Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

Resumen

La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso.

Resumen

La proteína Cpf1 asociada a CRISPR cliva ADN de doble cadena bajo la guía de ARN CRISPR (CRRNA), generando extremos pegajosos. Debido a esta característica, Cpf1 se ha utilizado para el establecimiento de un estándar de ensamblaje de ADN llamado C-Brick, que tiene la ventaja de sitios de reconocimiento largos y cicatrices cortas. En un vector estándar de C-Brick, hay cuatro sitios de reconocimiento Cpf1 - el prefijo (sitios T1 y T2) y el sufijo (sitios T3 y T4) - partes flanqueantes de ADN biológico. La escisión de los sitios T2 y T3 produce extremos pegajosos complementarios, que permiten el ensamblaje de partes de ADN con sitios T2 y T3. Mientras tanto, se genera una cicatriz corta "GGATCC" entre las piezas después del montaje. Como el plásmido recién formado contiene de nuevo los cuatro sitios de escisión de Cpf1, el método permite el ensamblaje iterativo de partes de ADN, que es similar a las de los patrones de BioBrick y BglBrick. Un procedimiento que describe el uso de la norma C-Brick para ensamblar partes de ADNSe describe aquí. El estándar de C-Brick puede ser ampliamente utilizado por científicos, estudiantes de posgrado y de pregrado, e incluso aficionados.

Introducción

La estandarización de las partes biológicas del ADN es importante para el desarrollo de la biología sintética ¹ . El desarrollo de un procedimiento de ensamblaje de ADN puede reemplazar diseños experimentales ad hoc y eliminar muchos de los resultados inesperados que surgen durante el ensamblaje de componentes genéticos en sistemas más grandes. El estándar BioBrick (BBF RFC 10) fue uno de los primeros estándares de ensamblaje de ADN propuestos. Utiliza la secuencia de prefijo (que contiene sitios de corte EcoRI y XbaI) y la secuencia de sufijo (que contiene sitios de corte SpeI y PstI) ^{2 ,}

Protocolo

1. Preparación de CRRNA

1. Preparación de plantillas de CRRNA
   1. Re-suspender los oligonucleótidos individuales ( Tabla 1 ) en agua libre de RNasa a una concentración de 10 μM.
   2. Se a~naden 22,5 μl de oligonucleótido de hebra superior (T7-F en la Tabla 1 ), 22,5 μl de oligonucleótido de cadena inferior ( Tabla 1 ) y 5 μl de tampón de recocido 10x a un tubo de PCR de 0,2 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl.
      NOTA: En la Tabla 1 se muestran seis oligonucleótidos diferentes de hebras inferiores, cada uno de los cuales debería estar emparejado in....

Resultados

Este protocolo demostró el ensamblaje de tres casetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), y amilGFP (BBa_K592010)). En primer lugar, las secuencias codificantes de los tres genes y terminadores mencionados anteriormente se clonaron individualmente en un vector estándar de C-Brick. Partes cortas de ADN, promotor y terminador, se introdujeron en el vector C-Brick mediante amplificación por PCR usando cebadores que contenían las partes cortas de ADN en el extremo .......

Discusión

Este protocolo describe un procedimiento para el ensamblaje de ADN estándar C-Brick. El paso más importante en este protocolo es la linealización del vector estándar de C-Brick; La escisión incompleta del vector podría afectar seriamente la tasa de éxito. Adicionalmente, aunque Cpf1 escinde principalmente secuencias de ADN diana en el patrón de escisión "18-23", también se detectó una escisión imprecisa cerca de las dos bases ⁴ , lo que puede causar un pequeño número de mutaciones despu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Comercial Oligonucleótido	Sangon Biotech
10x Taq Tampón PCR	Transgen	#J40928
Agua Destilada Ultra Pura	Invitrogen	10977-015
5x Tampón de transcripción de ARN	Thermo Scientific	K0441
T7 ARN polimerasa	Thermo Scientific	#EP0111
Mezcla NTP	Sangon	#ND0056
RRI (Inhibidor de ARNasa recombinante)	Takara	2313A
ARN limpio & Concentrador-5	Zymo Research	R1015
Espectrómetro UV-Vis	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer	Vazyme	PB505	PCR tampón
dNTPs	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerasa	Vazyme	P505-d1
Ezmax para la clonación en un solo paso	Tolobio	24303-1 kit de	montaje sin costuras
5x Tampón para clonación Ezmax en un solo paso	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Tampón 3	NEB	#B7003S
10x Tampón CutSmart	NEB	B7204S
10x Tampón de ADN ligasa T4	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 ADN ligasa	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Sistema de limpieza de gel y PCR	Promega	A9282
Mini kit de plásmidos I	Omega	D6943-02 kit de	preparación de plásmidos
fosfatasa alcalina termosensible	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Tampón Cpf1	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
termociclador	Applied Biosystems	veriti 96 pocillo
C-Brick vector estándar	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Luria-Bertani media (triptona)	Oxoid	LP0042
Luria-Bertani media (extracto de levadura)	Oxoid	LP0021
Luria-Bertani media (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007