La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.
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Artículo de método
Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana
En este artículo
Resumen
Resumen
El análisis del proteoma celular puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades debido al desarrollo de tecnologías que permiten la identificación y cuantificación a gran escala de las proteínas presentes en sistemas biológicos complejos. El conocimiento adquirido a partir de un enfoque proteómico puede conducir potencialmente a una Una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes a las enfermedades, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico de enfermedad y, esperamos, de objetivos terapéuticos. Sin embargo, la válvula mitral cardiaca representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico debido a la baja celularidad en el proteoglicano y en la matriz extracelular enriquecida con colágeno. Esto hace que sea difícil extraer proteínas para un análisis proteómico global. Este trabajo describe un protocolo que es compatible con el posterior análisis de proteínas, tales como la proteómica cuantitativa y immunoblotting. Esto puede permitir la correlación de los datosG expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa mRNA y no cuantitativos inmunohistoquímica análisis. De hecho, estos enfoques, cuando se realizan juntos, conducirá a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, desde mRNA a la modificación de la proteína post-traducción. Por lo tanto, este método puede ser relevante para los investigadores interesados en el estudio de la fisiopatología de la válvula cardíaca.
Introducción
La evidencia reciente ha alterado la comprensión de los papeles de los muchos mecanismos reguladores que ocurren después de la síntesis del mRNA. De hecho, los procesos de traslación, post-transcripción y proteolíticos pueden regular la abundancia y la función de las proteínas. El dogma - que dice que las concentraciones de mRNA son proxies a las de las proteínas correspondientes, suponiendo que los niveles de transcripción son el principal determinante de la abundancia de proteínas - ha sido parcialmente revisado. De hecho, los niveles de transcripción sólo parcialmente predecir abundancia de proteínas, lo que sugiere que post- Ocurren para regular las proteínas den....
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Protocolo
En este protocolo, los corazones humanos se recogen durante la explanación multiorganizada (tiempo de isquemia fría de 4 a 12 h, media ± 6 h ± 2 h) de donantes de múltiples órganos excluidos del trasplante de órganos por razones técnicas o funcionales, a pesar de los parámetros ecocardiográficos normales. Se envían al Banco de Tejidos Cardiovascular de Milán, Centro Cardiológico de Monzino (Milán, Italia) para la banca de las válvulas aórtica y pulmonar. Los folíolos mitrales posteriores no se utilizan con fines clínicos, por lo que se recogen durante el aislamiento de la válvula aórtica y pulmonar después de obtener el consentimiento informado de los familiares de l....
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Resultados
La extracción y disolución de proteínas en el tampón de urea es directamente compatible con los métodos proteómicos basados en el isoelectroenfoque (electroforesis bidimensional (2-DE) 11 y en el enfoque isoeléctrico en fase líquida (IEF) 12 ) y con inmunotransferencia después de la dilución en tampón Laemmli 13 Que contiene un cóctel inhibidor de proteasa 14 .
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Discusión
Un paso crítico de este protocolo es el uso de nitrógeno líquido para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda. El uso de nitrógeno líquido evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere entrenamiento específico para una manipulación segura.
En este protocolo cuenta con un sistema de molienda para la molienda de la muestra debido a que las pequeñas muestras son difíciles de recuperar de mortero estándar y pilones. En este caso, las pequeñas mu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El Ministerio de Salud de Italia apoyó este estudio (RC 2013-BIO 15). Damos las gracias a Barbara Micheli por su excelente asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución | 0,9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Medio de transporte equilibrado del órgano. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener el medio equilibrado Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | medio de transporte del órgano equilibrado. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener un medio equilibrado Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Medio de transporte de órganos equilibrado |
| Riesgo biológico de aire de flujo vertical | Burdinola | Clase A Clasificación GMP | |
| Matraz Dewar | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Sistema de criomolinillo | OPS diagnóstico | CG 08-01 | Sistema de molinillo que contiene morteros, majas y destornilladores |
| Pinza | |||
| Espátula | |||
| Bisturí estéril desechable | Medisafe | MS-10 | |
| Tijeras de acero inoxidable Esterilizable en | autoclave | ||
| Ganzúas | esterilizables | ||
| en autoclaveCortina estéril desechable | Mon& Tex | 3.307.08 | |
| Solución esterilizante con alcohol | 70% alcohol isopropílico | ||
| Solución esterilizante con peróxido de | al 6% Peróxido de hidrógeno | ||
| Micropipeta, 1 mL, con puntas | |||
| Tubos de centrífuga de 15 mL VWR | international | 9278 | |
| Tubos de centrífuga de 1,7 mL VWR | tampón | ||
| internacional 8 M de urea, 2 M de tiourea, 4 % p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | |||
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | Para ser utilizado para Tampón de Urea |
| Jeringa 50 mL | PIC | Para ser utilizado para filtrar Tampón de Urea | |
| 0.22 µ m filtro | Millipore | SLGP033RB | Para filtrar Tampón de urea |
| PFTE Mortle, 2 mL | Kartell | 6302 | Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem |
| Mortero de vidrio de borosilicato | Kartell | 6102 | Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem |
| Agitador | VELP scientifica | Agitador DLH | Para ser utilizado para la homogeneización por Potter-Elvehjem |
| Bradford Ensayo de proteínas | Laboratorios Bio-Rad | 5000006 | |
| Rotador de tubos | Pbi International | F205 | |
| Nitrógeno | |||
| Papel | |||
| Hielo Caja | |||
| de poliestireno | |||
| Hielo | |||
| Centrífuga | Para la centrifugación de tubos de centrífuga de 1,7 mL a 13.000 x g | ||
| Congelador -80° C | |||
| Balanza | |||
| Autoclave | para esterilización | ||
| Guantes criogénicos para nitrógeno | |||
| Guantes | |||
| Horno | para esterilización | ||
| Cóctel inhibidor de proteasa | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solución |
| ProteoExtract Kit de Precipitación de Proteínas | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | versión 2.7 | Plataforma de software para el análisis de ontologías genéticas |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | versión 3.0.3 | Plugin para análisis de ontología génica |
| Anticuerpo AlphaB Crystallin/CRYAB Novus | Biologicals | NBP1-97494 | Anticuerpo monoclonal de ratón contra CryAB |
| Anticuerpo Septin-11 | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Anticuerpo policlonal de conejo contra septina-11 |
| Anticuerpo FHL1 | Novus Biologicals | NBP-188745 | Anticuerpo policlonal de conejo contra FHL-1 |
| Anticuerpo dermatopontin | Novus Biologicals | NB110-68135 | Anticuerpo policlonal de conejo contra dermatopontina |
| Cabra Anti ratón IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Anticuerpo secundario para inmunotransferencia |
| Cabra Anti conejo IgG HRP | Laboratorios Bio-Rad | 170-5046 | Anticuerpo secundario para inmunotransferencia |
Referencias
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expressio....
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Reimpresiones y permisos
