Inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de los microtúbulos en el cerebro en desarrollo del pez cebra se describen los métodos, que son ampliamente aplicables a otros tejidos. El primer protocolo describe un método optimizado de inmunomarcación microtúbulos estables y dinámicos. El segundo protocolo proporciona un método para la imagen y cuantificar nacientes microtúbulos específicamente.
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Artículo de método
Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra
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Resumen
Resumen
Microtúbulos (MTs) son dinámicas y frágiles estructuras que son un reto a la imagen en vivo, particularmente en embriones de vertebrados. Aquí se describen los métodos de inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de MTs en el tubo neural en desarrollo del embrión de pez cebra. Mientras el foco está en tejido neural, esta metodología es ampliamente aplicable a otros tejidos. Los procedimientos están optimizados para temprano a embriones en fase mediados somitogenesis (1 somite a 12 somitas), sin embargo se pueden adaptar a una amplia gama de otras etapas con ajustes relativamente menores. El primer protocolo proporciona un método para evaluar la distribución espacial de MTs estables y dinámicos y realizar un análisis cuantitativo de estas poblaciones con software de procesamiento de imagen. Este enfoque complementa las herramientas existentes para imagen microtúbulos dinámica y distribución en tiempo real, usa líneas transgénicas o la expresión transitoria de construcciones etiquetadas. De hecho, estas herramientas son muy útiles, sin embargo no distingue fácilmente entre MTs dinámicos y estables. La capacidad de la imagen y analizar estas poblaciones distintos microtúbulos tiene importantes implicaciones para los mecanismos de comprensión polarización celular y la morfogénesis. El segundo protocolo describe una técnica para analizar específicamente nacientes MTs. Esto se logra mediante la captura de las propiedades de crecimiento de novo de MTs en el tiempo, siguiendo la despolimerización de microtúbulos con el nocodazole drogas y un período de recuperación después de lavado de drogas. Esta técnica no se ha aplicado al estudio de MTs en embriones de pez cebra, pero es un valioso análisis para investigar la función en vivo de proteínas implicadas en el montaje del microtubule.
Introducción
Los microtúbulos (MTs) son polímeros de α - y β-tubulina que montar en protofilaments lineal, varios de los cuales se combinan para formar un tubo hueco1,2. MTs son estructuras polarizadas, con rápido crecimiento más extremos y de crecimiento lento menos extremos que están anclados en el centrosoma o de organización de microtúbulos centro (MTOC)3. De novo Formación de MT es iniciada por nucleación en el complejo de anillo de γ-tubulina (γ-TURC), que proporciona una plantilla para montaje MT4. En cualquier célula dada, dos poblaciones de MTs se pueden dis....
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Protocolo
declaración de ética: los procedimientos describen a continuación sigue la Universidad de las pautas de cuidado de los animales de Maryland Baltimore County.
1. Análisis de estable y dinámico MTs uso de inmunomarcación (protocolo 1)
- dechorionation Manual de embriones antes de la fijación
- obtener recién generado embriones vertiendo el agua de exceso del sistema y luego recoger embriones restantes en un plato de Petri de plástico (consulte la Tabla de materiales).
- Eliminar cualquier residuo de los embriones de agua y la transferencia del sistema a un nuevo plato lleno con medio ....
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Resultados
Análisis de MTs estables y dinámicos mediante inmunomarcación
En el Protocolo 1, se revelaron la distribución de las subpoblaciones de MT durante temprano (quilla neural) y últimas etapas (barra neural) del desarrollo del tubo neural, con Glu-tubulina y Tyr-tubulina como marcadores para MTs estables y dinámicas, respectivamente. Dinámicas MTs predominan en el cerebelo en el estadio de la quilla neural (4-5 somitas) (figura 2
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Discusión
Actualmente existen muchos métodos para la proyección de imagen dinámica del MT en el desarrollo temprano del pez cebra, que van desde imágenes directo de moléculas etiquetadas inmunomarcación de fijo tejido11,12,13,14. Aunque MTs en una sola célula pueden existir en Estados estables o dinámicos, epitelización es un proceso en el cual MTs se estabilizan progresivamente con el tiempo. Uso de mar.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El microscopio confocal fue adquirido con fondos de Estados Unidos National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. La investigación fue apoyada por los Estados Unidos nacional institutos de salud nacional Instituto de General ciencias médicas (NIH/NIGMS) grant #GM085290 y los Estados Unidos Departamento de defensa (DOD) grant #W81XWH-16-1-0466 adjudicado a R.M. Brewster. E. Vital fue apoyado por una beca a UMBC de la Howard Hughes Medical Institute a través del preuniversitario y licenciatura Ciencias Educación, grant #52008090. S.P. Brown fue apoyado por un departamento de los Estados Unidos de educación GAANN becas, una beca de postgrado de Meyerhoff financia....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Se utiliza para tratar los petriplatos. Prepare agarosa al 1% calentando una solución de 1 gramo de agarosa por 100 ml de medio embrionario 1X en un microondas hasta que se polimerice. | ||
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Montaje anti-decoloración medio | Invitrogen | P10144 | |
| Ratón anti-β-tubulina | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | E7 | 1/200 |
| Conejo anti-γ-tubulina | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Conejo anti-&alfa;-tubulina | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Conejo anti-tubulina destirosinada | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titule el anticuerpo con el primer uso del nuevo lote. |
| Conejo anti-tubulina tirosinada | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Ratón anti-céntrico | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Cabra 488 anti-conejo | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Cabra 594 anti-conejo | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Cabra 594 anti-ratón | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Cabra 488 anti-ratón | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome Pinza Vibratome | 1500 | ||
| World | Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm placa de Petri | Tratamiento de células | 229693 | |
| placa de Petri de 35 mm | Tratamiento de células | 229638 | |
| 50 ml tubo de halcón | Fisher | 14-432-22 | |
| Malla de nailon tejida 70 mmm | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipeta | Gilson | F123602 | |
| Pipeta de vidrio | Fisher | NC-999363-9 | |
| Sellador de acuarios | Amazon.com, de MarineLand | Sellador de silicona 1 oz (tubo) | |
| Soporte de anillo | Fisher | 14-675BO | |
| Tubo de PTFE de microdiámetro, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Arcilla para modelar | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Cualquier arcilla para modelar no tóxica a base de cera o aceite será suficiente |
| Abrazadera | Fisher | 02-215-466 | |
| Jeringa de 60 ml | Fisher | 14-820-11 | |
| Medio embrionario (E3) | 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2· 2H2O 9.78 g MgCl2· 6H2O Para preparar un caldo 60X, disuelva los ingredientes en H2O, hasta un volumen final de 2 L. Ajuste el pH a 7.2 con NaOH. Autoclave. Para preparar el medio 1X, diluya 16,5 mL del caldo 60X a 1 L. | ||
| Solución Bloqueante | 50 ml TBS-NP-40 2,5 ml suero de cabra normal 1 g BSA 625 µ l Triton-X | ||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 | ||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 | ||
| Software de procesamiento de imágenes 3-D comercial | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Calentador de bloque seco | VWR | 12621-108 | Se utiliza como placa caliente para fundir agarosa en el Protocolo 1. |
| Microscopio de disección | Leica | MZ12 | |
| Microscopio confocal | Leica | SP5 | |
| Molde de incrustación plano | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Software de procesamiento de imágenes de dominio público | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * El éxito varía según el número de lote |
Referencias
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and de....
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Reimpresiones y permisos
