Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción

Resumen

Se presenta un protocolo para la cristalografía de rayos X utilizando microcristales de proteínas. Se comparan dos ejemplos que analizan microcristales de crecimiento in vivo después de la purificación o en celulo .

Resumen

El advenimiento de líneas de luz de microfoco de alta calidad en muchas instalaciones de sincrotrón ha permitido el análisis de rutina de cristales menores de 10 μm en su dimensión más grande, lo que representaba un desafío. Presentamos dos flujos de trabajo alternativos para la determinación de la estructura de microcristales de proteínas por cristalografía de rayos X con un enfoque particular en los cristales crecidos in vivo . Los microcristales se extraen de las células mediante sonicación y se purifican mediante centrifugación diferencial o se analizan en celulo después de la clasificación celular mediante citometría de flujo de células que contienen cristal. Opcionalmente, los cristales purificados o las células que contienen cristal se empapan en soluciones de átomos pesados ​​para el phasing experimental. Estas muestras se preparan entonces para experimentos de difracción de una manera similar por aplicación sobre un soporte de micromesh y enfriamiento rápido en nitrógeno líquido. Describimos brevemente y comparar los experimentos de difracción en serie de microcristales aislados y cristal-Que contienen células que utilizan una línea de luz de sincrotrón microfoco para producir conjuntos de datos adecuados para la fase, la construcción de modelos y el refinamiento.

Estos flujos de trabajo se ejemplifican con cristales de la poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) producida por la infección de células de insecto con un baculovirus recombinante. En este caso de estudio, en el análisis de celulo es más eficiente que el análisis de cristales purificados y produce una estructura en ~ 8 días desde la expresión hasta el refinamiento.

Introducción

El uso de la cristalografía de rayos X para la determinación de estructuras de alta resolución de macromoléculas biológicas ha experimentado una progresión constante en las últimas dos décadas. La creciente aceptación de la cristalografía de rayos X por investigadores no expertos ejemplifica la democratización de este enfoque en muchos campos de las ciencias de la vida ¹ .

Históricamente, los cristales con dimensiones inferiores a ~ 10 μm han sido considerados como desafiantes, si no inutilizables, para la determinación de la estructura. La creciente disponibilidad de rayos de luz de microfoco dedicados a fuentes d....

Protocolo

Nota: Se ha descrito cristalización in vivo en muchos organismos incluyendo bacterias, levaduras, plantas, insectos y mamíferos (revisado en la referencia ²¹ ). La cristalización de proteínas recombinantes también se ha conseguido en el laboratorio usando transfección transitoria de células de mamífero e infección por baculovirus de células de insecto. El protocolo siguiente se ha desarrollado utilizando el gen de poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clonado en un baculovirus recombinante bajo el promotor de poliedrina de baculovirus, generado según las instrucciones de la referencia ²² . Por lo....

Resultados

Una presentación general de ambos métodos alternativos para la determinación de la estructura utilizando microcristales in vivo se presenta ( Figura 1 ]. Los poliedros se pueden purificar fácilmente mediante sonicación y centrifugación. Debido a su densidad, forman una capa en la parte inferior del tubo por debajo de una capa de desechos que se pueden eliminar por pipeteado ( Figura 3a y 3b ). La muestr.......

Discusión

Este protocolo proporciona dos enfoques para analizar microcristales con el objetivo de facilitar el análisis de cristales muy pequeños que se hubieran pasado por alto en el pasado.

Pasos críticos para la purificación de microcristales
El protocolo presentado ha sido optimizado utilizando la poliedrina Bombyx mori CPV1 expresada en células Sf9 como sistema modelo. Sin embargo, los microcristales in vivo muestran una gran variabilidad en la resistenci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células Sf9	Life Technologies
SF900-SFM medio para insectos	Life Technologies
Matraz de cultivo celular de 1 L	Thermofisher Scientific
Incubadora agitadora para cultivo de células de insectos	Eppendorf
50 mL tubos cónicos	Falcon
Centrífuga con cubos oscilantes para 50 mL tubos	Eppendorf
Sonicator equipados con una sonda de 19 mm	MSE Soniprep 150
Portaobjetos de vidrio	Hampton Research
Hemacitómetro	Sigma-Aldrich
Yoduro de propidio	Thermofisher Scientific
BD Clasificador de células de influjo	BD Biosciences
Hampton Heavy atom	Hampton Research
Microcentrífuga	Eppendorf
Micromesh	Mitigen		700/25 ofrecen una superficie más grande. Las mallas indexadas se pueden comprar para estudios sistemáticos.
El			tamaño de la mecha del papel se puede variar para obtener un flujo óptimo. Esto dependerá en gran medida de la naturaleza de los cristales y del crioprotector utilizado.
Etilenglicol	Sigma-Aldrich
Azul de tripano	Línea
	Sincrotrón		Se puede encontrar una lista de líneas de haz de microfoco disponibles en Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793– 1806, doi:10.1071/CH14455.

Las mallas de de luz de microfoco MX2 de Life Technologies australiano