecimiento (LacZ unidades/ng/ml) | Punto de inflexión (ng/mL) | Asíntota inferior (LacZ unidades) | Asíntota superior (LacZ unidades) |
| ERΑ | ONPG | No | > 0.99 | ±1.633 8.548 | -0.512 ±0.025 | -1.623 ±4.408 | ±6.31 128.11 |
| ERΑ | ONPG | Sí | > 0.99 | 7.618 ±0.758 | -0.587 ±0.014 | -8.378 ±2.223 | ±2.528 99.53 |
| ERΑ | CPRG | No | > 0.99 | 8.256 ±2.182 | -0.610 ±0.033 | ±3.333 0.853 | ±3.473 62.52 |
| ERΑ | CPRG | Sí | > 0.99 | ±0.616 5.068 | -0.523 ±0.022 | -3.147 ±1.946 | ±3.069 68.06 |
| ERΒ | ONPG | No | > 0.99 | ±2.004 1.041 | -0.898 ±4.410 | -32.98 ±86.62 | 248,6 ±778.9 |
| ERΒ | ONPG | Sí | > 0.99 | ±1.289 4.327 | -1.736 ±0.087 | 4.654 ±3.087 | ±10.75 66.37 |
| ERΒ | CPRG | No | = 0.99 | 5.673 ±1.764 | -1.914 ±0.052 | 3.925 ±1.679 | ±2.334 28.05 |
| ERΒ | CPRG | Sí | > 0.99 | ±1.142 4.412 | -1.894 ±0.051 | ±1.303 2.052 | ±2.047 22.64 |
Tabla 3. Modelo de parámetros de regresión logística 4 parámetros para las curvas estándar en figura 2. Dos sustratos, ONPG y CPRG, fueron analizados usando levadura expresan 1 de 2 humanos los receptores de estrógeno (ERα o ERβ) sin y con un período de seis días de refrigeración después de la incubación de 17 h. Parámetros son registrados como estimaciones ±standard errores.
Apéndice 1. Aplicación para calcular valores de LacZ. Para utilizar la aplicación, primero Descargue gratis software de Java (como se indica en la Tabla de materiales). A continuación, abra la aplicación de LacZ. El diseño de la placa con la aplicación debe ser idéntico en el diseño del plato presentado en la figura 1. Si algunos pozos de muestra no se utiliza, mantener lecturas de absorbancia de los pocillos vacíos como los titulares de lugar en el conjunto de datos de absorbancia se pega en la aplicación de LacZ. Esto conserva la disposición espacial de la placa en la aplicación y asegura que pozos de control de los medios de comunicación están en la posición requerida. Además, la aplicación no se ejecutará si hay celdas vacías. Pasta en OD405 lecturas (ONPG) o OD574 lecturas (CPRG) de todos los pozos utilizando comandos de teclado "control (ctrl) + v" o "comando + v," dependiendo de la plataforma informática que se utiliza. Ingrese la cantidad de tiempo de incubación en horas para el análisis de color del producto (desde el paso 5.4; por ejemplo, 0,66667 h 40 min). Haga clic en siguiente. Pegar en las lecturas de610 OD de paso 5.3. Haga clic en enviar. Resultados de LacZ se mostrará y pueden copiarse pulsando "control (ctrl) + c" o "comando + c," dependiendo de la plataforma informática que se utiliza. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Anexo 2. Opciones de Software estadístico para el cálculo de EEQs. EEQs pueden ser calculadas usando una de las tres opciones presentadas. Instrucciones para el uso 1. JMP software o 2. Código R se proporcionan en el Apéndice 2. El código de R también se ha convertido a 3. formato de solicitud disponible en https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Anexo 3. Los datos recogidos utilizando levadura que ERα Express y CPRG como el substrato de la muestra. Mediciones de OD610 y OD574 para cada uno de siete controles de estándares, vehículos y medios de comunicación de E2, y una única muestra representativa de la PCP se incluyen, junto con los valores calculados de LacZ. LacZ valores de patrones fueron utilizados para construir un modelo de regresión logística cuatro parámetros de la curva estándar como se describe en los pasos 7A & B anterior. Se utilizó el modelo para interpolar las estimaciones triplicadas de EEQs de la muestra representativa en ng/mL en los pocillos de la microplaca. Estos valores fueron luego convertidos a EEQs expresadas en ng/g de muestra (paso 8.1). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
El sí es un método de bajo costo para detectar ligands estrogénicas en muestras ambientales, tales como agua, alimentos, tejidos vegetales o productos de cuidado personal. Datos presentados aquí compara 2 receptores de estrógeno (ERα y ERβ), 2 soportes (ONPG y CPRG) y líneas de 2 tiempo (d 2 protocolo sin refrigeración) y Protocolo de siete días con refrigeración para medir estrogenicity en productos de cuidado personal mediante el análisis de sí. 7 d, protocolo refrigerado utilizando CPRG y levaduras expresando ERα y ERβ mejor cuantifica EEQs mientras que también siendo compatible con las limitaciones de tiempo impuestas por cursos de laboratorio de pregrado que cumplen sólo una vez / semana durante varias horas. De hecho, en comparación con el ensayo de 2 d sin refrigeración, se asoció con menor varianza el ensayo refrigerado de siete días a través de réplicas de la placa. Además, la parte lineal de la curva estándar se amplió levemente para datos recopilados usando el ensayo refrigerado. La parte lineal de la curva estándar define el rango de detección del ensayo y es la única porción de la curva estándar que puede utilizarse para interpolar muestras EEQs.
En todos sino una de las muestras en examen, EEQs con CPRG fueron menores a los cuantificados con ONPG. Con un mayor coeficiente de extinción y baja Km y Vmax, CPRG es diez veces más sensible que el ONPG17. Así, CPRG puede ser utilizado en concentraciones más bajas y puede utilizarse para detectar cantidades menores de la β-galactosidasa. Por estas razones, CPRG se prefiere generalmente sobre ONPG18,19. Sin embargo, una mayor sensibilidad de sustrato no explica los valores más bajos de la EEQ detectaron en la CPRG. Los valores más altos de la EEQ con ONPG podrían ser debido a interferencia de la matriz con el análisis, según lo observado por otros autores2,18. Pigmentos amarillos de extractos de productos de cuidado personal podrían inflar valores EEQ con ONPG. Otros han eludido este problema al incluir controles de pigmento en su diseño experimental2, un enfoque que duplica el número de placas en un experimento. Cuando interferencia de matriz puede ser problemático, CPRG puede ser un sustrato preferible para el análisis de sí, aunque es más caro y requiere tiempos de incubación más largo que el ONPG. Además, el cambio de color inducido por el clivaje del sustrato por β-galactosidasa es más dramático con CPRG, haciéndolo más fácil para los estudiantes a visualizar los resultados.
Miller et al. (2010), que la levadura utilizada en el presente Protocolo de ingeniería, señaló que la levadura que ERβ fueron más sensibles al 17β-estradiol que levadura expresión ERα, una constatación verificada por nuestros datos14x 30. Aparte de posibles matices en la construcción de plásmidos, Miller et al. (2010) no podría explicar esta diferencia en sensibilidad14. Una diferencia entre las dos construcciones de plásmido es que la expresión ERα es regulada por galactosa, mientras que ERβ expresión está regulada por glucosa o galactosa. La levadura utilizada en el ensayo sí son cultivadas en medios de la glucosa y sólo galactosa diluyendo al comienzo del ensayo. Por lo tanto, levadura expresando ERβ podría acumular más altos números de copia de proteínas del receptor antes del inicio de la prueba, de tal modo que confiere mayor sensibilidad a ligandos estrogénicas.
La menor sensibilidad de levaduras expresando ERα puede explicar las tasas más altas de la no detección de estrogenicity en muestras con ERα comparado con ERβ. Para aumentar la probabilidad muestra EEQs se detectarán, los usuarios podrían emplear métodos y disolventes de extracción diferentes o añadir mayores volúmenes de muestra a la levadura. Si se utilizan volúmenes mayores de muestra, las concentraciones de E2 normas deben ajustarse tal que el mismo volumen de muestras y estándares se puede utilizar en el ensayo. Una limitación de la adición de la muestra más es que la levadura puede tolerar solamente 6-10% de etanol, con mejor tolerancia a temperaturas de incubación de 30 y 35 ° C20. Para controlar para los efectos del etanol en levadura, los investigadores deben añadir pozos "de la levadura sólo" por triplicado para el diseño de la placa y confirmar que OD610 de estos pozos "de la levadura sólo" es comparable a OD610 de pozos de control de vehículo inmediatamente después de la adición de tampón de LacZ. Alternativamente, las muestras disueltas en etanol pueden añadirse para placas de pocillos seco y etanol evaporado apagado antes de añadir la levadura. Dimetilsulfóxido (DMSO) se utiliza también como ensayos de un solvente de la muestra en sí, pero la concentración final de trabajo de DMSO con levadura debe ser limitada a 1%12.
El ensayo sí es una herramienta de detección de gran alcance para la detección de estrogenicity en muestras ambientales. Específicamente, el sí detecta ligandos que se unen a los receptores estrogénicos nucleares que interactúan con elementos de la respuesta de estrógeno a gene expresión14. Sin embargo, sí tiene importantes limitaciones. El sí no detecta EEs que funcionan a través de mecanismos no nucleares como receptores de estrógeno de la membrana o mecanismos que involucran elementos adicionales tales como factores de transcripción activador de proteína 1 (AP-1). Por otra parte, porque la levadura no tienen la misma capacidad metabólica como células de mamífero, el sí no puede detectar ligands que requieren activación metabólica para ser estrogénico.
Además, el análisis de sí no puede fácilmente distinguir entre ligandos estrogénicos y anti-estrogenic en muestras complejas. En cambio, mide estrogenicity neto , que es el efecto de la suma de los ligandos estrogénicos y anti-estrogénicos. Para cuantificar la concentración de los antagonistas de la ER o evaluar la actividad inhibitoria de las mezclas, el ensayo puede ser modificado por incubación de levadura con el agonista estándar (17β-estradiol) y una gama de prueba muestra concentraciones12. Este proceso determina si los antagonistas en las muestras pueden disminuir la actividad de reportero inducida por el agonista y proporciona una pantalla útil para identificar la presencia de antagonistas de la ER en las muestras.
El protocolo presentado aquí puede acomodar una variedad de tipos de muestra, aunque algunas muestras pueden requerir modificaciones en los pasos de preparación de la muestra y extracción. Por ejemplo, EEQs variadas ampliamente entre réplicas de algunos productos de cuidado personal. Las muestras más variables tienden a contener las gotitas de aceite o de lo contrario no eran completamente homogéneas, lo que indica que un disolvente más lipofílico como el éter dietílico sería útil. Por otra parte, los aceites y la cera en productos de cuidado personal podrían ser excluidos mediante la extracción de las muestras con etanol al 50% en lugar de etanol 100%.Una extracción de etanol 50% también capturará más ligandos estrogénicos solubles en agua (por ejemplo, algunos pigmentos). Sin embargo, 50% de etanol se evapora más lentamente que el 100% de etanol y así puede extender el tiempo de extracción. Además, algunas muestras (por ejemplo jabones) fueron citotóxicos para levaduras, dando como resultado mediciones de densidad celular reducida (OD610). Fox et al. (2008) sugieren que dichas muestras deben ser diluidos y a analizar si las diferencias de densidad celular superan 30% en comparación con el vehículo de pozos de control12.
Si el ensayo sí es usado para fines de investigación analítica, curvas de dilución de pooles pueden probarse para determinar preventivamente adecuados volúmenes de extracto que se añade a la levadura en el paso 4.5. Por otra parte, extractos se pueden probar simultáneamente en múltiples volúmenes (p. ej., 5 μl y 20 μl extracto agregado a la levadura en el paso 4.5) o diluciones que abarcan órdenes de magnitud (por ejemplo, 0,2 μl, 2 μl y 20 μl). «Apropiados» volúmenes de extracto son los que identifican estrogenicity haciendo coincidir valores de LacZ a lo largo de la parte lineal de la curva estándar. Optimización previene problemas causados por la adición de la muestra demasiado o demasiado poco a la levadura, como citotoxicidad, falsos negativos o estrogenicity que supere la curva estándar. Como se mencionó anteriormente, los volúmenes de las muestras y estándares E2 deben ser ajustados cuando se utilizan diferentes cantidades de ligando que levadura están expuestos a un volumen constante y la concentración de etanol o en otros vehículos a través de la placa.
A pesar de la posibilidad de falsos negativos, el ensayo sí se ha identificado como una herramienta de prueba de nivel 3 para los disruptores endocrinos por Schug et al. (2013), que desarrolló un protocolo integral en niveles de disrupción endocrina (tipo)21. Para la educación universitaria, el ensayo es valioso para la enseñanza de conceptos relacionados con la disrupción endocrina, cultivo celular, atascamiento del receptor, la actividad enzimática, genética, estadística y diseño experimental. Estudiantes que usan el ensayo también practican habilidades de laboratorio fundamental y ampliamente aplicables como la dilución en serie de normas; extracción de muestras; fabricación de soluciones; construcción e interpolando curvas estándar; cálculo de concentraciones; fabricación de soluciones; demostrando una técnica estéril; cultivo de células; identificación de variables y controles; recoger, organizar y analizar datos; construir e interpretar gráficos; y el uso de equipo de laboratorio común como micropipettors y espectrofotómetros.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por la puesta en marcha fondos a TME y AMR de Louisiana Tech University y la Universidad de Furman, respectivamente. Financiación adicional fue proporcionada por una beca de adelanto Facultad de 2015 a AMR y TME de la universidades asociadas del sur, una beca de Luisiana EPSCoR Pfund de TME de la National Science Foundation y el tablero de Luisiana de regentes y un premio de viaje a TME de la Universidad del sur. Agradecemos Dr. David Eubanks (Furman) ayuda con análisis estadísticos y el Sr. Christopher Moore para "que nos da una mano" durante el rodaje.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| vórtice (para tubos simples o múltiples) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Cualquier mezclador será suficiente. |
| Centrífuga de cangilón | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Cualquier centrífuga de cangilón será suficiente si es capaz de centrifugar tubos cónicos a 4000 rpm. |
| Mechero Bunsen | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Cualquier mechero Bunsen será suficiente, o se puede usar un quemador de alcohol (Fisher Scientific 04-245-1) en su lugar. |
| Incubadora | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Cualquier incubadora será suficiente si es capaz de mantener 30 °C. |
| Lector de microplacas | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | Una marca diferente de lector de placas será suficiente si puede medir la absorbancia en longitudes de onda de 405, 574 y 610 nm. |
| Software de lector y generador de imágenes de microplacas Gen5 | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | El software requerido depende de la marca y el modelo del lector de placas; El software GEN5 está diseñado para su uso con el lector de placas BioTek. |
| Refrigerador | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Cualquier refrigerador será suficiente si es capaz de mantener 4 °C. |
| Pipettor o PipetAid compatible con pipetas serológicas de 1 a 10 mL | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Cualquier pipeta será suficiente si es compatible con pipetas serológicas de 1 y 10 mL. |
| Micropipeta P10 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Cualquier micropipeta será suficiente si es capaz de dispensar 5 µl. |
| Micropipeta P200 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Cualquier micropipeta será suficiente si es capaz de dispensar hasta 200 µl. |
| Pipeta multicanal P300 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Cualquier pipeta multicanal será suficiente si es capaz de dispensar 50 - 205 µl. |
| Pipeta de repetición | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Debe ser capaz de entregar 100 - 320 µ l; Esta pipeta es opcional porque en su lugar se puede utilizar una pipeta multicanal. |
| Name | >Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Suministros | |||
| Tubos cónicos estériles de 15 mL con tapas | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
| Viales de centelleo de vidrio | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
| Microplacas de poliestireno de 96 pocillos, de fondo plano con tapa (no estériles) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
| Microplacas de polipropileno de 96 pocillos, de fondo plano sin tapa | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
| Vasos de precipitados de vidrio de 100 mL | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Cualquier vaso de precipitados de vidrio será suficiente si se puede esterilizar en autoclave. |
| Matraces Erlenmeyer de vidrio de 250 ml | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Cualquier matraz Erlenmeyer de vidrio será suficiente si se pueden esterilizar en autoclave. |
| Película estéril, adhesiva, porosa | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
| Pinzas | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Cualquier pinza metálica será suficiente. |
| Depósito de reactivos | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
| Unidades de filtración (0,2 y micro; m) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
| Botella de agua (para etanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Cualquier botella de agua de laboratorio será suficiente. |
| Botellas de almacenamiento esterilizables en autoclave | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Cualquier botella de almacenamiento de vidrio esterilizable en autoclave será suficiente. |
| 10 mL pipetas serológicas de vidrio (estériles) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Cualquier pipeta serológica de vidrio será suficiente. |
| 1 mL pipetas serológicas de vidrio (estériles) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Cualquier pipeta serológica de vidrio será suficiente. |
| Puntas de micropipeta P10 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Cualquier punta será suficiente si es compatible con la micropipeta anterior. |
| Puntas de micropipeta P200 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Cualquier punta será suficiente si es compatible con la micropipeta anterior. |
| Puntas de micropipeta P300 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Cualquier punta será suficiente si es compatible con la micropipeta anterior. |
| Puntas de jeringa para pipeta de repetición | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Solo son necesarias si se utiliza una pipeta de repetición. |
| Placas de Petri estériles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Cualquier placa de Petri estéril será suficiente. |
| Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Yeast | |||
| Saccharomyces cerevisiae cepas que carecen del producto del gen TRP1 (e.g., W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Levadura recombinante también están disponibles a petición de los autores. |
| Plásmido receptor/reportero para ER&alfa; | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (plásmido #23061) | |
| Plásmido receptor/reportero para ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (plásmido #23062) | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Químicos | |||
| Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
| Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | PRECAUCIÓN: El ditiotreitol es un irritante agudo de la piel y los ojos. Utilice el equipo de protección personal adecuado (guantes, campana extractora, mascarilla contra el polvo) para evitar el contacto con la piel y los ojos, la inhalación y la ingestión. |
| Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
| Clorofenol rojo-β-D-galactopiranósido | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
| Levadura base nitrogenada | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
| Glucosa | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
| Galactosa | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
| Sulfato de adenina | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
| Uracilo | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
| Leucina | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
| Histidina | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
| 17 β-Estradiol& nbsp; | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedical | E8875-250 mg 0219456401 - 1 mg | PRECAUCIÓN: Se sospecha que el estradiol es un carcinógeno y tóxico para la reproducción. Es dañino si se inhala, se traga o se absorbe a través de la piel. El estradiol puede causar daño a los niños amamantados y a los fetos. El estradiol es muy tóxico para la vida acuática. Use protección personal adecuada (guantes, campana extractora, mascarilla contra el polvo) y evite la exposición durante el embarazo y la lactancia. El estradiol debe eliminarse como residuo peligroso y no liberarse al medio ambiente. |
| Etanol 100% | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
| Fosfato de sodio monobásico monohidratado | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
| Fosfato de sodio dibásico (anhidro) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
| Cloruro de | potasioSigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
| Sarkosyl (Sal sódica de N-lauroylsarcosina) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
| Carbonato de sodio | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
| Nombre | Compañía | Número de catálogo | Comentarios |
| Software | |||
| cálculo | Microsoft | Excel es un conveniente software de hoja de cálculo para administrar salidas de datos y generar archivos de .csv para el análisis de R. | |
| Software Java (necesario para la aplicación del Apéndice 1) | Oracle Corporation | Para calcular los valores de LacZ utilizando la aplicación del Apéndice 1, primero descargue el software Java gratuito (https://www.java.com/en/download/) y, a continuación, abra la aplicación LacZ en el Apéndice 1. Los resultados de LacZ creados por la aplicación se pueden copiar presionando "control (ctrl) + c" en los teclados de PC, o "comando + c" en los teclados de Mac. | |
| El software estadístico JMP versión 13.0.0 | SAS Institute | Apéndice 2 incluye instrucciones sobre el uso de JMP para ajustar los datos de LacZ a una curva de regresión logística de cuatro parámetros. La curva se utiliza para interpolar los equivalentes de estradiol (EEQ) de las muestras de prueba, en relación con la curva estándar de estradiol. | |
| R software de computación estadística y gráficos | R Foundation | Free R software se puede descargar desde https://www.r-project.org/. En el Apéndice 2 se indican las instrucciones y el código para utilizar R a fin de ajustar los datos de LacZ a una curva de regresión logística de cuatro parámetros. |
Referencias
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