Desarrollo de cuerpos embrionarios libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre tridimensionales usando ensayos fisiológicamente relevantes

Andre W. Phillips; Jonathan E. Nestor; Michael W. Nestor

doi:10.3791/55799

Artículo de método

Desarrollo de cuerpos embrionarios libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre tridimensionales usando ensayos fisiológicamente relevantes

DOI:

10.3791/55799

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20 de julio de 2017

Andre W. Phillips¹ , Jonathan E. Nestor¹ , Michael W. Nestor¹

¹The Hussman Institute for Autism

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema tridimensional (3-D) de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (HiPSCs) llamado cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional puede ser utilizado como un cultivo de corte organotípico para modelar el desarrollo cortical humano y para la interrogación fisiológica del desarrollo de circuitos neuronales.

Resumen

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Aunque una serie de modelos de enfermedades in vitro se han desarrollado utilizando hiPSCs, una limitación es que estos sistemas bidimensionales (2-D) pueden no representar la subyacente cytoarchitectural y complejidad funcional de los individuos afectados portadores de las variantes de enfermedad sospechosos. Modelos convencionales 2-D siguen siendo incompletas representaciones de in vivo- como las estructuras y no captar adecuadamente la complejidad del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad emergente de más modelos basados en HiPSC 3-D que puedan recapitular mejor las interacciones y funciones celulares vistas en un sistema in vivo .

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema 3-D de hiPSC indiferenciados basados en el cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional refleja aspectos de un neocórtex ventralizado en desarrollo y permite estudiar las funciones integrales de las células neurales vivas y el tejido intacto tales como la migración, la conectividad, la comunicación y la alfombraCión. Específicamente, demostramos que los SFEBs que usan nuestro protocolo pueden ser interrogados utilizando ensayos basados en células fisiológicamente relevantes y de alto contenido como imágenes de calcio y registros de múltiples electrodos (MEA) sin criosección. En el caso de las grabaciones de MEA, demostramos que los SFEBs aumentan tanto la actividad de pico como la actividad de ruptura a nivel de la red durante el cultivo a largo plazo. Este protocolo SFEB proporciona un sistema robusto y escalable para el estudio del desarrollo de la formación de redes en un modelo tridimensional que captura aspectos del desarrollo cortical temprano.

Introducción

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Hemos informado anteriormente de un sistema modelo 3D, generado a partir de pacientes derivados de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSCs) que recapitula algunos aspectos de la primera red cortical desarrollo ¹ . Este modelo tridimensional, un cuerpo embrionario libre de suero (SFEB), mejora los modelos hiPSC anteriores de agregación simple ² ^, ³ . Un creciente cuerpo de trabajo está revelando que las estructuras tridimensionales como nuestro SFEBs, los aspectos aproximados de desarrollo neural comúnmente observados in vivo y en un momento anterior de lo....

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Protocolo

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1. Generación de células progenitoras neurales

Mantener los hiPSCs derivados de fibroblastos y PBMCs en placas de 6 pocillos en una capa celular de alimentador embrionario de ratón (MEF) irradiada con γ en medio iPSC humano suplementado con moléculas pequeñas (véase la Tabla de Materiales).
NOTA: El mantenimiento diario es una versión modificada de los procedimientos anteriores ¹ ^, ¹⁶ .
1. Placa 6 x 10 ⁵ MEFs en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos en un medio recomendado de 300 μl / pocillo (siguiendo el protocolo del fabricante).

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Resultados

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Los SFEB cultivados usando nuestra técnica dieron tejido con características morfológicas que se asemejan a una zona subventricular cortical precoz repleta de extensas neuronas Tuj1 positivas, así como progenitores neurales ( Figura 3A ). Se observaron numerosas rosetas corticales en desarrollo en las capas externas y capas internas del SFEB ( Figura 3B ). El borde exterior del SFEB se asemeja a una placa cortical en desarrollo .......

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Discusión

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El protocolo descrito aquí proporciona las condiciones para diferenciar una fuente hiPSC en una estructura tridimensional que recapitula una etapa temprana de desarrollo de la corteza frontal. Este procedimiento produce estructuras que pueden ser interrogadas para electrofisiología, al tiempo que son susceptibles de microscopía. La morfología final del SFEB se asemeja a la de los cultivos organotípicos del corte cerebral y permite una imagen confocal detallada de alta calidad. Este protocolo puede generar con éxito SFEB.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Damos las gracias a Elizabeth Benevides por corregir el artículo. Damos las gracias a los Dres. John Hussman y Gene Blatt por sus útiles discusiones y comentarios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SFEB Diferenciación neuronal Medios de cultivo celular. Reactivos. Componentes
STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)	STEMCELL Technologies	0-5835	250 mL
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>DM1 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax líquido, 1:1	Invitrogen	10565018	385 mL
Suero Knockout Reemplazo	Invitrogen	10828028	20% 100 mL
Pluma/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 10 mM (100x),	Invitrogen	11140050	5 mL
2-Mercaptoetanol (1,000x),	Invitrogen	21985023	900 μ L
Nombre	Company	Número de catálogo	Comments
>DM2 Media Components
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax líquido, 1:1	Invitrogen	10565018	500 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
/Strep	Invitrogen	15140122	5 mL
N-2 Suplemento (100x),	Invitrogen	17502048	10 mL
Nombre	Compañía	Número de catálogo	Comments
DM3 Media Components
NEUROBASAL Medium (1x), líquido	Invitrogen	21103049	500 mL
B-27 Suplemento Menos Vitamina A (50x), líquido	Invitrogen	12587010	10 mL
Glutamax 200 mM	Invitrogen	35050061	5 mL
/Estreptococo	Invitrogen	15140122	5 mL
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>Moléculas pequeñas
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	2 μ M
SB431542	Stemgent	04-0010-10	1:1.000 (10 μ M)
Vástago	Dorsomorfina	04-0024	1 μ M
LDN-193189	Potencia	04-0074-10	250 nM
Y27632 (ROCKi)	Potencia	04-0012-10	10 μ M
Nombre	Company	>Número de catálogo	Comments
>Recombinant Protiens
DKK-1	Peprotech	120-30	200 ng/mL
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>Componentes/Materiales
Cell Culture insertos 0.4 μ M,	Millicell	PICM0RG50
Fibroblastos embrionarios	GlobalStem	GSC-6301G
V de 96 pocillos con tapas	Evergreen	222-8031-01V
StemPro Accutase Reactivo de disociación celular	ThermoFisher	A1110501
TritonX-100	ThermoFisher	85111
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 mL
Suero de burro normal	Jackson Labs	017-000-121
Medio L-15 de Leibovitz	ThermoFisher	11415114	500 mL
DRAQ5 (marcador nuclear)	ThermoFisher	65-0880-96
Placas MEA	Axion Biosystems	M768-GL1-30Pt200
6 pocillos de fondo plano	Falcon	353046
Nombre	Company	Número de catálogo	Comments
>Anticuerpo
Nestin	Millipore	MAB5326
Brn-2	Protein tech	14596-1-AP
VGLUT1	Synaptic Systems	135 303
Pax6	abcam	ab5790
Calretinina	abcam	ab702
Calbindin	abcam	ab11426
CoupTFII	R& D Systems	PPH714700
Nkx 2.1	abcam	ab12650
Tuj1	abcam	ab41489
Reelin	Millipore	MAB5364
Tbr1	Millipore	MAB2261
NFH	Dako	M0762

líquido líquido Pen líquido Pen de ratón de 30 mm de diámetroFondo en

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
Eiraku, M., et al.

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Cuerpos embrioides libres de suero diferenciaci n de iPSC humanas cultivo de c lulas madre en 3D modelo de desarrollo cortical registro mediante matriz de multielectrodos ensayo de imagen de calcio formaci n de redes neuronales an lisis de marcadores de c lulas madre cultivo de baja adhesi n

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