Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Summary

La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.

Abstract

El análisis del proteoma celular puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades debido al desarrollo de tecnologías que permiten la identificación y cuantificación a gran escala de las proteínas presentes en sistemas biológicos complejos. El conocimiento adquirido a partir de un enfoque proteómico puede conducir potencialmente a una Una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes a las enfermedades, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico de enfermedad y, esperamos, de objetivos terapéuticos. Sin embargo, la válvula mitral cardiaca representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico debido a la baja celularidad en el proteoglicano y en la matriz extracelular enriquecida con colágeno. Esto hace que sea difícil extraer proteínas para un análisis proteómico global. Este trabajo describe un protocolo que es compatible con el posterior análisis de proteínas, tales como la proteómica cuantitativa y immunoblotting. Esto puede permitir la correlación de los datosG expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa mRNA y no cuantitativos inmunohistoquímica análisis. De hecho, estos enfoques, cuando se realizan juntos, conducirá a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, desde mRNA a la modificación de la proteína post-traducción. Por lo tanto, este método puede ser relevante para los investigadores interesados ​​en el estudio de la fisiopatología de la válvula cardíaca.

Introduction

La evidencia reciente ha alterado la comprensión de los papeles de los muchos mecanismos reguladores que ocurren después de la síntesis del mRNA. De hecho, los procesos de traslación, post-transcripción y proteolíticos pueden regular la abundancia y la función de las proteínas. El dogma - que dice que las concentraciones de mRNA son proxies a las de las proteínas correspondientes, suponiendo que los niveles de transcripción son el principal determinante de la abundancia de proteínas - ha sido parcialmente revisado. De hecho, los niveles de transcripción sólo parcialmente predecir abundancia de proteínas, lo que sugiere que post- Ocurren para regular las proteínas dentro de las células ^{1 , 2} .

Además, las proteínas dictan en última instancia la función de la célula y por lo tanto dictan su fenotipo, que puede experimentar cambios dinámicos en respuesta a los factores autocrinos, parácrinos y endocrinos; Mediadores sanguíneos; temperatura; Tratamiento farmacológico; Y la enfermedad se desarrollanCión. Por lo tanto, un análisis de la expresión centrado en el nivel de proteína es útil para caracterizar el proteoma y para desentrañar los cambios críticos que se le ocurren como parte de la patogénesis de la enfermedad [ ^3] .

Por lo tanto, las oportunidades que presenta la proteómica para aclarar las condiciones de salud y enfermedad son formidables, a pesar de los desafíos tecnológicos existentes. Las áreas de investigación particularmente prometedoras a las que la proteómica puede contribuir incluyen: la identificación de la expresión alterada de la proteína a cualquier nivel ( es decir, células enteras o tejidos, compartimentos subcelulares y fluidos biológicos); La identificación, verificación y validación de nuevos biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad; Y, con suerte, la identificación de nuevas proteínas objetivo que se pueden utilizar con fines terapéuticos, así como para la evaluación de la eficacia de los medicamentos y la toxicidad [ ^4] .

Capturar la complejidad deEl proteoma representa un desafío tecnológico. Las herramientas proteómicas actuales ofrecen la oportunidad de realizar análisis a gran escala y de alto rendimiento para la identificación, cuantificación y validación de niveles alterados de proteínas. Además, la introducción de técnicas de fraccionamiento y enriquecimiento, destinadas a evitar la interferencia causada por las proteínas más abundantes, también ha mejorado la identificación de proteínas mediante la inclusión de las proteínas menos abundantes. Finalmente, la proteómica se ha complementado con el análisis de las modificaciones postraduccionales, que progresivamente emergen como importantes moduladores de la función de las proteínas.

Sin embargo, la preparación de la muestra y la recuperación de proteínas en los especímenes biológicos en análisis siguen siendo los pasos limitantes en el flujo de trabajo proteómico y aumentar el potencial de posibles trampas [ ^5] . De hecho, en la mayoría de las técnicas de biología molecular que deben ser optimizadas, los primeros pasos son homogenizat de tejidoIon y lisis celular, especialmente durante el análisis de proteínas de baja abundancia para las que no existen métodos de amplificación. Además, la naturaleza química de las proteínas puede influir en su propia recuperación. Por ejemplo, el análisis de proteínas altamente hidrófobas es muy difícil, ya que fácilmente precipitan durante el enfoque isoeléctrico, mientras que las proteínas trans-membrana son casi insolubles (revisado en la Referencia 5). Además, la variabilidad de la composición del tejido crea una barrera significativa para desarrollar un método de extracción universal. Finalmente, debido a que casi todos los especímenes clínicos son de cantidad limitada, es esencial para permitir la preparación de proteínas con máxima recuperación y reproducibilidad de cantidades mínimas de muestra [ ^6] .

Este trabajo describe un protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral cardiaca humana normal, que representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico. La válvula mitral normal es un compLex estructura situada entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo del corazón ( Figura 1 ]. Desempeña un papel importante en el control del flujo sanguíneo desde la aurícula hasta el ventrículo, evitando el reflujo y asegurando el nivel adecuado de suministro de oxígeno a todo el cuerpo, manteniendo así un adecuado gasto cardíaco. Sin embargo, a menudo se considera que es un tejido "inactivo", con una baja celularidad y pocos componentes, principalmente en la matriz extracelular. Esto se debe a que, en condiciones normales, las células valvulares intersticiales residentes (VICs) presentan un fenotipo quiescente con una baja tasa de biosíntesis de proteínas [ ^7] .

Sin embargo, se ha demostrado que, en un estado patológico, el número de VICs en la esponja aumenta y su síntesis de proteínas se activa, junto con otros cambios funcionales y fenotípicos [ ^8] . Por lo tanto, no es sorprendente que los datos mínimosLa literatura se centra en el análisis de las válvulas mitológicas patológicas 9,10, en las que el aumento del número de VIC activados podría explicar el número relativamente elevado de proteínas identificadas.

En conclusión, el presente protocolo puede servir para desarrollar la comprensión de los mecanismos patógenos responsables de las enfermedades de la válvula mitral a través del estudio de los componentes de la válvula valvular mitral. De hecho, una mayor comprensión de los procesos patológicos subyacentes podría ayudar a mejorar el manejo clínico de las enfermedades valvulares, cuyas indicaciones actuales para la intervención se basan principalmente en consideraciones hemodinámicas.

Protocol

En este protocolo, los corazones humanos se recogen durante la explanación multiorganizada (tiempo de isquemia fría de 4 a 12 h, media ± 6 h ± 2 h) de donantes de múltiples órganos excluidos del trasplante de órganos por razones técnicas o funcionales, a pesar de los parámetros ecocardiográficos normales. Se envían al Banco de Tejidos Cardiovascular de Milán, Centro Cardiológico de Monzino (Milán, Italia) para la banca de las válvulas aórtica y pulmonar. Los folíolos mitrales posteriores no se utilizan con fines clínicos, por lo que se recogen durante el aislamiento de la válvula aórtica y pulmonar después de obtener el consentimiento informado de los familiares de los donantes. El tejido para el trasplante y la investigación se recopila sólo después del consentimiento de los padres; En la hoja de consentimiento, autorizan (o no) el uso del tejido cardíaco para investigación sólo si no es adecuado para el uso clínico humano ( es decir, problemas microbiológicos, funcionales y serológicos), siguiendo las directrices del comité de ética deCentro Cardiológico de Monzino.

1. Preparación de la válvula mitral

1. Cosechar la válvula mitral humana tan pronto como sea posible después de la explicación del órgano (tiempo de isquemia fría de 4-12 h).
2. En una habitación limpia, retire el corazón de la bolsa de transporte que contenga una solución fría (4 ° C) ( es decir, una solución salina o medio balanceado Eurocollins o Wisconsin). Colóquelo en un cubo y colóquelo en un gabinete de bioseguridad (flujo de aire vertical de riesgo biológico, clase A, clasificación de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP)) para proceder con la preparación de la válvula.
3. Coloque el corazón sobre un paño desechable estéril en el gabinete. Usando un bisturí desechable estéril, corte el corazón completamente, perpendicularmente a su eje principal, a nivel de los ventrículos izquierdo y derecho, a unos 4 cm del ápice.
4. Mueva la aorta ascendente y la arteria pulmonar para mostrar el techo de la aurícula izquierda.
5. Con fórceps y picos esterilizados en autoclave, corte alrededor de la aurícula izquierdaEl túnel de la aurícula izquierda, haciendo visible la válvula mitral y permitiendo identificar el gran folíolo mitral (anterior) y el pequeño folíolo mitral (posterior).
   NOTA: Las comisuras antero-lateral y medial posterior definen el borde del folíolo anterior y el área posterior.
6. Usando tijeras esterilizables en autoclave y fórceps no traumáticos, disecar la aurícula izquierda y el grosor de la pared del ventrículo alrededor de la circunferencia de toda la válvula mitral .
7. Identificar la continuidad de la válvula mitro-aórtica.
   NOTA: El ventrículo izquierdo contiene toda la válvula mitral y los acordes.
8. Separar el folíolo valvar mitral anterior del folíolo mitral posterior, cortando el folíolo posterior a lo largo de la inserción con el ventrículo (comisura).
9. Lave el folíolo posterior en la solución salina. Cortar el folleto en trozos pequeños (<1 cm ² ) y envolverlos individualmente en papel de aluminio. Snap-freeze con nitrógeno líquido.
   Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido.
   1. Desinfectar la mesa del gabinete con una solución de alcohol isopropílico al 70% y una solución de peróxido de hidrógeno al 6% al final del procedimiento.

2. Extracción de proteínas

1. Utilice un fórceps para recoger la muestra almacenada en nitrógeno líquido e inmediatamente colóquela en hielo seco mientras esté envuelta en el papel de aluminio. No deje la muestra descongelar durante las transferencias.
2. Antes de la molienda, enfríe el mortero de porcelana / zirconio y los pilones de un sistema de molienda ( por ejemplo, CryoGrinder), junto con la muestra, poniéndolos en un matraz de Dewar que contiene nitrógeno líquido (~ 500 ml).
   Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido.
3. Ponga el mortero y las majas en una caja de poliestireno que contiene hielo seco. Retire la muestra de la lámina de aluminio y póngala en el mortero.
4. MolerÉl muestra con el mortero grande contra el mortero 15-20 veces, con el destornillador para girar el mortero. Mezclar la muestra con la punta de una espátula pre-enfriada durante el proceso de molienda.
   1. Repita con el pequeño mortero.
5. Transfiera la muestra molida a un tubo previamente pesado ( p. Ej., Tubo de centrífuga de 15 ml), invirtiendo el tubo, colocándolo sobre el mortero e invirtiéndolo para mover la muestra al tubo. Utilice una espátula previamente enfriada para recuperar todo el material del mortero.
   1. Mantenga el tubo con la muestra en hielo seco para evitar la descongelación de la muestra durante la transferencia.
6. Calcular el peso neto de la muestra.
7. Limpiar el mortero y los pilones después de cada muestra y descontaminarlos en autoclave o calentarlos a 200 ° C durante 2 h.
8. Transferir la muestra en polvo del tubo de centrífuga al tubo de vidrio de un homogeneizador por inversión.
9. Añadir filtro de urea filtrada(8 M de urea, 2 M de tiourea, 4% p / v de CHAPS, 20 mM de Tris y 55 mM de ditiotreitol) al tubo de vidrio, 200 mu l de tampón de urea por cada 10 mg de tejido en polvo.
   NOTA: La muestra residual en polvo que queda en el tubo de centrífuga puede recuperarse utilizando parte del volumen calculado de tampón de urea.
10. Homogeneizar la muestra utilizando un agitador equipado con un mortero de vidrio borosilicato y un pilón de politetrafluoroetileno (PTFE). Presione lentamente el mazo sobre la muestra con un movimiento de torsión (1.500 rpm) 10 veces.
11. Recuperar el sobrenadante y transferirlo a un tubo de centrífuga limpio de 1,7 ml. Extraer de nuevo la muestra restante con tampón de urea fresco, añadiendo la mitad del volumen utilizado durante la primera extracción.
12. Repita el paso 2.10.
13. Recuperar el sobrenadante y combinarlo con el sobrenadante de la etapa 2.11. Colocar el sobrenadante combinado en un rotador de tubo durante 30 min.
14. Centrifugar el tubo durante 30 min a 13.000 xg y 4 ° C.
15. Recuperar el sobrenadanteD medir la concentración de proteína usando el ensayo de proteína Bradford, según las instrucciones del fabricante. Guarde la muestra a -80 ° C hasta su uso.

Results

La extracción y disolución de proteínas en el tampón de urea es directamente compatible con los métodos proteómicos basados ​​en el isoelectroenfoque (electroforesis bidimensional (2-DE) ¹¹ y en el enfoque isoeléctrico en fase líquida (IEF) ¹² ) y con inmunotransferencia después de la dilución en tampón Laemmli ¹³ Que contiene un cóctel inhibidor de proteasa ¹⁴ .

Discussion

Un paso crítico de este protocolo es el uso de nitrógeno líquido para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda. El uso de nitrógeno líquido evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere entrenamiento específico para una manipulación segura.

En este protocolo cuenta con un sistema de molienda para la molienda de la muestra debido a que las pequeñas muestras son difíciles de recuperar de mortero estándar y pilones. En este caso, las pequeñas mu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Medio de transporte equilibrado del órgano. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener el medio equilibrado Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	medio de transporte del órgano equilibrado. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener un medio equilibrado Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Medio de transporte de órganos equilibrado
Riesgo biológico de aire de flujo vertical	Burdinola		Clase A Clasificación GMP
Matraz Dewar	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
Sistema de criomolinillo	OPS diagnóstico	CG 08-01	Sistema de molinillo que contiene morteros, majas y destornilladores
Pinza
Espátula
Bisturí estéril desechable	Medisafe	MS-10
Tijeras de acero inoxidable Esterilizable en			autoclave
Ganzúas			esterilizables
en autoclaveCortina estéril desechable	Mon& Tex	3.307.08
Solución esterilizante con alcohol			70% alcohol isopropílico
Solución esterilizante con peróxido de			al 6% Peróxido de hidrógeno
Micropipeta, 1 mL, con puntas
Tubos de centrífuga de 15 mL VWR	international	9278
Tubos de centrífuga de 1,7 mL VWR	tampón
	internacional 8 M de urea, 2 M de tiourea, 4 % p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Dithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Para ser utilizado para Tampón de Urea
Jeringa 50 mL	PIC		Para ser utilizado para filtrar Tampón de Urea
0.22 µ m filtro	Millipore	SLGP033RB	Para filtrar Tampón de urea
PFTE Mortle, 2 mL	Kartell	6302	Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem
Mortero de vidrio de borosilicato	Kartell	6102	Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem
Agitador	VELP scientifica	Agitador DLH	Para ser utilizado para la homogeneización por Potter-Elvehjem
Bradford Ensayo de proteínas	Laboratorios Bio-Rad	5000006
Rotador de tubos	Pbi International	F205
Nitrógeno
Papel
Hielo Caja
			de poliestireno
Hielo
Centrífuga			Para la centrifugación de tubos de centrífuga de 1,7 mL a 13.000 x g
Congelador -80° C
Balanza
Autoclave			para esterilización
Guantes criogénicos para nitrógeno
Guantes
Horno			para esterilización
Cóctel inhibidor de proteasa	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solución
ProteoExtract Kit de Precipitación de Proteínas	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	versión 2.7	Plataforma de software para el análisis de ontologías genéticas
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	versión 3.0.3	Plugin para análisis de ontología génica
Anticuerpo AlphaB Crystallin/CRYAB Novus	Biologicals	NBP1-97494	Anticuerpo monoclonal de ratón contra CryAB
Anticuerpo Septin-11	Novus Biologicals	NBP1-83824	Anticuerpo policlonal de conejo contra septina-11
Anticuerpo FHL1	Novus Biologicals	NBP-188745	Anticuerpo policlonal de conejo contra FHL-1
Anticuerpo dermatopontin	Novus Biologicals	NB110-68135	Anticuerpo policlonal de conejo contra dermatopontina
Cabra Anti ratón IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Anticuerpo secundario para inmunotransferencia
Cabra Anti conejo IgG HRP	Laboratorios Bio-Rad	170-5046	Anticuerpo secundario para inmunotransferencia