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Artículo de método

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

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⸱

DOI:

10.3791/55757

⸱

9 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

Resumen

Infarto de miocardio y la posterior cascada isquémica como resultado la pérdida extensa de cardiomiocitos, llevando a insuficiencia cardíaca congestiva, la principal causa de mortalidad en todo el mundo. Las células madre mesenquimales (MSCs) son una opción prometedora para las terapias basadas en células reemplazar las actuales técnicas invasivas. MSCs pueden diferenciarse en linajes mesenquimales, incluyendo tipos de la célula cardiaca, pero completa diferenciación en células funcionales todavía no se ha logrado. Anteriores métodos de diferenciación se basan en agentes farmacológicos o factores de crecimiento. Sin embargo, estrategias más fisiológico relevantes también pueden habilitar MSCs a sufrir una transformación cardiomiogenético. Aquí, presentamos un método de diferenciación utilizando agregados MSC en capas de alimentador de cardiomiocitos para producir células contratantes cardiomiocitos.

Células perivasculares de cordón umbilical humano (HUCPVCs) se ha demostrado que tiene una diferenciación mayor que comúnmente investigados tipos de MSC, como médula ósea MSCs (BMSCs). Como una fuente más joven ontogeneticamente, investigamos el potencial de cardiomiogenético de HUCPVCs de (FTM) durante el primer trimestre en comparación con las más viejas fuentes. HUCPVCs FTM son una novela, rica fuente de MSCs que conservan sus útero immunoprivileged propiedades cuando cultivadas en vitro. Utilizando este protocolo de diferenciación, FTM y término HUCPVCs logrado cardiomiogenético perceptiblemente creciente diferenciación en comparación con BMSCs, tal como se indica por el aumento de la expresión de marcadores de cardiomiocitos (es decir, el factor del miocito enhancer 2 C, troponina T, cardiaca miosina de cadena pesada, señal regulador de la proteína α y conexina 43). También mantuvieron significativamente menor inmunogenicidad, como quedó demostrado por su menor expresión de HLA-A y la más alta expresión de HLA-G. Aplicación de diferenciación basada en el agregado, HUCPVCs FTM demostró formación agregada creciente potencial y genera contratación racimos de células dentro de 1 semana de co-cultivo en capas cardiacas alimentador, convirtiéndose en el primer tipo MSC para hacerlo.

Nuestros resultados demuestran que esta estrategia de diferenciación efectiva puede aprovechar el potencial de cardiomiogenético de MSCs joven, como HUCPVCs de FTM y sugiere que en vitro la diferenciación previa podría ser una estrategia potencial para aumentar su eficacia regenerativa en vivo.

Introducción

Insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) persiste como una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. CHF ocurre a menudo después de la masiva pérdida de cardiomiocitos y el desarrollo de tejido cicatricial sin células como el resultado patológico de un infarto de miocardio (IM)1. Mientras que el corazón es un órgano parcialmente renovado, la residente madre y progenitoras celulares piscina responsable de ejecutar la regeneración tisular significativamente disminuye en abundancia y la función en pacientes envejecidos, a menudo convertirse en insuficiente para la recuperación óptima después de la lesión. Así, hay gran interés en el desarrollo de tratamientos experimentales que implican el trasplante de células de un donante sano en el miocardio dañado. Es imprescindible que las células del donante no sólo restauración la estructura del tejido, sino que también logran la recuperación funcional del miocardio afectado.

El corazón nativo emplea tejido reside en el corazón y endógenas originados en la médula ósea las células madre para después de la lesión de reparación2,3,4. Regenerativa células huésped derivadas y del donante-por igual-deben tener la capacidad de obtener el fenotipo apropiado y la función en el microambiente del miocardio remodelado, junto con la capacidad de manera eficiente y segura reemplazar las células perdidas. Métodos de diferenciación in vitro se han utilizado ampliamente para lograr la producción de cardiomiocitos de alta eficiencia, basada en la célula de vástago5,6. El perfil de expresión de marcadores de linaje cardíaco se utiliza para definir el proceso de diferenciación de células madre hacia el linaje cardíaco7. Diferenciación marcadores tempranos, tales como NKX2.5, factor potenciador de miocito 2C (Mef2c) y GATA48,9, pueden ser un indicio de la iniciación del proceso cardiomiogenético. Cardiomiocitos maduros marcadores utilizados para evaluar la eficacia de diferenciación son señal de regulador de la proteína α (SIRPA)10, troponina cardíaca T (cTnT)11, cadena pesada de miosina cardiaca (MYH6)8,12,13y conexina 43 (Cx43)14,15,16. Los métodos utilizando células madre embrionarias (ESCs) y células madre pluripotentes (PSC) han sido completamente optimizados y discutido sobre los detalles de factores inductivos de gradientes de nutrientes y oxígeno y la sincronización exacta de acción5,6,7,17,18. Sin embargo, tecnologías basadas en el ESC y el PSC aún presentan múltiples problemas éticos y de seguridad, junto con características electrofisiológicas e inmunológicos subóptima19,20. Transplantados con estas células a menudo experiencia immunorejection y requiere inmunosupresión permanente. Esto se debe principalmente a unir mal histocompatibilidad complejo () las moléculas de MHC en el host y de los donantes y a la resultante t-célula respuesta21. Mientras que los MHC de clase I que empareja es una posible solución, una práctica clínica más accesible requeriría una fuente de células que es universal immunoprivileged para superar la preocupación de rechazo.

Como una fuente alternativa de la célula para su uso en aplicaciones clínicas, MSCs y, en particular, BMSCs, han sido investigados para su uso en la regeneración de los tejidos desde su descripción inicial en 199522. MSCs se creen para ser residente células regenerativas que pueden encontrarse en casi cualquier tejido vascularizado23. A aislamiento de la fuente deseada, MSCs pueden ampliarse fácilmente en la cultura tienen capacidad amplia paracrina y poseen a menudo immunoprivileged o inmunomoduladores propiedades24,25. Su seguridad y eficacia han ya demostrados en varios estudios preclínicos, en particular para la regeneración cardiaca3,26.

Muchas estrategias de diferenciación de MSC utilizan a agentes farmacológicos, tales como 5-azacitidina22 y27de DMSO y crecimiento o factores morfogénicos, como ordenación5,7,28,29 o angiotensina II30, con eficacia variable. Sin embargo, estas estrategias no están basadas en los obstáculos que un ingenuo regenerador celular es probable encontrar después de autoguiado hacia el blanco o ser entregado al sitio de lesión en vivo. Estrategias más fisiológicamente relevantes, mientras que la más difícil de definir y manipular, se basan en la premisa que la diferenciación MSC puede ser inducida a través de señales del microambiente del tejido propio. Estudios previos han demostrado que la exposición a los lysates de la célula cardiaca31 o el miocardio ventricular32,33o dirigen contacto con cardiomiocitos primarios en vitro15,34, puede aumentar la expresión de marcadores cardiacos en MSCs. Otros han demostrado cardiomyogenesis espontánea después de tratar heridas cardiacas con MSCs35,36,37,38, aunque en parte, la fusión de BMSCs y cardiomiocitos39,40 generados por el miocardio naciente. A nuestro conocimiento, todavía no se han divulgado cardiomiocitos funcionales, espontáneamente contratación de MSCs humanos (hMSCs) de cualquier fuente de tejido.

El consenso actual es que todos MSCs surgen de células perivasculares23. Jóvenes de MSCs con propiedades pericyte puede ser aislado de la región perivascular del tejido de cordón umbilical humano41,42,43. En comparación con BMSCs, HUCPVCs poseen potencial mayor diferenciación y varias otras ventajas regenerativas, tanto en vitro41,44 y en vivo45,46,47. En particular, la fuente ser la interfaz materno-fetal, HUCPVCs tienen menor inmunogenicidad en comparación con adultos fuentes de MSCs. Nuestra investigación se centra en la caracterización y aplicaciones preclínicas de FTM HUCPVCs, la fuente más joven de MSCs investigado, que previamente hemos demostrado aumentaron multilineage proliferativa y mayor capacidad de diferenciación, incluyendo en el linaje de cardiomiogenético41.

Aquí, presentamos un protocolo que combina capas de alimentador primario de la célula cardiaca y formación agregada como fuerzas inductivas para lograr la diferenciación de cardiomiogenético completa de MSCs. agregados proporcionan un entorno 3D que modela mejor condiciones en vivo frente a culturas adherentes 2D. Utilizando capas cardiacas alimentador proporciona un entorno que es representativa del sitio de trasplante definitivo de las MSCs. Nos demuestran que jóvenes fuentes de MSCs aisladas de cordón umbilical antes o después del parto tienen una mayor capacidad para formar agregados y alcanzar el fenotipo cardíaco en comparación con adultos BMSCs, mientras que todavía mantiene su privilegio inmune. Además de la elevación escarpada de genes marcadores de linaje cardíaco y la expresión inducida de intracelular (es decir, reposo y MYH6) y proteínas de la superficie de la célula (es decir, SIRPA y Cx43) específico para cardiomiocitos, demostramos que se puede aprovechar el potencial de diferenciación de la FTM HUCPVCs con este método y que puede dar lugar a contraer espontáneamente cardiomiocitos-como las células.

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Protocolo

Todos los estudios con animales se realizaron e informaron de acuerdo con las directrices ARRIVE48. Todos los estudios se realizaron con la aprobación de la junta de ética en investigación institucional (REB número 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Red Universitaria de Salud (Toronto, Canadá), y todos los animales recibieron cuidado humanitario de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,8ª edición (Institutos Nacionales de Salud 2011).

1. Cultivo de tejidos

  1. Cultivo de HUCPVCs FTM, HUCPVCs de término (previamente establecidos, n ≥ 3 líneas independientes para cada uno)42 y BMSCs disponibles comercialmente en medio esencial alfa-mínimo (MEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un cóctel de penicilina/estreptomicina (P/S) al 1%. Cultivo de cardiomiocitos primarios de rata y cocultivos de MSC-cardiomiocitos en el Medio Eagle Modificado de Dulbecco: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM-F12) que contiene 10% de FBS y 1% de P/S.
    NOTA: Esterilice el medio con un filtro de 0,2 μm. Almacene las soluciones medias preparadas a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
  2. Mantener los cultivos celulares en incubadoras humidificadas (95% de humedad relativa, 37 °C y 5% de CO2) y paso a 70-80% de confluencia, determinado por microscopía de contraste de fases. Utilice volúmenes apropiados de medio para el tamaño de la placa de cultivo de tejidos utilizada (p. ej., 10 mL en una placa de 10 cm y 2 mL por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos). Utilice estas condiciones de referencia cultural mientras dure el protocolo.
  3. Disociar las monocapas de MSC para el paso o el establecimiento de cocultivo de MSC-cardiomiocitos utilizando una solución de enzima de disociación (2 mL/pocillo en una placa de 6 pocillos) e incubar a 37 °C durante 4 min.
  4. Transfiera las células disociadas a un tubo de 15 ml y centrifugue a 400 x g durante 5 min.
  5. Aspire el sobrenadante sin alterar la pastilla celular y vuelva a suspender las células en 1 ml de un medio de cultivo adecuado para el recuento utilizando un contador de células automatizado. Siembra las celdas como se describe en las siguientes secciones del protocolo.

2. Preparación de cocultivos primarios de cardiomiocitos de rata-MSC

  1. Obtener tejido cardíaco para el aislamiento primario de cardiomiocitos.
    1. Eutanasia de las crías de rata (5-6 días después del parto) utilizando la asfixia por CO2. Ajuste las cámaras deCO2 al 20% de reemplazo de gas (caudal = 0,2 x volumen de la cámara por minuto). Confirmar el exitus por la ausencia del reflejo de pellizco.
    2. Retire las aurículas con los vasos sanguíneos principales que conectan usando instrumentos esterilizados (es decir, pinzas y tijeras curvas)41. Transfiera los corazones a tubos de 50 ml que contengan PBS estéril con 1% de P/S (PBS-P/S) en hielo.
    3. Corta los ventrículos por la mitad y deja que la sangre se lave en un plato de 10 cm con 10 ml de PBS-P/S en hielo. Corte las paredes ventriculares en trozos pequeños (diámetro = 2-3 mm) con unas tijeras curvas.
    4. Transfiera las piezas de corazón de 10-12 animales a un tubo de 50 ml con una pipeta serológica y deje que se asienten.
    5. Retire la mayor cantidad posible de PBS-P/S sin quitar ninguna pieza de corazón. Agregue 10 mL de nuevo PBS-P/S.
  2. Digiere el tejido cardíaco para aislar los cardiomiocitos.
    1. Deje que las piezas del corazón se asienten. Sustituir el PBS-P/S por 10 mL de tripsina al 0,15% en PBS y agitar a 37 °C durante 10 min.
    2. Deseche el sobrenadante. Repita la digestión descrita en el paso 2.2.1 tres veces más, pero decante los sobrenadantes en tubos de recolección de 50 mL que contengan 10 mL de FBS al 100%.
  3. Centrifugar las células (400 x g, 5 min) y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en DMEM-F12 que contenga 10% de FBS y 1% de P/S y siembre en una placa de 6 pocillos (1 x 105 celdas/cm2, 2 mL de medio por pocillo).
  4. Después de 1 h, transfiera el medio que contiene células no adheridas a un tubo de 50 ml y deseche las células adheridas. Cuente las celdas en suspensión y vuelva a colocarlas en nuevas placas de 6 pocillos (1 x 105 celdas/cm2, 2 mL de DMEM-F12 que contengan 10% de FBS y 1% de P/S por pocillo).
  5. Inhibe la proliferación celular con bromodeoxiuridina (BrdU).
    Precaución: BrdU es un teratógeno fuerte y se sospecha que es mutágeno. Asegúrese de proporcionar la capacitación adecuada y consulte la hoja de datos de seguridad antes de usar.
    1. Una vez que las células se hayan adherido, reemplace el medio en la placa de 6 pocillos con DMEM-F12 que contenga 10% de FBS, 1% de P/S (2 mL de medio por pocillo) y 5 μM de BrdU. Incubar durante 16 h (37 °C, 5% CO2).
    2. Retire el medio que contiene BrdU y reemplácelo con DMEM-F12 que contenga 10% de FBS y 1% de P/S (2 mL de medio por pocillo).
  6. Prepare las MSC previamente teñidas.
    1. Una vez que los cultivos de MSC estén al 70-80% de confluencia en placas de 10 cm, retire el medio de cultivo y agregue 3 mL de solución de disociación celular. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 5 min.
    2. Transfiera las células disociadas a un tubo de 15 ml y centrifugue a 400 x g durante 5 min.
    3. Aspire el sobrenadante sin alterar el pellet celular y vuelva a suspender las células en 1 mL de DMEM-F12 que contiene 10% de FBS y 1% de P/S para el recuento utilizando un contador de células automatizado.
    4. Diluir las células hasta una concentración de 1 x 106 MSC/mL de DMEM-F12 que contenga 10% de FBS y 1% de P/S.
    5. Incubar las MSC con colorante fluorescente viable e intransferible (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2) en tubos de centrífuga de 1,5 mL durante 1 h.
    6. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en DMEM-F12 que contiene 10% de FBS y 1% de P/S para una concentración celular de 1 x 106 MSC/mL. Repita esto un total de 3 veces.
  7. Transfiera las MSC a los cardiomiocitos (paso 2.5.2) a una concentración de 10 x 104 células por pocillo de la placa de 6 pocillos.

3. Preparación de cocultivos agregados

  1. Prepare una suspensión de una sola célula de MSCs (2 x 104 células/mL de medio, pasaje # ≤ 6) en alfa-MEM suplementada con 10% de FBS y 1% de P/S (ver paso 2.6).
    NOTA: Consulte la sección 1 del protocolo para el paso de células. Alternativamente, pre-tiña las MSC según el paso 2.6.
  2. Inicie la formación de agregados colocando gotas de 25 μL de suspensión celular (500 células) en la superficie interna de las tapas de las placas de cultivo de tejidos de 10 cm (hasta 50 gotas por tapa). Coloque las tapas en sus contrapartes inferiores que contengan PBS-P/S. Incubar a 37 °C y 5% CO2.
    NOTA: Coloque 5-7 mL de PBS-P/S en el plato de cultivo debajo de las gotas colgantes para evitar la evaporación de las gotas.
  3. Observe la formación de agregados en las gotas después de 3 días utilizando un microscopio estereoscópico. Si más de 40 de las 50 gotas contienen agregados formados, recoja las gotas de los párpados con una micropipeta de 1 ml y transfiera los agregados directamente a las monocapas primarias de cardiomiocitos de rata (preparados en los pasos 2.1-2.7; 10 gotas/pocillo). Evite el pipeteo vigoroso para preservar la integridad de los agregados.
  4. Mantenga los cocultivos agregados en las incubadoras hasta por 2 semanas, cambiando el volumen completo del medio (2 mL de DMEM-F12 que contiene 10% de FBS y 1% P/S por pocillo) cada 72 h.
    1. Observe diariamente los agregados que se adhieren a las capas de células alimentadoras utilizando microscopía de campo claro. Registre los agregados de contratación cuando se observen.
  5. Preparar los agregados para el análisis.
    1. Retire el medio y agregue 2 mL de PBS por pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Retire el PBS y agregue 2 mL de solución de disociación por pocillo. Incubar durante 3 min a 37 °C y 5% de CO2.
    2. Centrifugar a 400 x g durante 5 min para obtener un pellet de celda. Vuelva a suspender en medio, como se especifica para las aplicaciones descritas en los pasos siguientes (consulte los pasos 4.1, 5.1 y 6.1) y pase a través de un filtro de células de 70 μm.

4. Citometría de flujo (FC) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

  1. Incubar suspensiones celulares (1 x 105 células en 200 μL de PBS que contengan 3% de FBS) con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos (FITC o APC) (es decir, CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G y SIRPA para FC o TRA-1-85 para FACS; 1:40) a 4 °C durante 30 min, protegidos de la luz.
  2. Centrifugar (400 x g, 5 min) y resuspender las células en 1 mL de PBS con 3% de FBS para FC o PBS con 0,5% de FBS para FACS.
    NOTA: El FC de las MSC fue optimizado por Hong et al.41.
  3. Mantenga las celdas a 4 °C en la oscuridad hasta que estén listas para ser analizadas por FC (al menos 1 x 104 eventos) o FACS. Ordene las celdas como se describe41. Vuelva a colocar las celdas clasificadas de alta positividad TRA-1-85 en placas de 6 pocillos (1 x 104 celdas/pocillo, 2 mL de DMEM-F12 que contienen 10% de FBS y 1% de P/S) dentro de 1 h.
    NOTA: Para la estrategia de activación del antígeno de superficie de células humanas TRA-1-85, consulte la figura complementaria.

5. Inmunocitoquímica (ICC) y Microscopía

  1. Vuelva a colocar las suspensiones celulares obtenidas de los cocultivos (paso 3.5.2) o FACS (sección 4) en portaobjetos de cámara (1 x 104 celdas/pocillo, 2 mL de DMEM-F12 que contienen 10% de FBS y 1% P/S por pocillo). Deje que las células se adhieran durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos (consulte la sección 1 para conocer las condiciones).
  2. Fije las celdas usando 3 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con 3 mL de PBS que contiene 1% de albúmina sérica bovina (BSA; PBS-BSA) durante 5 min por lavado.
    Precaución: Use el equipo de protección personal adecuado cuando manipule PFA.
  3. Permeabilizar las células en 3 mL de PBS-BSA con Triton X-100 al 0,1%. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min para antígenos intracelulares (es decir, actinina alfa sarcomérica (aSarc) y Cx43), o 25 min para antígenos intranucleares (es decir, Mef2c y antígeno nuclear humano (HuNu)). Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado.
  4. Bloquee las muestras contra reacciones de anticuerpos inespecíficas con 3 mL de PBS que contengan un 5% de suero de cabra normal (NGS) y un 1% de BSA durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado.
  5. Incubar las células en los anticuerpos primarios (es decir, Mef2c, aSarc, Cx43 y HuNu) diluidos 1:200 en 3 mL de PBS-BSA a 4 °C durante la noche.
  6. Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado e incubar con anticuerpos secundarios durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado.
  7. Guarde las muestras teñidas en 3 mL de medio de montaje.
  8. Adquiera imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de 10X (NA = 0,3) y un objetivo de 20X (NA = 0,45) para obtener imágenes de menor aumento. Utilice cubos de filtro de fluorescencia y longitudes de onda para GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) y RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) para los anticuerpos secundarios utilizados (consulte la Tabla de materiales y equipos).
  9. Cuantifique las imágenes utilizando software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales y equipos para conocer el software recomendado). Normalice las lecturas de intensidad de fluorescencia a las adquisiciones de control secundario.

6. Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa

  1. Prepare muestras de ARN a partir de cultivos de MSC indiferenciados o MSC clasificados a partir de cocultivos utilizando aislamiento de ARN basado en columnas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare 1 x 104 a 1 x 106 células en 0,7 mL de tampón de lisis celular (proporcionado con el kit de aislamiento de ARN) por muestra.
  2. Prepare ADNc a partir de hasta 2 μg de ARN por reacción RT de 100 μL.
  3. Realice qPCR utilizando 10 ng de ADNc por reacción (40 ciclos, temperatura de recocido/extensión de 60 °C).
    1. Utilice cebadores para MY6H y cTnT humanos en una concentración de 500 nM y de 1 a 100 ng de ADNc por reacción (consulte la Tabla de materiales y equipos). Utilice GAPDH, ACTB y HPRT como normalizadores internos de limpieza. Utilice cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos disponibles comercialmente como control positivo.
      NOTA: Exprese el cambio de plegamiento de la expresión en comparación con las muestras indiferenciadas de ADNc derivadas de MSC.

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Resultados

Las HUCPVC presentan un potencial mayor de formación de agregados y niveles de expresión de CD49f en comparación con las BMSC:

Para inducir la diferenciación de las hMSCs (es decir, FTM HUCPVCs, HUCPVCs del término y CMMO), suspensiones individuales de CMM no diferenciadas o gotas colgantes que contienen CMMTabla 1) se transfirieron a monocapas de cardiomiocitos primarios de rata para e...

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Discusión

La diferenciación cardiaca de células madre ha estado en desarrollo durante más de dos décadas, con varias diversas estrategias están utilizados para generar cardiomiocitos-como las células procedentes de MSC. Muchas de estas estrategias, sin embargo, son ineficientes, y las condiciones a menudo no son representativas del ambiente transplantada células encuentro en vivo.

En contraste con los métodos existentes, el protocolo presentado aquí utiliza una combinación de capas de alimentad...

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Divulgaciones

El Dr. Clifford L. Librach es común titular de la patente: métodos de aislamiento y uso de células derivadas de tejido de cordón umbilical de primer trimestre, en Canadá y Australia.

Agradecimientos

Los autores agradecemos a los siguientes miembros del personal y de investigación personal por sus contribuciones: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg y Andrée Gauthier-Fisher. Este trabajo fue financiado por el fondo de investigación de Ontario la - excelencia en la investigación (ORF-RE, redondo #7) y crear programa Inc.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% Tripsina/EDTAGibco25200056Para la disociación celular
Alpha-MEMGibco12571071Para medios de cultivo HUCPVC y BMSC.
Anticuerpo CD49f conjugado con PEBiolegend313612Marcador de integrina para el
anticuerpo humano Cx43/GJA1 conjugado con FC APCR& MarcadorConnexin 43 de D Systems FAB7737A para el
anticuerpo HLA-A2 conjugado con FC FITC,Genway Biotech Inc.GWB-66FBD2 Marcador deinmunogenicidad para
anticuerpo anti-HLA-G [MEM-G/9] conjugado conFITC Abcamab7904Marcador de inmunogenicidad para
el anticuerpo SIRPA/CD172a de ratón conjugadoFITC AbD Serotec/Bio-RadMCA2518FMarcador cardíaco para
el anticuerpo humano TRA-1-85/CD147 conjugado con FC APCR& D SystemsFAB3195AMarcador de células humanas para el
anticuerpo humano TRA-1-85/CD147 conjugado con FITCR& D SystemsFAB3195FMarcador de células humanas para FC y FACS
Anti-conexina 43/GJA1 anticuerpoAbcamab11370Cx43. Para el
anticuerpo secundario de absorción cruzada ICC Goat anti-conejo IgG (H + L), Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Para el
anticuerpo ICC Anti-sarcomérico alfa actinina [EA-53]Abcamab9465aSARC. Para el
anticuerpo secundario de absorción cruzada IgM de cadena pesada contra el ratón ICC Goat, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426Para el
anticuerpo de conejo ICC Mef2C (D80C1) XPNueva Inglaterra BioLabs Ltd.5030Spara el
anticuerpo secundario IgG (H + L) anti-conejo ICC Donkey, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206para el
anticuerpo ICC Anti-núcleos (HuNu) (clon 235-1)EMD MilliporeMAB1281estereoscópico ICC
MZ9.5LeicaPara agregados de imágenes.
Microtubos centrífugos de 1,5 mlAxygenMCT-150-CPara teñir MSCs con colorante fluorescente.
ImageJSoftware de procesamiento de imágenes de código abierto.
Aria II Instalaciones BDUHN SickKids FC. Para la clasificación de celdas.
Células estromales mesechimales de la médula óseaLonzaPT-2501BMSCs
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA7030-100GBSA. Para preparar soluciones para ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Precaución: BrdU es un teratógeno fuerte y se sospecha que es mutágeno. Asegúrese de recibir la capacitación adecuada y consulte la SDS antes de usar.
Instalación Canto IIBDUHN SickKids FC. Para citometría de flujo.
ADNc EcoDry PremixClontech/Takara639570Para la preparación de ADNc para qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Imágenes fluorescentes de citoplasma celular
Contador de células automatizado CountessInvitrogen Inc.C10227Para recuento celular
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Para medio de cultivo de cardiomiocitos primarios de rata.
Solución salina tamponada con fosfatoGibco10010023D-PBS de Dulbecco, sin Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesMicroscopio fluorescente propio
FACSCaliburBDInterno. Para citometría de flujo.
Suero fetal bovino (Hyclone)GE Healthcare SH3039603FBS. Componente del medio de cultivo celular.
Sondas IDT Prime Time qPCRTecnologías de datos integradasFAM fluoróforo http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Medio de montaje acuosoThermoScientificTA-030-FMPara el almacenamiento de células para someter a ICC
LSR II Instalaciones BDUHN SickKids FC. Para citometría de flujo.
Instalaciones de MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC. Para la clasificación de celdas.
Suero de cabra normalTecnología de señalización celular5425SNGS. Se utiliza en la solución de bloqueo para ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 pocillosThermo Scientific Nunc155409Para preparar muestras para ICC
OmniPur Triton X-100 SurfactantEMD Millipore9410-OPComo componente de la solución permeable cuando se preparan células para ICC
Paraformaldehído, solución al 16%, EM GradeElectrónica Microscopy Sciences15710Para la fijación de células para ICC.
Penicilina/estreptomicinaGibco15140122Componente del medio de cultivo celular.
ImprimacionesSigmaCustom Standard DNA Oligos, Desalado, 0.2 μ molCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Disco giratorio de quórum ConfocalZeissSickKids Instalación de imágenes
ReproCardio Cardiomiocitos derivados de células hiPSReproCellRCD001NControl positivo para qPCR
RNeasy mini kitQiagen74106Para aislar ARN para qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Para qPCR con mezcla maestra
RPMI 1640GibcoA1049101Para MSC, medio de cocultivo de monocitos.
Ensayos de cebadores TaqMan qPCRThermo Fisher Scientific4444556Para qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Tinción de células para viabilidad y recuento
TripsinaGibco272500108Para la disociación celular
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3Software de imagen
0.2 μ Filtro de porosThermo Fisher Scientific566-0020Para la esterilización de medios de cultivo
de tejidos HERAcell 150i CO2 IncubadoraThermo Fisher Scientific51026410Para incubar células
Salina tamponada con fosfato de DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio
PinzasAlmedic7727- A10-704Para entregar corazón de rata. Puede usar cualquier pinza similar.
TijerasFine Science Tools14059-11Para picar corazón de rata. Se recomiendan tijeras curvas.
Tubo de 50 mLBD Falcon352070Para la recolección durante la recolección de cardiomiocitos y los procedimientos generales de cultivo de tejidos
Tubo de 15 mLBD Falcon352096Para procedimientos generales de cultivo de tejidos
Placas de 6 pocillosThermo Scientific NuncCA73520-906Para cultivo de tejidos
Placas de cultivo de tejidos de 10 cmCorning25382-428Para la formación de agregados
Microscopio Axiovert 40CZeissPara la obtención de imágenes de campo claro a través del cultivo de tejidos y el resto del protocolo
70 μ filtro de células mFisherbrand22363548Para garantizar una suspensión de una sola célula antes de la citometría de flujo o la clasificación
Triton X-100EMD Millipore9410-1LSe utiliza en la solución de permeabilización para ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Tinción utilizada durante la visualización de la localización de Cx43
el FITC con FC y FACS para el microscopio

Referencias

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1(2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767(2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4(2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252(2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

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