Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Resumen

Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

Resumen

sistemas de expresión de proteína heteróloga se utilizan para la producción de proteínas recombinantes, la interpretación de celular tráfico / localización, y la determinación de la función bioquímica de las proteínas a nivel de sub-organismo. Aunque los sistemas de expresión de baculovirus se utilizan cada vez más para la producción de proteínas en numerosos biotecnológica, farmacéutica y aplicaciones industriales, sistemas nonlytic que no implican infección viral tiene evidentes ventajas, pero a menudo se pasa por alto y poco utilizados. A continuación, describimos un método para generar vectores de expresión nonlytic y expresión de la proteína recombinante transitoria. Este protocolo permite la localización celular eficiente de proteínas recombinantes y se puede utilizar para discernir rápidamente el tráfico de proteínas dentro de la célula. Mostramos la expresión de cuatro proteínas recombinantes en una línea de células de insecto disponibles comercialmente, incluyendo dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci, asícomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para la membrana plasmática de la célula y para lisosomas intracelulares. Todas las proteínas recombinantes se produjeron como quimeras con marcadores de proteínas fluorescentes en sus extremos carboxilo, que permite la detección directa de las proteínas recombinantes. La doble transfección de células con plásmidos que albergan construcciones de los genes de interés y un marcador subcelular conocido permite para imágenes de células vivas y la mejora de validación de localización de la proteína celular.

Introducción

La producción de proteínas recombinantes utilizando sistemas de expresión de células de insectos ofrece numerosos beneficios para el estudio de proteínas eucarióticas. A saber, células de insectos poseen modificaciones similares después de la traducción, procesamiento, y los mecanismos de clasificación como los presentes en células de mamífero, lo que es ventajoso para la producción de proteínas correctamente plegadas ^{1, 2, 3.} Sistemas de células de insectos también típicamente requieren menos recursos y menos tiempo y esfuerzo para el mantenimiento de líneas celulares de ma....

Protocolo

1. OE-PCR para la construcción de plásmidos de expresión

Nota: Véase la Tabla 1 para todos los cebadores utilizados en OE-PCR. El uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad se recomienda para todas las amplificaciones. Sin embargo, debido a que estas enzimas con frecuencia no dejan un 3' A, es necesario realizar una breve no amplificar-incubación, con una ADN polimerasa Taq a productos 'A-cola' de la PCR antes de la clonación ellos en una expresión de células de insecto TA vector. Este protocolo demuestra un método para generar insectos plásmidos de expresión que alberga proteínas quiméricas, con las proteínas ....

Resultados

OE-PCR

OE-PCR permite la síntesis de los productos de ADN quiméricas que, una vez insertado en un vector de expresión, permitir la producción de proteínas quiméricas recombinantes correspondientes a cualquier gen de prueba de interés y la proteína de marcador fluorescente. La figura 1 representa un esquema general para la producción de vectores de expresión que contienen PIB B. tabaci acuaporina secuenci.......

Discusión

Sistemas de expresión de proteínas heterólogas son herramientas importantes para la producción de proteínas recombinantes utilizadas en numerosas aplicaciones aguas abajo ^4. La elección de los diversos sistemas de expresión disponibles depende del objetivo final de la proteína de interés. Varios sistemas de expresión de células de insecto están disponibles que ofrecen alternativas flexibles para sistemas de expresión de células procariotas y eucariotas ^5,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
KOD ADN polimerasa	EMD Millipore	71085-3	ADN polimerasa de alta fidelidad utilizada para la amplificación por PCR de productos de PCR de extensión de superposición
ExTaq ADN polimerasa	TaKaRa-Clontech	RR001B	ADN polimerasa utilizada para la cola A de productos de PCR
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerasa Master Mix Lucigen		30033-1	ADN polimerasa utilizada para PCR
de colonias bacterianasBiometra Termociclador de gradiente profesional	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarosa LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Tinción de gel de ADN seguro	ThermoFisher	S33102
Montage Kit de extracción de gel de ADN	EMD Millipore LSKGEL050
pIB/V5-His Kit de expresión TOPO TA	ThermoFisher	K89020	Contiene los componentes necesarios para clonar productos de PCR de extensión superpuesta, incluido el vector pIB/V5-His-TOPO linealizado y activado por topoisomerasa I, E. coli químicamente competente One Shot TOP10 y solución salina.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
Estación de trabajo robótica QIAcube	Qiagen	9001292
Purificador Banco de limpieza vertical	Labconco 3970401
Tni Línea de células de insectos cultivadas	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 Línea de células de insectos cultivadas	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Medio de cultivo de insectos sin suero	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Medio de cultivo de insectos	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Reactivo de transfección	ThermoFisher	10362100
16 cm Raspadores de células desechables	Sarstedt	83.1832	Cell Rascadores con cuchilla de dos posiciones
25 cm2 (T25) Matraces de cultivo de tejidos con tapones de filtro de ventilación Productos de Ciencias de la	Vida	CT-229331
Pipetas de transferencia	Fisher	1371120
estériles, 50 mL Tubos de biorreacción Productos de Ciencias de la	Vida	CT-229475
PipetaBoy	VWR	14222-180
5 mL Serológico Pipetas	Sarstedt	86.1253.001
0,5 mL Tubos de PCR de tapa plana	Fisher	14230200
Polipropileno Biohazard Autoclave Bolsas	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Platos con fondo de vidrio	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm de diámetro de plato, 14 mm de diámetro de vidrio, 1,5 mm de espesor de vidrio, sin recubrimiento
Incubadora, modelo 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Contador de células	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cámara de recuento de células con 0,4% de reactivo azul de tripán	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Microscopio confocal de barrido láser	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 ADN plasmídico	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyReactivo de sondas (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605

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