Preparación a mediano plazo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embriones para experimentos proteómicos

Resumen

El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo y barato para recolectar embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g) y preparar extractos de proteínas que pueden ser utilizados en aplicaciones proteómicas aguas abajo, tales como la purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS ).

Resumen

El análisis de las interacciones proteína-proteína (IPP) se ha convertido en un enfoque indispensable para estudiar los procesos y mecanismos biológicos, como la señalización celular, el desarrollo del organismo y las enfermedades. A menudo es deseable obtener información PPI utilizando material in vivo , para obtener la visión más natural e imparcial de las redes de interacción. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es una excelente plataforma para estudiar PPIs in vivo , y se presta a enfoques sencillos para aislar material para experimentos bioquímicos. En particular, los embriones de mosca de la fruta representan un tipo conveniente de tejido para estudiar los IBP, debido a la facilidad de recolección de animales en esta etapa de desarrollo y el hecho de que la mayoría de las proteínas se expresan en embriogénesis, proporcionando un entorno relevante para revelar la mayoría de los IBP. Aquí presentamos un protocolo para la recogida de embriones Drosophila a escala media (0,5-1 g), que es una cantidad ideal para una amplia gama deAplicaciones proteómicas, incluyendo análisis de PPIs por purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS). Describimos nuestros diseños para jaulas de 1 L y 5 L para colecciones de embriones que pueden ser instaladas fácil y económicamente en cualquier laboratorio. También proporcionamos un protocolo general para la recolección de embriones y la extracción de proteínas para generar lisados ​​que pueden ser utilizados directamente en aplicaciones descendentes como AP-MS. Nuestro objetivo es proporcionar un medio accesible para que todos los investigadores lleven a cabo los análisis de los IPP in vivo .

Introducción

Las pantallas genéticas y, más recientemente, los enfoques genómicos han revolucionado el estudio de las funciones biológicas. Sin embargo, la información celular importante se codifica en proteínas y su conjunto de socios que interactúan. Mientras que las pantallas modificadoras genéticas tradicionales pueden identificar componentes de vías limitantes y recuperar interacciones indirectas, la fortaleza de los enfoques proteómicos reside en su capacidad para identificar redes de interacción inmediata completas de proteínas de interés. La proteómica es, pues, un valioso método ortogonal para estudiar los sistemas biológicos y complementa la genómica, la transcriptómica....

Protocolo

1. Preparación de jaulas para moscas de 5 litros (para colocar placas de 15 cm)

1. Obtenga los materiales necesarios: recipiente de 5 cuartos de galón (4.7-L) con tapa ( Figura 1A ), malla de nylon y una cuchilla de afeitar.
2. Marque un círculo de 12 cm de diámetro y corte un agujero en la parte inferior del recipiente usando la cuchilla de afeitar ( Figura 1B ). Corte un agujero de 15 cm de diámetro en la tapa ( Figura 1C ).
3. Corte la malla de nylon en cuadrados de 25 x 25 cm.
4. Coloque la malla sobre el borde superior del recipiente y presione ....

Resultados

Para ilustrar el uso de este protocolo en un experimento de purificación de complejos de proteínas, se generó una línea de mosca viable homocigótica, brazo-EGFP-ERK , que expresa EGFP marcado con Drosophila extracelular señal regulada quinasa (ERK, codificado por el rollo de genes) bajo el control De un promotor de armadillo ( brazo ) expresado de forma ubicua ^{18 , 19} . El promotor del.......

Discusión

El protocolo presentado aquí es un procedimiento simple y general para establecer jaulas de población de Drosophila a escala media y hacer extractos de proteína de células enteras de embriones. Los extractos resultantes pueden usarse en una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como la purificación de complejos de proteínas sobre resinas de afinidad. Es crítico realizar los pasos de extracción en hielo y utilizar una fuerte inhibición de la proteasa, para minimizar la degradación de la proteína. Tal como .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Paquete de 3)	Home Depot	209330	Para hacer jaulas de 5 L.
Tapa Multi Mix Natural Leaktite de 5 cuartos (paquete de 3)	Home Depot	209320	Diámetro 8.37 pulg. Tapas para jaulas de 5 L.
Placas de Petri Fisherbrand con tapa transparente, 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	Material: Poliestireno. Para ser utilizado con jaulas de 1 L.
Placas de Petri Fisherbrand con tapa transparente, 150 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Material: Poliestireno. Para ser utilizado con jaulas de 5 L.
Placas de Petri Fisherbrand con tapa transparente, 60 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Material: Poliestireno. Se utiliza durante la descorionación de embriones.
Malla de nylon Sefar NITEX	Sefar	03-180/44	180 micras, 44% de área abierta, utilizada para jaulas de moscas.
Milwaukee 3 pulg. Sierra perforadora con Arbor	Home Depot	49-56-9670 Herramienta de	corte de 3 pulgadas para hacer jaulas de 1 L.
Frascos PMP de boca ancha y lados rectos Nalgene con cierre de rosca de polipropileno blanco	Fisher Scientific	11-823-33	Para la fabricación de jaulas de 1 L. Thermo Scientific cat # 21171000. Se pueden utilizar recipientes alternativos de 1 litro.
Levadura seca activa Red Star, bolsa de 2 libras	Red Star		se puede comprar a Amazon.com u otros proveedores.
Concentrado de jugo de manzana 100% congelado			Se puede comprar en una tienda de comestibles. Tiene que decir "100% jugo de manzana" en la lata.
El 4-hidroxibenzoato de metilo	Acros Organics	también AC126965000	conoce como metilparabeno o Tegosept. Se utiliza como conservante en las placas AJ.
IGEPAL CA-630 para biología molecular, 100 ml	Sigma	I8896	utilizado para la preparación de tampón de lisis.
Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido de Nalgene con membrana CN	Fisher Scientific	09-740-2A	0.2 μ m tamaño de poro. Se utiliza para filtrar tampón de lisis 5x. Thermo Scientific gato # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Inhibidor de la Proteasa Cocktail	Sigma 11697498001		Vial de 20 comprimidos. Se utiliza para la inhibición de proteasas en tampones de lisis.
Filtros de jeringa Corning SFCA	Fisher Scientific	09-754-21	diámetro 26 mm, tamaño de poro 0,45 m. Se utiliza para filtrar muestras de extracto final.
BD  Luer-Lok Jeringas Desechables sin Agujas	Fisher Scientific	14-823-2A	para el filtrado de muestras de extracto final. BD gato # 309604.
La lejía	Clorox		utilizada para la descorionación de embriones al 50% (vol/vol) en agua, se puede comprar en cualquier supermercado. Es importante utilizar la marca Clorox, ya que otras marcas pueden dar lugar a una decorionación incompleta o pueden ser tóxicas para los embriones.
Corning Costar Netwell Plates	Fisher Scientific	07-200-213	contenedores de malla para colecciones de embriones. 74 μ M tamaño de malla, 6 pocillos.
Trituradores de tejidos Wheaton Sounce, capacidad 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	homogeneizador para embriones, con morteros sueltos y apretados. Gato Wheaton # 357544.

Membrana SFCA ,