Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

Summary

La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.

Abstract

El uso de ratones modificados genéticamente ha contribuido significativamente a los estudios tanto en procesos fisiológicos y patológicos in vivo . La inyección pronuclear de construcciones de expresión de ADN en oocitos fertilizados sigue siendo la técnica más comúnmente utilizada para generar ratones transgénicos para sobreexpresión. Con la introducción de la tecnología CRISPR para la orientación génica, la inyección pronuclear en ovocitos fertilizados se ha extendido a la generación de ratones knock-out y knockin. Este trabajo describe la preparación de ADN para inyección y la generación de guías CRISPR para la orientación génica, con especial énfasis en el control de calidad. Los procedimientos de genotipado necesarios para la identificación de los posibles fundadores son críticos. Se presentan aquí estrategias innovadoras de genotipado que aprovechan las capacidades de "multiplexación" de CRISPR. También se describen procedimientos quirúrgicos. Juntos, los pasos del protocolo permitirán la generación de genY para el posterior establecimiento de colonias de ratón para una plétora de campos de investigación, incluyendo inmunología, neurociencia, cáncer, fisiología, desarrollo y otros.

Introduction

Modelos animales, tanto en vertebrados e invertebrados, han sido fundamentales para examinar la fisiopatología de condiciones humanas como la enfermedad de Alzheimer ^{1 , 2} . También son herramientas invaluables para buscar modificadores de la enfermedad y, en última instancia, desarrollar nuevas estrategias de tratamiento con la esperanza de una cura. Aunque cada modelo tiene limitaciones intrínsecas, el uso de animales como modelos sistémicos enteros es vital para la investigación biomédica. Esto se debe a que el entorno fisiológico metabólico y complejo no puede ser completamente simulado en el cultivo de t....

Protocol

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de Ética y Cuidado de Animales de la Universidad de Nueva Gales del Sur.

1. Preparación del transgén (integración aleatoria)

1. Electroforesis analítica en gel de agarosa.
   1. Digerir el plásmido para extirpar el transgén utilizando enzimas apropiadas (1 h de incubación) o enzimas de digestión rápida (15 a 30 min de incubación) en un termociclador siguiendo las recomendaciones del fabricante (ver Figura 2A y su leyenda).
   2. Se echó un gel de agarosa de ácido tris-acetato-etilendiaminotetraacético al 1% (TEA), teñido....

Results

A continuación, se describen los flujos de trabajo para la microinyección en el caso de la integración aleatoria y la orientación de genes mediados por CRISPR ( Figura 1 ).

Figura 1: Flujo de trabajo típico para la generación de ratones modificados genéticamente. Para la integración aleatoria, el.......

Discussion

Pasos críticos dentro del protocolo

Se sabe que la generación de ratones modificados genéticamente es técnicamente difícil. Sin embargo, el protocolo presentado aquí es un método optimizado y simplificado que permite dominar y solucionar problemas de la técnica en tiempo récord. Hay dos pasos necesarios para la finalización exitosa de la técnica. En primer lugar, la síntesis de plantillas de ADN lineal (para la síntesis de sgRNAs) se puede lograr sin cloruro de magnesio (MgCl ₂ ). Si.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipeta 0,1-2,5 μ L	Micropipeta Eppendorf	4920000016
2 - 20 μ L	Micropipeta Eppendorf	4920000040
20 - 200 μ L	Micropipeta Eppendorf	4920000067
100 - 1.000 μ L	Eppendorf	4920000083
Marcador de peso molecular	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
Marcador de peso molecular	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarosa	Bioline	BIO-41025
Tampón EDTA	Sigma-Aldrich	93296	10x - Diluir a 1x
Bromuro de etidio	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gel stain	Invitrogen	S33102
Kit de extracción de gel	Qiagen	28706
Kit de purificación PCR (Qiaquick)	Qiagen	28106
Sistema de vacío (colector)	Promega	A7231
Tampón de microinyección sin nucleasa	Millipore	MR-095-10F
Filtro de microcentrífuga Ultrafree-MC	Millipore	UFC30GV00
Cas9 ARNm	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
plásmido que expresa CRISPR (px330)	Addgene	42230
Agua libre de nucleasa	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polimerasa	New England Biolabs	M0530L
T7 Kit rápido de ARN de alto rendimiento	New England Biolabs	E2050S
Columnas de centrifugación de purificación de ARN (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Plásmido donante	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hialuronidasa	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa medio de cultivo embrionario	Zenith Biotech	ZEKS-100
Aceite mineral	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Medio	Sigma-Aldrich	M7167
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762
Boquilla	Sigma-Aldrich	A5177
Microcapilares de vidrio	Instrumento Sutter	BF100-78-10
Proteinasa K	Applichem	A3830.0100
Pinzas Dumont #5	Herramientas de Bellas Ciencias	91150-20
Tijeras de iris Herramientas de	ciencia fina	91460-11
Abrazadera de recipiente	Fine Science Tools	18374-43
Pinzas para heridas	Herramientas de Bellas Ciencias	12040-01
Aplicador de clips	Herramientas de Bellas Ciencias	12018-12
Microtijeras	Herramientas de Bellas Ciencias	15000-03
Cauterizador	Herramientas de Ciencia Fina	18000-00
Suturas quirúrgicas no absorbibles (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 incubadora	MG Scientific	Galaxy 14S
	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Termociclador	Eppendorf	6321 000.515
Configuración de electroforesis	BioRad	1640300
Transiluminador UV	BioRad	1708110EDU
Termociclador	Eppendorf	6334000069
Microscopio estereoscópico	Olympus	SZX7
Microscopio invertido	Olympus	IX71
2x Micromanipuladores	Eppendorf	5188000.012
Ovocitos manipulador	Eppendorf	5176000.025
Microinyector (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Ratones C57BL/6J cepa	Australian BioResources	C57BL/6JAusb