Seccionando los Montes Enteros de las Glándulas Mamarias para la Identificación de Lesiones

Resumen

Desarrollamos un método para eliminar, procesar, seccionar y teñir exitosamente, para la evaluación histopatológica, el tejido mamario que originalmente había sido fijado en diapositivas como monturas enteras. Este método puede promover la recolección y evaluación de monturas enteras de glándulas mamarias en estudios de referencia de pruebas reproductivas y de desarrollo.

Resumen

El desarrollo normal de las glándulas mamarias puede verse alterado por la exposición a tóxicos ambientales y productos farmacéuticos, exposición excesiva a hormonas y alteraciones genéticas. Las guarniciones enteras de la glándula mamaria son un método barato para capturar la progresión de los cambios morfológicos que pueden surgir después de la exposición. Sin embargo, en la vida posterior, cuando las anomalías son más propensas a desarrollarse, la única dependencia de este método puede no siempre proporcionar información suficiente para hacer un diagnóstico adecuado de la anomalía. Históricamente, en los estudios de guía de pruebas químicas, una única glándula mamaria se elimina en la necropsia y se prepara como hematoxilina y eosina (H & E) -stained sección. La incorporación de la recolección y análisis de todo el montaje mamario contralateral disminuye la probabilidad de una evaluación falso-negativa. La evaluación de la totalidad del soporte está limitada por la presencia de una o dos glándulas mamarias enteras en una diapositiva y, en algunos casos, las anomalías observadas en todo el soporte no sonT uniformemente representada en la sección H & E. El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo para la conversión de coverslipped mamífero entero monta a H & E manchado secciones de modo que las lesiones que de lo contrario se han perdido o que son difíciles de diagnosticar se puede identificar. Aquí se detalla un método para producir una sección H & E embebida en parafina de alta calidad de una glándula mamaria que se preparó inicialmente como una montura completa. En comparación con un tejido que se preparó intencionalmente para la sección de H & E, todo el soporte requiere una preparación adicional para la eliminación y procesamiento del tejido. Sin embargo, este método se considera barato, ya que requiere reactivos de laboratorio comunes y poco tiempo adicional. Como resultado, este método puede proporcionar información invaluable sobre cómo las exposiciones químicas y ambientales alteran el desarrollo mamario normal, así como mostrar los cambios que se producen debido a las modificaciones genéticas.

Introducción

La madre entera mamaria es un método útil y barato implementado en muchos estudios de ratas y ratones para comprender tanto el desarrollo anormal normal como químicamente inducido. En general, una glándula mamaria recogida en diferentes etapas durante el desarrollo de los roedores ( es decir, la adolescencia, la pubertad, la mitad de la gestación tardía y la fase de involución) mostrará cambios morfológicos en los tejidos y la arquitectura celular influenciada por factores parácrinos, endocrinos y autócrinos ¹ . En la rata envejecida, las porciones epitelial y estromal de la glándula se vuelven cada vez más densas, lo que dificulta la medición de los parámetros morfológicos en un montaje completo. Por lo tanto, es una práctica común para recoger una glándula para la evaluación histológica para identificar los cambios en un nivel microscópico. Ambos procesos son especialmente útiles en estudios que involucran exposición química ( es decir, ambiental o farmacéutica) o para examinar los cambios morfológicos acompañados de alteraciones genéticasAciones.

Las técnicas y capacidades para el uso de la glándula mamaria en la evaluación del riesgo continúan evolucionando. Mientras que la preparación de todo el montaje es rutinaria y estandarizada, las modificaciones al seccionamiento continúan ^{2 , 3} . Muchos grupos de investigación de diversos orígenes ( es decir, la academia, el gobierno y la industria) han adaptado las secciones coronales y longitudinales del tejido mamario como método preferido, mientras que algunos laboratorios siguen utilizando secciones transversales a través de la piel ⁴ . Este último método da como resultado una representación desordenada de la epidermis (piel), en lugar del tejido de interés: el epitelio de la glándula mamaria ² . Las secciones coronales o longitudinales son más útiles para caracterizar el tejido normal ⁵ y mejoran en gran medida la detección de anomalías y lesiones debido al aumento del área superficial y el número de estructuras presentes. En general, esto hace que la moSin un método adecuado para la evaluación histopatológica comparativa de la glándula mamaria ^{1 , 2} . Si se utiliza un ratón o una rata, la recuperación y la preservación de las glándulas inguinales ^4ª y ^5ª es altamente recomendada para la comparación de todo el soporte con una sección contralateral de H & E.

Cuando se usan en combinación, la sección de H & E y el montaje completo proporcionan una descripción precisa de los cambios celulares y morfológicos inducidos por la exposición ambiental. Esto es especialmente cierto en ciertas cepas de roedores en las que el modelo posee una baja susceptibilidad a la formación de tumores o un tumor no es claramente visible. En algunas circunstancias, la obtención del tejido requerido no siempre es posible utilizando ambas técnicas ( es decir, cantidad de tejido insuficiente, recursos o resultados experimentales inesperados). En nuestro caso, se observaron anomalías en el montaje completo mamario, mientras que histopathoLos hallazgos lógicos en la glándula contralateral H & E eran en su mayoría normales. La abrumadora discrepancia entre las glándulas contralaterales nos llevó a desarrollar un procedimiento económico y eficiente para identificar las anomalías en los montajes en su conjunto. Utilizando un proceso de procesamiento y empotramiento modificado, se prepararon secciones de alta calidad H & E-manchadas de soportes enteros parafina-embebidos. Prevemos que este protocolo se convierta en una potente herramienta de detección de efectos de exposición química, mejorando las comparaciones entre laboratorios.

Protocolo

Todos los usos y procedimientos de los animales para este estudio fueron aprobados por el NIEHS Laboratory Animal

Comité de Atención y Uso y realizado en una Asociación para la Evaluación y Acreditación de

Laboratorio de Cuidado de Animales-instalación acreditada.

1. Preparación de montaje completo mamario ^{2 , 3 , 6 , 7}

1. Elimine las glándulas mamarias inguinales de un lado de un ratón hembra CD-1 no embarazada, como se describe en la referencia ³ , y colóquelas sobre una diapositiva cargada electrostáticamente.
2. Cubra la glándula con papel antiadherente o película y coloque otra diapositiva en la parte superior. Añada presión ( es decir, pesos de agua) a la corredera para separar la glándula hacia fuera plana de modo que la glándula se pegue a la diapositiva para la fijación.
3. Sumergir los portaobjetos en un fijador ( por ejemplo, etanol al 100%, cloroformo y ácido acético glacial en una relación 6: 3: 1)Durante la noche a temperatura ambiente.
4. Quitar las glándulas del fijador y lavar en etanol durante 15-30 min. Después del lavado de 30 minutos, cambiar gradualmente a agua por verter 1/3 del etanol y agregar agua. Deje que el lavado se sienta durante 5 minutos cada vez, y repita con la adición de agua 3 veces.
5. Mancha ( por ejemplo, solución de alumbre de carmín) durante 12-24 h.
   NOTA: Los tejidos más gruesos requerirán tiempos de tinción más largos. Véase la referencia ³ para detalles de tinción.
6. Vierta la mancha después del tiempo asignado y enjuague los portaobjetos en agua durante 30 s. Deshidrate los tejidos lavando los portaobjetos en etanol al 70% durante 15 minutos, seguido de un lavado de 15 minutos en etanol al 95% y un lavado final en etanol al 100% durante 20 min.
7. Borrar la grasa de los tejidos colocándolos en xileno durante un mínimo de 24 h, o más si el tejido es grueso, de modo que se eliminen las áreas opacas o blancas.
8. Retirar el tejido del xileno y añadir rápidamente mMontar el medio en la corredera para evitar la deshidratación del tejido; Coloque un cubreobjetos en la parte superior. Deje que el portaobjetos se seque durante al menos 48 h.
9. Evaluar el tejido entero para anomalías, como se describe en ² .
   NOTA: Cuando se detectan lesiones en montajes enteros y la seccion es necesaria para establecer su identidad, se deben seguir los siguientes pasos.

2. Extracción del soporte completo mamario de una diapositiva de vidrio

1. Retire la cubreobjetos y el medio de montaje sumergiendo la diapositiva mamaria de montaje completo en un frasco de tinción de vidrio lleno de xileno durante la noche.
   NOTA: Los tejidos más gruesos y los portaobjetos con solución de montaje excesiva pueden requerir tiempo adicional para la eliminación de la cubreobjetos.
2. Después de la inmersión inicial durante la noche, coloque los portaobjetos en xileno fresco y remoje durante 6 h. Realizar una inmersión final en xileno fresco durante la noche.
   NOTA: El cubreobjetos se caerá fácilmente de la diapositiva después del último remojo.
3. Con agAmado mano, sostener la diapositiva y cuidadosamente quitar el cubreobjetos con un par de fórceps para asegurarse de que se quita en una sola pieza.
   NOTA: En el caso de que la cubreobjetos todavía esté unida a la diapositiva de cristal, continúe remojándola hasta que pueda quitarla con poco esfuerzo.
4. Una vez que el cubreobjetos se quita, sostenga la diapositiva perpendicularmente a una placa de Petri de vidrio que contenga xileno, tome cuidadosamente una cuchilla de afeitar desechable y deslice la cuchilla en un solo movimiento por la corredera.
5. Una vez que el tejido se elimina, sumerja rápidamente la almohadilla mamaria en una placa de Petri de vidrio llena de xileno para asegurar que el tejido no se seque al aire.
   NOTA: Tenga cuidado con este paso. Todo el montaje es delgado (≤ 1 mm), y frágil de procesamiento de xileno. Cualquier impresión o desgarro puede cambiar la morfología del tejido y complicar las evaluaciones posteriores.

3. Procesamiento de tejidos

1. Una vez que el tejido se encuentra en la placa de Petri,A un casete histológico marcado. Agarrar el borde de la almohadilla de grasa con fórceps con punta dentada y con punta redonda para minimizar el daño tisular.
   1. Usando una maquinilla de afeitar, corte los tejidos más grandes (especialmente para las ratas) por la mitad y colóquelos en dos casetes etiquetados separados que acomodarán el tamaño del tejido fino. Coloque el lado derecho del tejido hacia arriba (use el ganglio linfático como referencia). Asegúrese de que el tejido sin el ganglio linfático se mantiene en la misma posición vertical cuando se transfiere al casete.
2. Coloque el cassette en un recipiente de xileno hasta 2 h antes de colocarlo en el procesador de tejidos.
   NOTA: Se recomienda procesar las muestras el mismo día en que se colocan en el cassette. La inmersión prolongada en xileno no ha sido probada.
3. Cargue el número máximo de casetes en el procesador de tejidos a mano.
4. Antes de comenzar, programe todos los reactivos que se utilizarán para este proceso en la lista de reactivos del procesador. Para automatizar el movimientoDe una estación a la siguiente, utilice las opciones del menú y cree un nuevo programa. Cuando se hayan completado todos los pasos, seleccione 'OK' para continuar.
   NOTA: El procesador permitirá la revisión de todos los detalles de la estación antes de comenzar.
   1. Automatizar el procesador para empapar los cassettes en xileno durante 30 minutos a 37 ° C, seguido por un segundo remojo en xileno fresco en las mismas condiciones. Automatizar el procesador para eliminar los cassettes de la solución de xileno y transferir los tejidos a la siguiente estación que contiene una mezcla de parafina de xileno: fundido 1: 1, fijada a 60 ° C, durante 30 min.
      NOTA: El procesador transferirá los cassettes a una nueva cámara que contenga parafina fundida durante 1 h. Después de 1 h, las muestras se transferirán automáticamente a una nueva cámara de parafina fundida fresca y se procesarán durante 2 h adicionales. Ambos pasos se llevan a cabo a 60ºC.
   2. A continuación, el procesador transfiere las cassettes a la estación que contieneFfin durante 1 h. A continuación, las muestras se transfieren automáticamente a la estación final de parafina fundida fresca y se procesan durante 2 h adicionales. Ambos pasos se llevan a cabo a 60ºC.

4. Incorporación del tejido mamario procesado

1. Coloque los casetes en el tanque de retención de parafina de 58 ° C de la estación de empotramiento hasta que esté listo para incrustar el tejido en el molde.
2. Retire la cubierta del casete para determinar el mejor tamaño de molde para el tejido. Asegúrese de que el molde es lo suficientemente grande como para acomodar el tejido, y dejar suficiente espacio para tener un borde libre de tejido de parafina alrededor del perímetro.
3. Añadir 3-4 mm de parafina fundida en el molde y orientar la superficie de montaje mamaria total, que era adyacente a la parte inferior de la corredera de vidrio y la parte inferior de la casete, hacia arriba en el molde.
4. Transferir el molde a una placa de enfriamiento y ajustar rápidamente el tejido según sea necesario para que esté paralelo al molde bOttom
   NOTA: Una vez que la parafina se endurezca, el tejido se asegurará en su lugar.
5. Usando fórceps calientes, coloque la parte inferior etiquetada del casete encima del molde; Presione firmemente con la pinza.
6. Agregue parafina fundida adicional al molde en un movimiento continuo para cubrir el casete entero. Mueva el molde de la placa caliente a una placa fría para completar el endurecimiento del bloque.
7. Retire el bloque del molde cuando la parafina se solidifica completamente para evitar grietas o burbujas de aire.
   NOTA: Guarde los tejidos embebidos en parafina a temperatura ambiente hasta que estén listos para seccionar.

5. Seccionando el tejido mamario embebido en parafina en el micrótomo

1. Antes de seccionar, incubar los bloques de parafina a -20 ° C durante 1 h.
   NOTA: Habrá un medio de montaje residual en el bloque del tejido original de cubreobjetos cubierto. El enfriamiento del bloque mejora la sección de los bloques y la cinta.
2. Prepare el micrófonoRotome girando el baño de agua, conteniendo agua destilada fresca, y ajustar la temperatura a 42-45 ° C. Coloque una cuchilla fresca de bajo perfil sobre el micrótomo y póngala a 4 μm.
   NOTA: La calidad de la sección se reduce con secciones más gruesas de 4 μm debido a la presencia de medio de montaje residual en el tejido.
3. Inserte el bloque en el micrótomo con la cera mirando hacia la hoja y alineada con el plano vertical. Luego, humedezca una sección de gasa en agua fría y colóquela en el bloque durante varios minutos.
4. Sección del bloque girando la rueda grande en un movimiento de las agujas del reloj, en combinación con la rueda avanzada gruesa, hasta que se obtiene una cara completa o una sección representativa del bloque.
   NOTA: El tejido es delgado debido a la eliminación de xileno durante todo el proceso de montaje. Alinee el bloque correctamente con la cuchilla para minimizar el número de cortes en la obtención de una sección representativa.
5. Elige la cintaCon cuidado, flotar cuidadosamente la cinta en el baño de agua caliente (45 ° C) (preparado de antemano), permitir que las arrugas de los tejidos para disipar y cuidadosamente flotar una sección sobre un portaobjetos de vidrio limpio.
6. Coloque los portaobjetos en posición vertical sobre una rejilla de secado para eliminar el exceso de agua. Incubar las diapositivas en una caja de diapositivas ligeramente abierta durante la noche a 37 ° C.

6. Manchado manual y automático de los tejidos mamarios seccionados

1. Antes de la tinción, los portaobjetos se almacenan a temperatura ambiente.
2. Para la tinción automatizada, seleccione H & E de las opciones de manchas en el menú principal. La desparafinización, la tinción y la deshidratación se completan en el tintero automatizado. Utilice un medio de montaje y una cubreobjetos para montar las secciones.
3. Si mancha manualmente las diapositivas, desparafinar las secciones sumergiendo las diapositivas en xileno durante 5 min. Se transfiere a xileno fresco y se repite durante 5 min.
4. Rehidratar las diapositivas sumergiéndolasDos veces en etanol al 100% durante 3 min cada uno, seguido de dos repeticiones en etanol fresco al 95% y dos lavados separados en 1 x tampón de lavado a 5 min cada uno.
5. Enjuague los portaobjetos en agua destilada.
6. Añadir las diapositivas a la hematoxilina durante 1-2 min. Retire los portaobjetos y enjuáguelos con agua corriente durante 5 min.
   NOTA: Filtre la hematoxilina antes de cada uso.
7. Coloque las diapositivas en ácido acético glacial al 1% durante 30 s para promover la diferenciación del color y luego enjuague con agua corriente del grifo durante 1 min.
8. Añadir diapositivas a 1X PBS durante 30 s a 1 min para azul de las secciones de tejido, seguido de un 5 min enjuague en agua del grifo y luego en 95% de alcohol durante 15 - 20 s.
9. Contar con solución de eosina durante 30 s a 1 min. Después de esto, deshidratar dos veces las láminas en etanol fresco al 95%, seguido de dos repeticiones frescas en etanol al 100%. Realizar cada lavado durante 5 min.
10. Borrar las diapositivas en xileno, con dos cambios en xileno durante 5 minutos cada uno.
11. CubreobjetosLa sección de tejido con el medio de montaje y seque durante toda la noche a temperatura ambiente.

Resultados

Este método es eficaz para ayudar con los diagnósticos que de otro modo podrían haberse perdido si la sección contralateral original de H & E de la almohadilla mamaria no mostraba ningún cambio histológico. Sin embargo, el resultado sólo será útil si se toma cuidado durante la preparación inicial de montaje completo, así como durante la preparación del tejido para la evaluación histológica. La incrustación de parafina proporcionará protección y ayudará a preservar el tejido para futu...

Discusión

El montaje completo de la glándula mamaria es una poderosa herramienta que puede usarse para ilustrar el desarrollo mamario normal y las alteraciones morfológicas que pueden surgir y persistir después de la exposición a químicos, incluyendo los disruptores endocrinos. Cuando se evalúan conjuntamente un conjunto completo y una sección de H & E del mismo animal, pueden proporcionar una instantánea visual precisa de las primeras alteraciones, que pueden progresar hacia un estado más enfermo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
xileno	Sigma-Aldrich	214736
Permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-100	para el deslizamiento de monturas enteras y H& Secciones E
Procesador automatizado	Leica Biosystems Modelo	# ST5020
HM 355S Microtomo automático	Thermo Fisher Scientific	905200
Parafina	Leica Biosystems	EM-400
Superfrost plus portaobjetos de microscopio	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	cargado electrostáticamente
Fisher Finest 24x60x1	Thermo Fisher Scientific	12-548-5P	cubreobjetos
Varistain Gemini ES Tinción automática de portaobjetos	Thermo Fisher Scientific	A78000014
Sta-On	Leica Biosystems	3803107	adhesivo líquido; utilizado en baño de agua en el corte
Hematoxilina Harris modificada 72711	Richard-Allan Scientific (Parte de Thermo Scientific)	72711
Eosina	Leica Biosystems	3801600
Carbonato de litio	SkyTech Laboratories	LCQ500
Ácido acético glacial	Thermo Fisher Scientific	A38-500	necesario en el fijador de Carnoy
Cloroformo	Macron Fine Chemicals	4440-04	necesario en el fijador de Carnoy
100% Etanol	The Warner Graham Company	6505001050000	necesarios en el fijador y los portaobjetos de lavado de Carnoy
95% Etanol	The Warner Graham Company	6505011137320190
Carmine Alum	Sigma-Aldrich	C1022-25G
Sulfato de aluminio y potasio dodecahidratado, Sigma Ultra	Sigma-Aldrich	A7210-500G
Tampón de lavado automatizado, 20X	Biocare Medical	TWB945

Medios de montaje de