Method Article

Análisis de las interacciones proteína-proteína y co-localización entre los componentes de la separación, estrecha, y adhiere a las uniones en las glándulas mamarias murinas

DOI:

10.3791/55772

⸱

May 30th, 2017

 , 
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las uniones intercelulares son requisitos para las funciones y desarrollo específicos de la glándula mamaria. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP) y co-localización utilizando glándulas mamarias murinas. Estas técnicas permiten investigar la dinámica de la asociación física entre las uniones intercelulares en diferentes etapas del desarrollo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las interacciones célula-célula juegan un papel fundamental en la preservación de la integridad del tejido y la barrera entre los diferentes compartimentos de la glándula mamaria. Estas interacciones son proporcionadas por proteínas de unión que forman nexos entre células adyacentes. La pérdida de función y, en consecuencia, la disfunción de los órganos, pueden producir una errónea asociación de proteínas de unión y una asociación física reducida con sus socios de unión. Por lo tanto, identificar la localización de proteínas y las interacciones proteína-proteína (IPP) en los tejidos normales y relacionados con la enfermedad es esencial para encontrar nuevas evidencias y mecanismos que conduzcan a la progresión de enfermedades o alteraciones en el estado de desarrollo. Este manuscrito presenta un método de dos pasos para evaluar los IBP en las glándulas mamarias murinas. En la sección de protocolo 1, se describe un método para realizar co-inmunofluorescencia (co-IF) usando anticuerpos contra las proteínas de interés, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos. Aunque todos losOws para la demostración de la proximidad de las proteínas, permite estudiar sus interacciones físicas. Por lo tanto, se proporciona un protocolo detallado para co-inmunoprecipitación (co-IP) en la sección de protocolo 2. Este método se usa para determinar las interacciones físicas entre proteínas, sin confirmar si estas interacciones son directas o indirectas. En los últimos años, las técnicas co-IF y co-IP han demostrado que ciertos componentes de las uniones intercelulares co-localizan e interactúan entre sí, creando nexos de unión dependientes de la etapa que varían durante el desarrollo de la glándula mamaria.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El crecimiento y desarrollo de la glándula mamaria ocurre principalmente después del nacimiento. Este órgano se remodela constantemente a lo largo de la vida reproductiva de un mamífero 1 . El epitelio de la glándula mamaria adulta está compuesto por una capa interna de células epiteliales luminales y una capa externa de células basales, compuestas principalmente por células mioepiteliales, rodeadas por una membrana basal 2 . Para una buena revisión sobre la estructura y desarrollo de la glándula mamaria, el lector puede referirse a Sternlicht 1 . Las interacciones célula-célula a través de la separación (GJ), estrecha (TJ), y adherens (AJ) las uniones son necesarias para el desarrollo normal y la función de la glándula 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los componentes principales de estas uniones en la glándula mamaria murina son Cx26, Cx30, Cx32 y Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 y -7 yZO - 1 (TJ); Y E-cadherina, P-cadherina y β-catenina (AJ) 7 , 8 . Los niveles de expresión de estas diferentes proteínas de unión varían de una manera dependiente de la etapa durante el desarrollo de la glándula mamaria, lo que sugiere diferencial célula-célula interacción requisitos [ 9] . GJ, TJ y AJ están ligados estructural y funcionalmente y atar otras proteínas estructurales o reguladoras a los sitios vecinos de las células adyacentes, creando así un nexo de unión 10 . La composición del nexo de unión puede impactar el puente con el citoesqueleto subyacente, así como la permeabilidad y estabilidad del nexo, y por consiguiente puede influir en la función de la glándula 8 , 9 , 10 , 11 . Los componentes de las uniones intercelulares que residen en nexos de unión o que interactúan entre sí en difSe analizaron recientemente las diferentes etapas del desarrollo de la glándula mamaria con co-inmunofluorescencia (co-IF) y co-inmunoprecipitación (co-IP) 9 . Mientras que otras técnicas permiten la evaluación de la asociación funcional entre proteínas, estos métodos no se presentan en este manuscrito.

Como las proteínas simplemente actúan solas para funcionar, el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP), como las transducciones de señales y las cascadas bioquímicas, es esencial para muchos investigadores y puede proporcionar información significativa sobre la función de las proteínas. Co-IF y el análisis microscópico ayudan a evaluar algunas proteínas que comparten el mismo espacio subcelular. Sin embargo, el número de dianas está limitado por los anticuerpos, que deben ser criados en diferentes animales, y por el acceso a un microscopio confocal equipado con láseres de longitud de onda diferentes y un detector espectral para multiplexación. Co-IP confirma o revela interacciones físicas de alta afinidad entreEntre dos o más proteínas que residen dentro de un complejo de proteínas. A pesar del desarrollo de nuevas técnicas, como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) 12 y el ensayo de ligación de proximidad (PLA) 13 , que pueden detectar simultáneamente la localización e interacciones de proteínas, el co-IP sigue siendo una técnica apropiada y asequible para estudiar interacciones entre Proteínas endógenas.

El método paso a paso descrito en este manuscrito facilitará el estudio de la localización de proteínas y los IBP y señalará las trampas a evitar al estudiar IPP endógenos en las glándulas mamarias. La metodología comienza con la presentación de los diferentes procedimientos de conservación de los tejidos necesarios para cada técnica. La parte 1 presenta cómo estudiar la co-localización de las proteínas en tres etapas: i) el corte de las glándulas mamarias, ii) el etiquetado doble o triple de diferentes proteínas mediante la técnica del co-IF, y iii)Localización de proteínas. La Parte 2 muestra cómo precipitar una proteína endógena e identificar sus proteínas que interactúan en tres etapas: i) preparación del lisado, ii) inmunoprecipitación indirecta de la proteína, y iii) identificación del asociado de unión por SDS-PAGE y Western blot. Cada paso de este protocolo se optimiza para tejidos de glándula mamaria de roedor y genera resultados de alta calidad, específicos y reproducibles. Este protocolo también puede utilizarse como punto de partida para estudios PPI en otros tejidos o líneas celulares.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los protocolos animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Universitario de Cuidado de Animales (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canadá).

1. Identificación de la co-localización de proteínas

  1. Del tejido a las diapositivas microscópicas
    NOTA: Los tejidos y secciones deben ser manipulados en hielo seco.
    1. Excise las glándulas mamarias de un animal (para una descripción completa de este procedimiento, consulte Plante et al. ) 14 .
    2. Incrusta el tejido escindido en medio de congelación / montaje sobre hielo seco. Añadir suficiente medio para cubrir la glándula. Cuando el medio se solidifica, transfiera los tejidos a un congelador a -80 ° C para uso posterior 9 .
    3. Usando un cryomicrotome establecido a ≤ -35 ​​° C, corte los tejidos en secciones de 7-10 μm de espesor y colóquelos en portaobjetos de microscopio.
      NOTA: Cuando sea posible, coloque dos secciones en cada diapositiva; La sección izquierda se utilizará comoUn control negativo para verificar la especificidad de los anticuerpos y la autofluorescencia del tejido, mientras que el lado derecho se marcará con los anticuerpos.
    4. Mantenga las secciones a -80 ° C para su uso posterior.
  2. Tinción con Co-IF
    1. Recuperar los portaobjetos microscópicos del congelador y fijar inmediatamente las secciones sumergiéndolas en formaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
    2. Luego sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a RT. Deje las diapositivas en PBS a RT hasta continuar con el paso siguiente.
    3. Circule cada sección de la diapositiva usando una barrera hidrófoba disponible comercialmente o un lápiz de laboratorio repelente al agua (vea la Tabla de Materiales ). Tenga cuidado de no tocar el tejido. Inmediatamente agregar gotas de PBS al tejido y colocar la diapositiva en una cámara de histología húmeda para el resto del procedimiento.
      NOTA: Las secciones de tejido deben permanecer hidratadas. AlternativaUtilice una caja con una tapa y coloque toallas de papel mojadas en la parte inferior.
    4. Bloquear cada sección de tejido con 100-200 μl de albúmina de suero bovino al 3% (BSA) - solución salina tamponada con Tris (TBS) -0,1% de polisorbato 20 (véase la Tabla de Materiales ) durante 30 minutos a TA. Mientras las muestras están bloqueando, preparar las soluciones de anticuerpos primario y secundario mediante la dilución de los anticuerpos en TBS-0,1% de polisorbato 20.
      NOTA: La concentración requerida para el anticuerpo es proporcionada por el fabricante; Véase la Tabla de Materiales y las Figuras 1 y 2 para ejemplos, así como Dianati et al. 9 . Aunque no es necesario trabajar en la oscuridad cuando se usa la mayoría de los anticuerpos conjugados con fluoróforo, evite exponer las soluciones de anticuerpos o tejidos teñidos a luz intensa y brillante.
    5. Se retira la solución de bloqueo por aspiración e incuba las secciones en 100-200 μl del anticuerpo primario diluido durante 60 minutos a TA. AlternativelY, incubar con el anticuerpo primario durante la noche a 4ºC.
    6. Eliminar la solución de anticuerpo primario por aspiración y lavar las secciones con 250-500 μ l de TBS-0,1% de polisorbato 20 durante 5 min. Retire la solución de lavado por aspiración y repita el lavado dos veces.
    7. Se retira la solución de lavado por aspiración e incuba las secciones con 100-200 μl del anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado durante 60 minutos a TA.
    8. Eliminar la solución de anticuerpo secundario por aspiración y lavar las secciones con 250-500 μ l de TBS-0,1% de polisorbato 20 durante 5 min. Retire la solución de lavado y repita dos veces.
    9. Repita el paso 2.5-2.8 usando la combinación apropiada de anticuerpos primarios y secundarios para la proteína o proteínas posteriores de interés.
    10. Se retira la solución de lavado por aspiración y se realiza la tinción del núcleo incubando la sección con 100-200 μl de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de 1 mg / ml en TBS-polisorbato al 0,1% 20 durante 5 min aRT.
    11. Retire la solución DAPI por aspiración y monte las diapositivas con un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente (consulte la Tabla de materiales ) y cubreobjetos. Continúe con una diapositiva a la vez.
      NOTA: La incubación de la mancha del núcleo durante más de 5 min no cambiará la intensidad de la tinción. Alternativamente, retire la solución de DAPI en todas las diapositivas e incube los tejidos en PBS mientras monta las diapositivas.
    12. Coloque los portaobjetos planos en un refrigerador de 4 ° C durante al menos 8 h. Proceda a la obtención de imágenes microscópicas de fluorescencia (ver Figuras 1 y 2 ).
  3. Imágenes microscópicas
    1. Visualizar los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo utilizando un microscopio confocal equipado con los diversos láseres necesarios para excitar los fluoróforos en sus longitudes de onda específicas.
      Nota: Para poder visualizar conductos y alvéolos, se sugiere un objetivo de 40X con una apertura numérica de 0.95. Un ejemploE de los ajustes específicos se proporciona en la Figura 1 .
    2. Verificar la localización de cada proteína individualmente escaneando la imagen una longitud de onda en ese momento.
      Nota: En esta etapa, es importante analizar críticamente la localización de las proteínas de unión. Para poder formar nexos de unión, estas proteínas deben estar localizadas en la membrana plasmática.
    3. Determinar la co-localización de proteínas mediante la fusión de las imágenes escaneadas con los láseres en las diferentes longitudes de onda.
      Nota: La co-localización de las proteínas se puede visualizar mediante el cambio de color resultante de la emisión de dos o más fluoróforos en el mismo lugar y puede medirse utilizando el software apropiado ( Figuras 1 y 2 ).

2. El estudio de los IPP

NOTA: Las glándulas mamarias abdominales deben usarse para estudiar los IPP, ya que las glándulas torácicas están en estrecha asociación con el pectoralmúsculos. Excise las glándulas mamarias (para una descripción completa de este procedimiento, véase Plante et al .) 14 y mantenerlos a -80 ° C para su uso posterior.

  1. Preparación del lisado
    1. Coloque papel de pesaje y tubos de microcentrífuga de 2 mL en hielo seco para precalentarlos antes de proceder con los siguientes pasos.
    2. Tome el tejido de la glándula mamaria desde -80 ° C y mantenerlos en hielo seco.
    3. Pesar los tejidos en los papeles de pesaje pre-enfriados y luego transferir el tejido a tubos de microcentrífuga de 2 ml (mango en hielo seco). Utilizar entre 50 y 100 mg de tejido por muestra. Mantenga el tejido en hielo seco hasta el paso 2.1.5.
    4. Preparar la cantidad requerida de tampón de lisis de detergente triple suplementado con NaF, NaVO 3 y inhibidor de proteasa / fosfatasa, como se indica en la Tabla de Materiales , usando las siguientes fórmulas. Ratones: tampón requerido (μL) = peso de tejido de ratón (mg) x 3; Rata: requeridoTampón (μL) = peso del tejido de rata (mg) x 5.
    5. Añadir la cantidad necesaria de tampón de lisis enfriado con hielo (calculado en el paso 2.1.4) al tubo de 2 ml que contiene el tejido.
      NOTA: En los pasos 2.1.5-2.1.6, proceda con un solo tubo a la vez.
    6. Homogeneizar el tejido durante 30-40 s utilizando homogeneización continua en un molino de tejidos; Siempre mantener el tubo en el hielo. Ajuste el homogeneizador de tejidos a velocidad media y mueva suavemente la amoladora hacia arriba y hacia abajo dentro del tubo.
    7. Repita los pasos 1.6 y 1.7 con los otros tubos.
    8. Incubar los lisados ​​en hielo durante 10-30 min.
    9. Centrifugar los tubos a 170 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. Mientras tanto, identifique 6-10 tubos de microcentrífuga (0.6 mL) para cada muestra y manténgalos en hielo.
    11. Una vez realizada la centrifugación, revise los tubos. Asegúrese de que contienen una capa superior de lípidos claros, amarillos a rosados ​​(dependiendo de la etapa de desarrollo) y un gránulo.
    12. Crear un agujero en la capa de lípidosUtilizando una punta de pipeta de 200 μl para acceder a la fase líquida. Cambiar la punta y recoger el lisado sin alterar el gránulo ni aspirar la capa lipídica. Alícuota del lisado en tubos previamente marcados sobre hielo (paso 2.1.11) y almacénelos a -80 ° C.
    13. Utilice una alícuota para cuantificar la concentración de proteína usando un kit comercial apropiado disponible (véase la Tabla de Materiales ).
  2. Inmunoprecipitación indirecta
    1. En hielo, descongelar dos alícuotas de los lisados ​​totales de glándula mamaria preparados previamente.
      NOTA: Se utilizará una alícuota para la IP de la proteína diana, mientras que la otra servirá como control negativo.
    2. Recoger 500-1.000 μ g del lisado y diluir en PBS para llegar a un volumen final de 200 μ l en cada 1,5 ml de tubo.
      NOTA: La cantidad de lisado a utilizar depende de la abundancia de la proteína de interés y de la eficacia del anticuerpo (véase la Figura 3 para unaN ejemplo, así como la Tabla de Materiales ). Para optimizar para cada blanco, deben usarse diferentes cantidades de lisado ( es decir, 500, 750 y 1.000 mu g) y anticuerpo ( es decir, 5, 10 y 20 mu g). Proceda con los siguientes pasos (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Añadir el anticuerpo contra el antígeno de interés para el primer tubo de lisado y mantenerlo en hielo.
      NOTA: La cantidad requerida suele ser sugerida en la hoja de instrucciones proporcionada por cada empresa (vea la Tabla de Materiales ).
    4. En el segundo tubo, preparar un control negativo mediante la adición de la misma concentración de isotipo IgG control que el anticuerpo utilizado en el paso 2.2.3.
    5. Incubar los tubos durante una noche a 4 ° C en un mezclador de rodillos de tubo a baja velocidad.
    6. Al día siguiente, añadir 50 μl de perlas magnéticas a nuevos tubos de 1,5 ml para el prelavado.
      1. Seleccione las perlas magnéticas de Proteína A o Proteína G basadas en la afinidad relativa con el anticuerpo.
      2. Es importante evitar el uso de cuentas agregadas; Mezcle suavemente la suspensión del talón hasta que se vuelva a suspender uniformemente antes de añadirlo a los tubos.
    7. Coloque los tubos que contienen las perlas en el soporte magnético y permita que las perlas migren al imán. Retire el tampón de almacenamiento de las perlas utilizando una pipeta de 200 μl.
    8. Lavar las perlas mediante la adición de 500 μ l de PBS-0,1% polisorbato 20 y vórtice los tubos vigorosamente durante 10 s.
    9. Coloque los tubos de nuevo en el soporte magnético y permitir que los granos de migrar al imán.
    10. Retire el exceso de tampón de lavado pipeteando con una pipeta de 200 μl.
    11. Añadir el complejo de reacción (lisado-anticuerpo) del paso 2.2.5 a las perlas e incubar durante 90 minutos a RT en el mezclador de rodillos.
    12. Coloque los tubos sobre el soporte magnético y permita que las perlas migren al imán. Utilizando una pipeta de 200 μl, aspirar y descartar el lisado y colocar los tubos sobre hielo.
    13. Lavar el cordónS añadiendo 500 μl de PBS, colocando los tubos en el soporte magnético y retirando el líquido usando una pipeta de 200 μl. Repita este paso de lavado. Durante los pasos de lavado, evitar vórtex y mantener las muestras en hielo.
    14. Lavar las perlas una vez con PBS-0,1% de polisorbato 20 sin agitar en vórtice y descartar el último tampón de lavado usando una punta de pipeta de 200 mu l.
    15. Para eluir, añadir 20 μL de glicina ácida 0,2 M (pH = 2,5) a los tubos y agitarlos durante 7 min en el mezclador de rodillos.
    16. Centrifugar a alta velocidad durante unos segundos (centrifugado rápido) y recoger el sobrenadante en un tubo fresco helado.
    17. Repita los pasos 2.2.14 y 2.2.15 para cada tubo.
      NOTA: El volumen final será de 40 μl.
    18. Añadir 10 μl de tampón Laemmli 4x a la muestra eluida de 40 μl de la etapa 2.2.16.
      NOTA: El color se vuelve amarillo debido al pH ácido.
    19. Se añade inmediatamente Tris 1 M (pH = 8), una gota a la vez, a la muestra eluida del paso 2.2.18 hasta que su colorSe vuelve azul. Proceda a los tubos siguientes.
    20. Hervir las muestras de la etapa 2.2.18 a 70-90 ° C durante 10 min. Proceder inmediatamente a electroforesis en gel. Alternativamente, transfiera las muestras a un congelador a -80 ° C hasta su carga.
  3. Aplicación aguas abajo: electroforesis en gel seguido de Western blot
    1. Preparar separando y apilando geles de SDS-PAGE acrilamida (espesor de 1,5 mm) siguiendo los procedimientos estándar 15 .
      NOTA: La elección del gel (8-15% de acrilamida, gradiente: véase la Tabla de Materiales ) debe determinarse en base al tamaño molecular de la proteína a precipitar y de los posibles socios de unión a analizar. Estas proteínas deben resolverse entre sí para permitir una inmunodetección adecuada.
    2. Descongele las muestras de inmunoprecipitación (IP) (paso 2.2.20) sobre hielo.
    3. Preparar lisados ​​de proteínas de las mismas muestras (utilizadas para el procedimiento de IP anterior). Utilice 50 Mu g de lisado total y añadir tampón de muestra Laemmli 4X. Hervir las muestras a 70-90 ° C durante 5 min y colocar en hielo hasta la carga.
      NOTA: Estas muestras se cargarán junto a la muestra de IP eluida para demostrar la presencia de proteínas precipitadas en el lisado total.
    4. Cargar los lisados ​​preparados de la etapa 2.3.3 y las muestras precipitadas de la etapa 2.2.20 lado a lado en un gel de acrilamida y ejecutarlos en tampón de funcionamiento (10 x tampón de funcionamiento: 30,3 g de Tris, 144,1 g de glicina y 10 G de SDS en 1 L de agua destilada) a 100 V durante aproximadamente 95 min, o hasta que el borde de las proteínas migratorias alcance el fondo del gel.
    5. Transferir los geles a una membrana de nitrocelulosa o PVDF utilizando un protocolo estándar 9 , 15 .
    6. Bloquear la membrana durante 1 h en un balancín a baja velocidad en leche seca al 5% -TTBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM y polisorbato 20 al 0,05%).
    7. Identificar si la precipitación fue satisfactoriaExitosa.
      1. Examinar la membrana utilizando el primer anticuerpo contra la proteína precipitada, diluida en 5% de leche seca-TTBS a la concentración recomendada por el fabricante, durante la noche a 4 ° C sobre una plataforma de balanceo con agitación lenta.
        NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para recomendaciones.
      2. Al día siguiente, se lava la membrana 3 veces durante 5 min cada una con TTBS sobre una plataforma basculante con alta agitación.
      3. Incubar la membrana en el anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), diluido en TTBS, durante 1 h a RT en una plataforma oscilante con agitación lenta.
        NOTA: Alternativamente, puede usarse un anticuerpo secundario conjugado con un fluorocromo si está disponible un aparato apropiado para detectar la señal.
      4. Realizar 3 a 6 lavados, cada uno durante 5 min, con TTBS en una plataforma de balanceo con alta agitación. Analizar la señal del anticuerpo secundario incubando la membrana con un anticuerpo comercial(Véase la tabla de materiales ) y siga las instrucciones del fabricante. Detectar la señal utilizando un sistema de imagen de quimioluminiscencia (véase la tabla de materiales ).
        NOTA: Para un protocolo detallado sobre el análisis de transferencia de Western, véase la Referencia 16.
    8. Para identificar proteínas que interactúan, realizar los pasos 2.3.7.1-2.3.7.4 usando los anticuerpos apropiados en la misma mancha.
      NOTA: Si las proteínas están interactuando, los compañeros de unión serán co-inmunoprecipitados con la proteína diana y, por tanto, serán detectables por transferencia Western. El paso 2.3.8 puede repetirse con más anticuerpos para determinar si otras proteínas residen en el mismo complejo de proteínas, siempre y cuando los pesos moleculares de las proteínas difieran lo suficiente como para estar bien separados en el gel y la membrana.
    9. Para confirmar que los interlocutores identificados no son artefactos, se debe realizar una IP recíproca.
      NOTA: Esto se realiza repitiendoPasos 2.2.1-2.2.20 con el mismo lisado pero precipitando uno de los socios de unión identificados en el paso 3.8. Después, los pasos 3.1-3.8 se repiten usando el anticuerpo primario contra la primera proteína de interés.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para determinar si los componentes de GJ, AJ y TJ pueden interactuar juntos en la glándula mamaria, se realizaron primero ensayos de co-IF. Cx26, una proteína GJ, y β-Catenina, una proteína AJ, se probaron con anticuerpos específicos y se revelaron usando anticuerpos de ratón-647 (verde, pseudocolor) y cabra-568 (rojo) conjugados con fluoróforo, respectivamente ( Figura 1B y C ) . Los datos mostraron que co-localizar en la membrana celular de células epi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las interacciones célula-célula a través de las uniones son necesarias para el correcto funcionamiento y desarrollo de muchos órganos, como la glándula mamaria. Los estudios han demostrado que las proteínas de unión pueden regular la función y la estabilidad de unos a otros y activar la transducción de señales al atarse mutuamente en la membrana celular [ 10] . Los protocolos presentados en el actual manuscrito han proporcionado interesantes descubrimientos sobre la proteína de unión expresión di...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IP es financiado por una beca del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería del Canadá (NSERC # 418233-2012); Un Fondo de Investigación de Quebec-Santé (FRQS), un premio de carrera de la Fundación de Cáncer de Mama de Quebec y una subvención de Leader Founds de la Fundación Canadiense para la Innovación. ED recibió una beca de la Fundación universitaria Armand-Frappier.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cepa y etapa de ratonesSt. Constant, Quebec, CanadáC57BL/6 Females; día de embarazo 18 (P18) y día de lactancia 14 (L14), Charles River Canadá 
PBS 10x (culata)1) Disolver 80 g de NaCl (F.W.: 58,44), 2 g de KCl (F.W. 74,55), 26,8 g de Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268.07) y 2,4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) en 800 mL de agua destilada;
2) Ajuste el PH a 7.4;
3) Agregue agua hasta alcanzar el volumen final de 1 L.
TBS 10x (culata)1) Disolver 60,5 g de TRIS, 87,6 g de NaCl en 800 ml de agua destilada;
2) Ajuste el pH a 7.5;
3) Añadir agua hasta alcanzar el volumen final de 1 L.
Parte 1: Medios de inmunofluorescencia
congelaciónVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canadá95067-840VMR compuesto de secciones congeladas 
MicrotomoMississauga, ON, Canadá956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
BladesC.L. Sturkey, Inc. Les Produits  Scientifiques  ESBE  St-Laurent, QC, CanadáBLM1001C Hojasrecubiertas de oro de alto perfil
Bolígrafo PapCedarlane, Burlington, ON, Canadá8899Bolígrafo Super PAP, Thermo Fisher Scientific
Portaobjetos microscópicosFisher Scientific, Burlington, ON, Canadá12-550-15Fisherbrand  Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus
FormaldehídoBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadáFOR201.1Forlmadehyde
Albúmina sérica bovina (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, EE. UU.
Solución3% BSA en TBS
Soluciónde lavado TBS-Tween 20 0.1%
Polisorbato 20Oakville, ON, CanadáP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Medios de montajeCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
Primeros anticuerpos y anticuerpos secundariosSeñalización celular, Beverly, MA, EE. UUVer comentariosE-Cadherin (4A2) mAb de ratón (#14472s) 1/50 (Señalización celular) con IgG anti-ratón Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Señalización celular 
Primeros anticuerpos y anticuerpos secundarios Life technologies, Waltham, MA, EE. UU. y Señalización celular, Beverly, MA, EE. UUVer comentariosClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) con IgG anti-conejo Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Señalización celular) 
Primeros anticuerpos y anticuerpos secundarios Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, Estados Unidos; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canadá  Ver Comentariosβ-Anticuerpo de Catenina (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) con anti-IgG de Cabra (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Sonda Molecular (Fisher Scientific)
Primeros y secundarios anticuerpos Life technologies, Waltham, MA, EE. UU. y Señalización celular, Beverly, MA, EE. UUVer comentariosConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) con IgG Fab2 anti-ratón Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Tinción de núcleosFisher Scientific, Burlington, ON, CanadáD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) 1/1.000 en PBS
Microscopio fluorescenteNikon Canada, Mississauga, On, CanadáLáser microscópico confocal Nikon A1R+ equipado con un detector espectral 
Software de análisis de imágenes de FINikon Canada, Mississauga, On, CanadaSoftware de elementos NIS (versión 4)
Parte 2: Inmunoprecipitación
tampón de lisis de triple detergente (100  mL) pH=8.01) Mezcla 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150  mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Azida de Sodio, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Desoxicolato de Sodio en 80 mL destilados H2O.
2) Ajuste el pH a 8.0 con HCl 6  N (~0.5  mL).
3) Ajuste el volumen a 100  mL. Guárdelo en el refrigerador.
El día de la extracción de proteínas, use 1/100 NaVo3, 1/100 inhibidor de proteasa/fosfatasa y 1/25 NAF en la cantidad calculada de Tampón de lisis de detergente triple:
solución de fluoruro de sodio (stock) 1.25  M (F.W.: 41.98), Ortovanadato de Sodio (Stock) Solución 1  M (F.W.: 183.9)
Inhibidor de la proteasa/fosfatasaFisher Scientific, Burlington, ON78441Cóctel de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa Halt, sin EDTA (100x)
Dosis de proteínasThermo Scientific, Rockford, Illinois, EE. UU23225Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA 
Amoladora de pañuelosFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, modelo FTH-115
Perlas magnéticas y soporteMillipore, Etobicoke, ON, CanadáPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Solución de lavado para IPPBS o PBS-Tween20 0,1% dependiendo del paso
Anticuerpos primarios para la inmunoprecipitaciónCell Signaling, Beverly, MA, EE. UU.Ver ComentariosIgG Conejo (conejo (DA1E) mAb IgG Control del isotipo (#3900s) (Señalización celular) 0.5 y micro; L/200 y micro; L
Anticuerpos primarios para la inmunoprecipitaciónSeñalización celular, Beverly, MA, EE. UU.Ver comentariosIgG Ratón ratón (G3A1) mAb IgG Control del isotipo (#5415s) (Señalización celular) 0,5 y micro; L/200 y micro; L
Anticuerpos primarios para la inmunoprecipitaciónSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadáVer comentariosConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  y micro; L/200  y micro; L
Anticuerpos primarios para la inmunoprecipitaciónSeñalización celular, Beverly, MA, EE. UUVer comentariosE-cadherina (4A2) MAb de ratón (#14472s) (Señalización celular) 1 y micro; L/200 y micro; L
Tampón Laemmli BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canadá16107474x Tampón de muestra Laemmli (Agregue β-mercaptoetanol siguiendo la recomendación del fabricante)
Glicina ácida Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50.2 M glicina; ajuste pH=2.5 con HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
Geles de acrilamida SDS-PAGE BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1610180 -5TGX Soluciones de acrilamida FastCast sin manchas (7,8 %, 10 %, 12 %)
Tampón de ejecución 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1704272Tris 30.3  g/glicina 144.1  g /SDS 10  g en 1 L de agua destilada
MembranasBIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1704272Membranas de PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini Kit de transferencia de PVDF
Método de transferenciaBIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1704155Sistema de transferencia Trans-Blot Turbo
Leche en polvoSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadáLeche descremada instantánea sin grasa en polvo, clavel
Solución de bloqueo para clots5% leche en polvo en TBS-Tween 20 0.1%
Soluciones de lavado para blotsTBS-Tween 20 0.1%
Anticuerpos primarios y secundarios para blots (10  mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentariosConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2.500 con Veriblot conjugado con HRP para anticuerpo secundario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Anticuerpos primarios y secundarios para blots (10  mL)Señalización celular, Beverly, MA, EE. UU. y Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentariosE-cadherina (24E10) mAb de conejo 1/1.000 (#3195s) (Señalización celular) 1/1.000 con Veriblot conjugado con HRP para anticuerpo secundario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Anticuerpos primarios y secundarios para blots (10  mL)Life technologies, Waltham, MA, EE. UU. y Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentariosClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1.000 con Veriblot conjugado con HRP para anticuerpo secundario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Anticuerpos primarios y secundarios para blots (10  mL)Life technologies, Waltham, MA, EE. UU. y Abcam, Toronto, ON, CanadáVer comentariosClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1.000 con Veriblot conjugado con HRP para anticuerpo secundario IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)
Solución de luminol para la detección de señales en blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1705061Clarity Western ECL Blotting Blotting
Substrate Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá1708280ChemiDoc MP Imaging sistema
de análisis de manchasBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadáSoftware ImageLab 5.2 
fuertes de bloqueo . . . . .

References

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