Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Summary

La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.

Abstract

El análisis del proteoma celular puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades debido al desarrollo de tecnologías que permiten la identificación y cuantificación a gran escala de las proteínas presentes en sistemas biológicos complejos. El conocimiento adquirido a partir de un enfoque proteómico puede conducir potencialmente a una Una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes a las enfermedades, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico de enfermedad y, esperamos, de objetivos terapéuticos. Sin embargo, la válvula mitral cardiaca representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico debido a la baja celularidad en el proteoglicano y en la matriz extracelular enriquecida con colágeno. Esto hace que sea difícil extraer proteínas para un análisis proteómico global. Este trabajo describe un protocolo que es compatible con el posterior análisis de proteínas, tales como la proteómica cuantitativa y immunoblotting. Esto puede permitir la correlación de los datosG expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa mRNA y no cuantitativos inmunohistoquímica análisis. De hecho, estos enfoques, cuando se realizan juntos, conducirá a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, desde mRNA a la modificación de la proteína post-traducción. Por lo tanto, este método puede ser relevante para los investigadores interesados ​​en el estudio de la fisiopatología de la válvula cardíaca.

Introduction

La evidencia reciente ha alterado la comprensión de los papeles de los muchos mecanismos reguladores que ocurren después de la síntesis del mRNA. De hecho, los procesos de traslación, post-transcripción y proteolíticos pueden regular la abundancia y la función de las proteínas. El dogma - que dice que las concentraciones de mRNA son proxies a las de las proteínas correspondientes, suponiendo que los niveles de transcripción son el principal determinante de la abundancia de proteínas - ha sido parcialmente revisado. De hecho, los niveles de transcripción sólo parcialmente predecir abundancia de proteínas, lo que sugiere que post- Ocurren para regular las proteínas den....

Protocol

En este protocolo, los corazones humanos se recogen durante la explanación multiorganizada (tiempo de isquemia fría de 4 a 12 h, media ± 6 h ± 2 h) de donantes de múltiples órganos excluidos del trasplante de órganos por razones técnicas o funcionales, a pesar de los parámetros ecocardiográficos normales. Se envían al Banco de Tejidos Cardiovascular de Milán, Centro Cardiológico de Monzino (Milán, Italia) para la banca de las válvulas aórtica y pulmonar. Los folíolos mitrales posteriores no se utilizan con fines clínicos, por lo que se recogen durante el aislamiento de la válvula aórtica y pulmonar después de obtener el consentimiento informado de los familiares de l....

Results

La extracción y disolución de proteínas en el tampón de urea es directamente compatible con los métodos proteómicos basados ​​en el isoelectroenfoque (electroforesis bidimensional (2-DE) ¹¹ y en el enfoque isoeléctrico en fase líquida (IEF) ¹² ) y con inmunotransferencia después de la dilución en tampón Laemmli ¹³ Que contiene un cóctel inhibidor de proteasa ¹⁴ .

Discussion

Un paso crítico de este protocolo es el uso de nitrógeno líquido para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda. El uso de nitrógeno líquido evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere entrenamiento específico para una manipulación segura.

En este protocolo cuenta con un sistema de molienda para la molienda de la muestra debido a que las pequeñas muestras son difíciles de recuperar de mortero estándar y pilones. En este caso, las pequeñas mu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Medio de transporte equilibrado del órgano. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener el medio equilibrado Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	medio de transporte del órgano equilibrado. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener un medio equilibrado Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Medio de transporte de órganos equilibrado
Riesgo biológico de aire de flujo vertical	Burdinola		Clase A Clasificación GMP
Matraz Dewar	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
Sistema de criomolinillo	OPS diagnóstico	CG 08-01	Sistema de molinillo que contiene morteros, majas y destornilladores
Pinza
Espátula
Bisturí estéril desechable	Medisafe	MS-10
Tijeras de acero inoxidable Esterilizable en			autoclave
Ganzúas			esterilizables
en autoclaveCortina estéril desechable	Mon& Tex	3.307.08
Solución esterilizante con alcohol			70% alcohol isopropílico
Solución esterilizante con peróxido de			al 6% Peróxido de hidrógeno
Micropipeta, 1 mL, con puntas
Tubos de centrífuga de 15 mL VWR	international	9278
Tubos de centrífuga de 1,7 mL VWR	tampón
	internacional 8 M de urea, 2 M de tiourea, 4 % p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Dithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Para ser utilizado para Tampón de Urea
Jeringa 50 mL	PIC		Para ser utilizado para filtrar Tampón de Urea
0.22 µ m filtro	Millipore	SLGP033RB	Para filtrar Tampón de urea
PFTE Mortle, 2 mL	Kartell	6302	Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem
Mortero de vidrio de borosilicato	Kartell	6102	Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem
Agitador	VELP scientifica	Agitador DLH	Para ser utilizado para la homogeneización por Potter-Elvehjem
Bradford Ensayo de proteínas	Laboratorios Bio-Rad	5000006
Rotador de tubos	Pbi International	F205
Nitrógeno
Papel
Hielo Caja
			de poliestireno
Hielo
Centrífuga			Para la centrifugación de tubos de centrífuga de 1,7 mL a 13.000 x g
Congelador -80° C
Balanza
Autoclave			para esterilización
Guantes criogénicos para nitrógeno
Guantes
Horno			para esterilización
Cóctel inhibidor de proteasa	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solución
ProteoExtract Kit de Precipitación de Proteínas	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	versión 2.7	Plataforma de software para el análisis de ontologías genéticas
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	versión 3.0.3	Plugin para análisis de ontología génica
Anticuerpo AlphaB Crystallin/CRYAB Novus	Biologicals	NBP1-97494	Anticuerpo monoclonal de ratón contra CryAB
Anticuerpo Septin-11	Novus Biologicals	NBP1-83824	Anticuerpo policlonal de conejo contra septina-11
Anticuerpo FHL1	Novus Biologicals	NBP-188745	Anticuerpo policlonal de conejo contra FHL-1
Anticuerpo dermatopontin	Novus Biologicals	NB110-68135	Anticuerpo policlonal de conejo contra dermatopontina
Cabra Anti ratón IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Anticuerpo secundario para inmunotransferencia
Cabra Anti conejo IgG HRP	Laboratorios Bio-Rad	170-5046	Anticuerpo secundario para inmunotransferencia