Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

Summary

Existen células del estroma de la médula (MSC) con potencial neural dentro de la médula ósea. Nuestro protocolo enriquece esta población de células a través de un preacondicionamiento hipóxico y luego las dirige a convertirse en células maduras de Schwann.

Abstract

Este manuscrito describe un medio para enriquecer a progenitores neurales de la población de células estromales de médula (MSC) y posteriormente dirigirlos al destino maduro de células de Schwann. Se sometieron las MSC de rata y humana a condiciones hipoxicas transitorias (1% de oxıgeno durante 16 h), seguido de expansión como neurosferas sobre su- plemento de unión baja con factor de crecimiento epidérmico (EGF) / suplemento de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). Las neurosferas se sembraron en un plástico de cultivo de tejidos recubierto con poli-D-lisina / laminina y se cultivaron en un cóctel gliogénico que contenía β-Heregulina, bFGF y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para generar células similares a células de Schwann (SCLC). Los SCLC se dirigieron al compromiso de destino a través del cocultivo durante 2 semanas con neuronas purificadas de ganglios de la raíz dorsal (DRG) obtenidas de ratas Sprague Dawley gestantes E14-15. Las células maduras de Schwann demuestran persistencia en la expresión de S100β / p75 y pueden formar segmentos de mielina. Las células generadas de esta manera tienen potencialEn el trasplante de células autólogas después de la lesión de la médula espinal, así como en el modelado de la enfermedad.

Introduction

El trasplante de progenitores neurales y sus derivados demuestra la promesa como una estrategia de tratamiento después de la lesión nerviosa traumática ^{1 , 2} y la neurodegeneración [ ^{3 , 4]} . Antes de la aplicación clínica, es esencial asegurar: i) un método para acceder y expandir sobre una fuente autóloga de células madre / progenitoras y ii) un medio para dirigirlos a tipos de células maduras relevantes ³ . Nuestro interés en la terapia celular para la lesión de la médula espinal nos llevó a buscar una robusta, autóloga célu....

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con animales se realizaron en estricta conformidad con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobado por el Comité sobre el Uso de Animales Vivos para la Enseñanza y la Investigación, Li Ka Shing Facultad de Medicina de la Universidad de Hong Kong. Se obtuvieron muestras de médula ósea humana de la cresta ilíaca de donantes sanos después de obtener el consentimiento informado. Los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional, la Universidad de Hong Kong.

1. Preparación de cultivos MSC de rata

1. Cosecha de MSCs del fémur
   ....

Results

En la Figura 1 se ilustra una visión general de las etapas clave de nuestro protocolo. En resumen, las MSC de rata y humana se seleccionan por adhesión al plástico de cultivo de tejidos. Los MSC expandidos se precondicionan con hipoxia y luego se someten a condiciones de formación de neurosfera. Neurospheres se platean y permiten diferenciar en SCLCs. Los SCLC son cocultivados con neuronas DRG purificadas para generar células Schwann comprometidas por el des.......

Discussion

Es esencial para preservar el "stemness" de MSCs antes del enriquecimiento de progenitores neurales a través de precondicionamiento hipóxico y neurosphere cultura. A partir de nuestra experiencia, MSC multipotentes pueden ser identificados de forma fiable por su morfología de tipo fibroblastos alargada. Por el contrario, las MSC que han adoptado una morfología cuadrangular más aplanada, con fibras prominentes de estrés citoesquelético, no adoptan fácilmente los destinos celulares neuronales y deben ser descart.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
y alfa; MEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher scientific	12400-024
Medio neurobasal	Thermofisher scientific	21103-049
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	Thermofisher scientific	17504-001
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)	Thermofisher scientific
Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF)	Peprotech	100-18B/100UG
Factor de crecimiento nervioso (NGF)	Millipore	NC011
Factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA)	Peprotech	100-13A
Heregulina beta-3, dominio EGF (β-Her)	Millipore	01-201
Uridina	Sigmaaldrich	U3003
5-Fluro-2' - desoxiuridina (FDU)	Sigmaaldrich	F0503
Poly-D-lisina (PDL)	Sigmaaldrich	P7886-1G
Laminina	Thermofisher scientific	23017015
GlutaMAX	Thermofisher scientific	35050061
Penicilina / estreptomicina (P/S)	Thermofisher Scientific	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher Scientific	12604-013
Placa de 10 cm para cultivo	adherenteTPP	93100	Se utiliza para la selección de MSC mediante adherencia al cultivo de tejidos
Placa de 6 pocillos para cultivo adherente	TPP	92006	Se utiliza para la expansión de MSCs después del paso
Placa ultrabaja de 6 pocillos para cultivo no adherente	Corning	3471	Utilizado para el enriquecimiento de progenitores neuronales
anti-humano CD90(Thy-1)	BD Biosciences	555593
anti-humano CD73	BD Biosciences	550256
anti-humano/rata STRO-1	R& D Systems	MAB1038
nestina antihumana	R& D Systems	MAB1259
anti-humano CD45	BD Biosciences	555480
anti-rata CD90(Thy-1)	BD Biosciences	554895
anti-ratas CD73	BD Biosciences	551123
nestina anti-ratas	BD Biosciences	MAB1259
anti-ratas CD45	BD Biosciences	554875
Anti-S100 y beta;	Dako	Z031101
Anti-p75	Millipore	MAB5386
Anti-GFAP	Sigmaaldrich	G3893
Anti-Clase III-beta tubulina (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
Núcleos antihumanos	Millipore	MAB1281
Cámara de hipoxia	Billups-Rothenberg	MIC-101
HEPES tampón	Sigmaaldrich	H4034-100G