Preparación a mediano plazo de Drosophila Extractos de embriones para experimentos proteómicos

Resumen

El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo y barato para recolectar embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g) y preparar extractos de proteínas que pueden ser utilizados en aplicaciones proteómicas aguas abajo, tales como la purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS ).

Resumen

El análisis de las interacciones proteína-proteína (IPP) se ha convertido en un enfoque indispensable para estudiar los procesos y mecanismos biológicos, como la señalización celular, el desarrollo del organismo y las enfermedades. A menudo es deseable obtener información PPI utilizando material in vivo , para obtener la visión más natural e imparcial de las redes de interacción. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es una excelente plataforma para estudiar PPIs in vivo , y se presta a enfoques sencillos para aislar material para experimentos bioquímicos. En particular, los embriones de mosca de la fruta representan un tipo conveniente de tejido para estudiar los IBP, debido a la facilidad de recolección de animales en esta etapa de desarrollo y el hecho de que la mayoría de las proteínas se expresan en embriogénesis, proporcionando un entorno relevante para revelar la mayoría de los IBP. Aquí presentamos un protocolo para la recogida de embriones Drosophila a escala media (0,5-1 g), que es una cantidad ideal para una amplia gama deAplicaciones proteómicas, incluyendo análisis de PPIs por purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS). Describimos nuestros diseños para jaulas de 1 L y 5 L para colecciones de embriones que pueden ser instaladas fácil y económicamente en cualquier laboratorio. También proporcionamos un protocolo general para la recolección de embriones y la extracción de proteínas para generar lisados ​​que pueden ser utilizados directamente en aplicaciones descendentes como AP-MS. Nuestro objetivo es proporcionar un medio accesible para que todos los investigadores lleven a cabo los análisis de los IPP in vivo .

Introducción

Las pantallas genéticas y, más recientemente, los enfoques genómicos han revolucionado el estudio de las funciones biológicas. Sin embargo, la información celular importante se codifica en proteínas y su conjunto de socios que interactúan. Mientras que las pantallas modificadoras genéticas tradicionales pueden identificar componentes de vías limitantes y recuperar interacciones indirectas, la fortaleza de los enfoques proteómicos reside en su capacidad para identificar redes de interacción inmediata completas de proteínas de interés. La proteómica es, pues, un valioso método ortogonal para estudiar los sistemas biológicos y complementa la genómica, la transcriptómica y las pantallas genéticas tradicionales. La purificación de afinidad-espectrometría de masas (AP-MS) ha demostrado ser un poderoso enfoque para estudiar las interacciones proteína-proteína (IPP) en su entorno nativo en las células y tejidos [ ^{1 , 2]} . Este método permite la identificación de interacciones directas o indirectas en un desarrollo específicoAl estadios o contextos de tejido, y se ha utilizado con éxito para identificar múltiples nuevos PPIs en una variedad de vías de desarrollo (revisado en la referencia ¹ ). A pesar del éxito indiscutible de los estudios de PPI, la mayoría de ellos se han llevado a cabo en células cultivadas, en las que se sobreexpresaron las proteínas de "cebo" de interés. Hay dos problemas con el estudio de los IBP en el cultivo de células: en primer lugar, una línea celular específica puede no proporcionar un complemento completo de interacciones debido a la falta de expresión de ciertas proteínas. En segundo lugar, la sobreexpresión alta normalmente empleada en tales análisis podría conducir a artefactos tales como el replanteo de proteínas o la identificación de interacciones positivas falsas.

Ambas limitaciones pueden ser superadas analizando PPI in vivo . Un paso limitante en tales experimentos es la disponibilidad del material de partida para purificar complejos de proteínas. Drosophila melanogaster se ha utilizado durante mucho tiempo como un modelo para el análisis funcionalSis, y recientemente también se ha demostrado ser un excelente sistema para el estudio de PPIs in vivo . La embriogénesis de Drosophila representa un tipo de tejido particularmente atractivo para estudiar los IBP, ya que los embriones pueden ser fácilmente recolectados en grandes cantidades, y también porque la mayoría de los genes (> 88%) se expresan durante la embriogénesis, proporcionando así un rico entorno in vivo para detectar IPP ³ .

Tradicionalmente, los estudios bioquímicos en moscas utilizaron colecciones de embriones a gran escala (100-150 g), como las necesarias para purificar los lisados ​​transcripcionales funcionales [ ^{4 , 5]} . Estudios previos de AP-MS en Drosophila también requerían grandes cantidades de embriones (5-10 g), porque dependían de un enfoque de purificación en dos etapas como la purificación de afinidad en tándem (TAP), con la consiguiente pérdida de material en cada paso ⁶ . Gran cantidadSt de material de partida requirió la creación de colecciones de embriones en grandes jaulas de población, que pueden ser costosas (cuando se compran comercialmente) y consumir mucho tiempo para mantener y limpiar ^{7 , 8 , 9} .

Los avances recientes en el desarrollo de enfoques de purificación por afinidad de un solo paso, así como la sensibilidad creciente de espectrómetros de masas, han reducido la cantidad necesaria de material de partida en un orden de magnitud. Usando etiquetas tales como el péptido de unión a la estreptavidina (SBP) o la proteína fluorescente verde (GFP) y partiendo de menos de 1 g de embriones, es posible aislar las cantidades de la proteína cebo y los componentes interactivos que serían suficientes para la identificación por Espectrometría de masas ^{10 , 11} .

El objetivo del protocolo presentado aquí es ayudar a los investigadores aMe una barrera percibida para el análisis bioquímico de PPIs in vivo . Con este fin, proporcionamos un procedimiento sencillo y económico para recoger embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g), seguido de una etapa de preparación de extractos de proteínas de células enteras que son adecuados para el análisis posterior por AP-MS u otros enfoques . Nuestro método se basa en el uso de jaulas personalizadas de 1-L o 5-L que pueden ser producidas fácilmente por cualquier laboratorio. Además, las condiciones de extracción presentadas aquí han sido validadas en varios estudios, tanto en células cultivadas como in vivo ^{10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} .

Protocolo

1. Preparación de jaulas para moscas de 5 litros (para colocar placas de 15 cm)

1. Obtenga los materiales necesarios: recipiente de 5 cuartos de galón (4.7-L) con tapa ( Figura 1A ), malla de nylon y una cuchilla de afeitar.
2. Marque un círculo de 12 cm de diámetro y corte un agujero en la parte inferior del recipiente usando la cuchilla de afeitar ( Figura 1B ). Corte un agujero de 15 cm de diámetro en la tapa ( Figura 1C ).
3. Corte la malla de nylon en cuadrados de 25 x 25 cm.
4. Coloque la malla sobre el borde superior del recipiente y presione hacia abajo con la tapa ( Figura 1C ). Asegúrese de que la malla esté apretada y la tapa no esté inclinada. La jaula está lista para ser poblada con moscas (vea el paso 5.3).

2. Preparación de jaulas de mosca de 1 L (para colocar placas de 10 cm)

1. Obtenga los materiales necesarios: un taladro eléctrico, una herramienta de corte de 3 pulgadas (76 mm) ( Figura 1E y FFigura 1F), una jarra de plástico de 1 L de recto con tapa, malla de nylon, una hoja de afeitar, papel de lija, gafas y guantes de trabajo.
2. Corte los agujeros de 3 pulgadas (76 mm) en el fondo y la tapa del frasco de plástico ( Figura 1G ), con la tapa firmemente atornillada en el recipiente mientras se perfora. Coloque la herramienta de corte en el centro del círculo al comenzar a hacer un agujero.
   Precaución: Use protección para los ojos y guantes de trabajo durante este paso.
3. Suavizar los bordes de los agujeros con una hoja de afeitar y papel de lija.
4. Corte la malla de nylon en cuadrados de 18 x 18 cm.
5. Coloque la malla sobre el borde superior de la jarra y apriete atornillando la tapa ( Figura 1G ). Asegúrese de que la malla esté apretada y la tapa no esté inclinada. La jaula está lista para ser poblada con moscas (vea el paso 5.3).

3. Preparación de placas de jugo de manzana (AJ)

1. Añadir 19 g de agar y 1 L de 18,2 MΩ · cm de agua en un matraz de 2 l.Añadir una barra de agitación, y mezclar brevemente.
2. Autoclave durante 30 min. Mientras tanto, descongelar el concentrado de jugo de manzana al 100% a partir de caldo congelado y preparar 10 ml de solución de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% (peso / volumen) en etanol.
3. Después de la esterilización en autoclave, comenzar a mezclar el agar sobre una placa de agitación, y agregar 80 ml de concentrado de jugo de manzana al 100% y 10 ml de solución de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% (peso / volumen) al matraz. Dejar enfriar a temperatura ambiente con mezcla constante.
4. Vierta platos de Petri de 15 cm (para jaulas de 5 L) o de Petri de 10 cm (para jaulas de 1 L) de manera que el nivel de agar en cada plato sea de aproximadamente 5 mm de espesor. Dejar solidificar a temperatura ambiente, y envolver en bolsas de plástico. Las placas AJ se pueden almacenar a 4 ° C durante dos semanas.
   Nota: Las placas de Petri se pueden lavar y reutilizar.
5. Preparar la pasta de levadura húmeda: verter una levadura seca activa en un recipiente de 100 ml con una tapa que permita una fácil mezcla y añadir agua en pequeñas cantidades mientras se agita, para obtener una mezcla gruesa pero bien mezcladapegar. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.

4. Preparación de reactivos de lisis

1. Preparar 5x tampón de lisis: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glicerol, 1% octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4.
   1. Para hacer 200 mL: disolver completamente 1 g de polvo de NaF y 184 mg de Na3VO4 en polvo en 71 mL de agua con agitación constante. Añadir 50 ml de Tris 1 M a pH 7,5, 2 ml de IGEPAL al 100%, 1,5 ml de MgCl _$ ₂ _$ 1 M y 25 ml de NaCl 5 M. A continuación, añadir 50 ml de glicerol (añadir en último lugar) y seguir agitando durante 1 h.
   2. Filtrar-esterilizar utilizando unidades de filtro de 250 ml. Este paso puede ser lento, pero la filtración de la solución es importante para eliminar las partículas insolubles. Alícuota de 10 ml en tubos de 50 ml y almacenar a -80 ° C.
2. Preparar 1 M de ditiotreitol (DTT) en agua. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 1 ml.
3. Obtener proteAse, con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Almacenar a 4 ° C.
4. Obtenga jeringas y filtros de jeringa de 10 ml: diámetro de 26 mm, membrana de acetato de celulosa libre de tensioactivos (SFCA), tamaño de poro de 0,45 μm.

5. Recolección de embriones mosca

1. Ampliar las líneas de moscas transgénicas que llevan la proteína marcada de interés en botellas (aproximadamente 100 moscas por botella), y transferir las botellas cada 2 días hasta que se acumulen 25-30 botellas por cada línea de mosca. Ampliar el stock de control ( por ejemplo, la línea yw ) de una manera similar.
2. Se calientan las placas de AJ a temperatura ambiente (aproximadamente 1-2 h, se pueden hacer durante la noche). Utilizando un dedo enguantado, esparza una pasta de levadura húmeda en el centro de las placas de AJ, para hacer un aprox. Círculo de 6 cm para una placa de 15 cm y un círculo de 4 cm para una placa de 10 cm.
3. Anestesiar las moscas con un flujo de dióxido de carbono usando una configuración estándar de Drosophila y transferirlas aLas jaulas (aproximadamente 15 botellas bien cultivadas de moscas por jaula de 5 litros, 5 botellas por jaula de 1 litro).
   1. Cubra el fondo de la jaula con las placas AJ preparadas de la etapa 5.2 y tape la placa AJ en la jaula usando dos tiras de cinta ( Figuras 1D e 1H ). Es útil doblar sobre las puntas de la cinta que van sobre la placa para pelar fácil al cambiar las placas.
   2. Después de que las moscas se recuperen de la anestesia, mantener las jaulas con las placas en la parte inferior y la malla en la parte superior.
      Nota: Es importante esperar hasta que las moscas se recuperen completamente, ya que de lo contrario se pegarán a la placa de AJ y pasta de levadura.
   3. Al final del experimento, para preparar la jaula para la limpieza, coloque la jaula en el congelador durante varias horas. El remojo de la malla en agua durante unas horas facilitará la limpieza.
4. Incubar las jaulas con moscas a temperatura ambiente durante 2-3 días y cambiar las placas AJ dos veces al día. Para cambiar las placas, gire la jaula boca abajo,Pelar la cinta de la placa, pero sostener el plato a la jaula, toque la jaula entera suavemente en el banco, y rápidamente cambiar el plato viejo por uno nuevo, tratando de no permitir que las moscas para escapar.
   Nota: Las moscas necesitan ajustarse a la jaula y pondrán mejor a partir del día 3. Seguirán poniéndose en el nivel máximo durante unos 4-5 días. Dos jaulas de 5 litros en capacidad máxima de colocación pueden producir hasta 1 g de embriones en una colección durante la noche. Utilizar jaulas de 1 L para experimentos de menor escala.
5. Permita que las moscas depositen embriones en placas frescas de AJ durante la noche (aproximadamente 16 horas), o para cualquier otro período de tiempo deseado.
6. A la mañana siguiente, marcar y pesar los contenedores de malla para la recolección de embriones, uno por cada línea de mosca utilizada.
7. Preparar un tampón de lisis 1x, utilizando los reactivos de la sección 4 (Nota: antes de la extracción se debe preparar un tampón de lisis listo para su uso): añadir 40 ml de agua a 10 ml de tampón de lisis concentrado 5x (almacenado a -80 ° C) En un tubo de 50 ml.
   1. Añadir 50 μl de 1 MDTT hasta una concentración final de 1 mM, mezclar bien y separar en dos tubos de 50 mL, 25 mL en cada uno. A uno de los tubos, añadir un comprimido de inhibidor de la proteasa y girar a 4 ° C durante 30 min. Mientras la tableta se está disolviendo, recoja y decocine los embriones (pasos 5.8 a 6.6). Compruebe que la tableta se haya disuelto completamente y mantenga el buffer en hielo.
      Nota: El segundo tubo de tampón 1x con DTT puede almacenarse a -80 ° C y sólo requerirá la adición de la tableta antes del siguiente experimento. 25 ml de tampón de lisis es suficiente para hasta 2 muestras, teniendo en cuenta los lavados posteriores durante las etapas de purificación de proteínas.
8. Marque las placas de AJ en las jaulas con los genotipos de las líneas de mosca utilizadas, y cambie las placas por otras nuevas.
   Nota: El exceso de pasta de levadura se puede raspar de la placa en este paso. Los embriones se pueden envejecer en las placas a 25 ° C oa temperatura ambiente para obtener la ventana deseada de tiempo de desarrollo.
9. Añadir suficiente agua tO cubrir cada placa de AJ. Suavemente desalojar los embriones de la placa con un cepillo de pintura suave (cabeza plana de aproximadamente 10 mm de ancho funciona bien para placas grandes). Verter los embriones en el recipiente de malla previamente pesado y marcado, y drenar el exceso de agua.
   1. Si es necesario, realice un segundo enjuague y cepillado de la placa para eliminar todos los embriones. Combine los embriones de placas adicionales para la misma línea de mosca en el mismo recipiente de malla.
10. Baje brevemente la malla sobre toallas de papel para eliminar el exceso de agua.

6. Dechorionation del embrión

1. Llenar a medias una placa de Petri de 6 cm con un 50% de lejía (solución vol / vol en agua).
   Nota: Véase un comentario importante sobre la marca de blanqueador en la Tabla de Materiales y Reactivos.
   Precaución: Use guantes y evite que se leque la ropa.
2. Prepare 2 platos Petri más grandes con agua.
3. Sumerja el contenedor de malla con embriones en lejía al 50% durante 90 s. Toque suavemente la malla durante el incuUn par de veces para suspender los embriones en la solución de lejía.
4. Al final de la incubación de los 90 s, lavar el recipiente de malla en cada uno de los 2 platos con agua durante aproximadamente 10 s.
5. Enjuague bien el recipiente de malla con 18,2 MΩ · cm de agua usando la botella de chorros. También, lave los lados y el exterior del contenedor de malla.
   Nota: No se debe detectar ningún olor a blanqueo después de un lavado cuidadoso.
6. Seque el recipiente de malla sobre toallas de papel. Pesar el recipiente de malla con los embriones y restar el peso del recipiente vacío obtenido en el paso 5.6. Registre el peso resultante de los embriones. Una buena cantidad de embriones para apuntar es 0.5 - 1 g.

7. Preparación del extracto de embrión

1. Añadir 1 ml de tampón de lisis con inhibidores de proteasa (del paso 5.7) a un homogeneizador de vidrio dounce y mantenerlo sobre hielo. Transferir los embriones del contenedor de malla al homogeneizador.
   Nota: Los embriones pueden ser recogidos con un extremo plano.Fa espátula de metal o un cepillo y se transfiere directamente en el buffer. Realice todos los pasos de esta sección en hielo.
2. Lavar los embriones restantes en la malla con un tampón de lisis adicional de 1 ml y agregar al material en el homogeneizador. Deje que los embriones se establezcan hasta el fondo del homogeneizador, y aspiren cuidadosamente el sobrenadante.
3. Añadir tampón de lisis con inhibidores de proteasa (del paso 5.7) al homogeneizador, con el objetivo de 5-6 ml de tampón de lisis por gramo de embriones.
4. Homogeneizar los embriones por 4-6 golpes con un pilón de ajuste holgado.
   Nota: Durante los primeros golpes, habrá más resistencia. Trate de mover el mazo en un movimiento continuo para evitar salpicar la solución.
5. Homogeneizar los embriones de 8-10 golpes con un mazo de ajuste apretado.
6. Incubar el homogeneizado en hielo durante 20 min.
7. Transferir el homogeneizado en tubos de microcentrífuga y centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a velocidad máxima (aproximadamente 13.000 xg).
8. EvitaLos gránulos y la capa lipídica superior, transferir los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga frescos y centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a velocidad máxima (aproximadamente 13.000 xg).
9. Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes con una punta de 1 ml y cargarlos en jeringas refrigeradas de 10 ml con filtros de 0,45 μm unidos (combinar alícuotas de la misma muestra en una jeringa). Empuje toda la solución en un tubo de 15 ml marcado sobre hielo. El extracto puede utilizarse inmediatamente para experimentos subsiguientes de purificación de proteínas o congelarse instantáneamente en nitrógeno líquido y mantenerse a -80 ° C para uso futuro.
   Nota: Es mejor congelar los extractos en lugar de los embriones, porque durante la descongelación posterior de los embriones las proteasas pueden activarse y provocar la degradación de las proteínas.

Resultados

Para ilustrar el uso de este protocolo en un experimento de purificación de complejos de proteínas, se generó una línea de mosca viable homocigótica, brazo-EGFP-ERK , que expresa EGFP marcado con Drosophila extracelular señal regulada quinasa (ERK, codificado por el rollo de genes) bajo el control De un promotor de armadillo ( brazo ) expresado de forma ubicua ^{18 , 19} . El promotor del...

Discusión

El protocolo presentado aquí es un procedimiento simple y general para establecer jaulas de población de Drosophila a escala media y hacer extractos de proteína de células enteras de embriones. Los extractos resultantes pueden usarse en una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como la purificación de complejos de proteínas sobre resinas de afinidad. Es crítico realizar los pasos de extracción en hielo y utilizar una fuerte inhibición de la proteasa, para minimizar la degradación de la proteína. Tal como ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Paquete de 3)	Home Depot	209330	Para hacer jaulas de 5 L.
Tapa Multi Mix Natural Leaktite de 5 cuartos (paquete de 3)	Home Depot	209320	Diámetro 8.37 pulg. Tapas para jaulas de 5 L.
Placas de Petri Fisherbrand con tapa transparente, 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	Material: Poliestireno. Para ser utilizado con jaulas de 1 L.
Placas de Petri Fisherbrand con tapa transparente, 150 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Material: Poliestireno. Para ser utilizado con jaulas de 5 L.
Placas de Petri Fisherbrand con tapa transparente, 60 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Material: Poliestireno. Se utiliza durante la descorionación de embriones.
Malla de nylon Sefar NITEX	Sefar	03-180/44	180 micras, 44% de área abierta, utilizada para jaulas de moscas.
Milwaukee 3 pulg. Sierra perforadora con Arbor	Home Depot	49-56-9670 Herramienta de	corte de 3 pulgadas para hacer jaulas de 1 L.
Frascos PMP de boca ancha y lados rectos Nalgene con cierre de rosca de polipropileno blanco	Fisher Scientific	11-823-33	Para la fabricación de jaulas de 1 L. Thermo Scientific cat # 21171000. Se pueden utilizar recipientes alternativos de 1 litro.
Levadura seca activa Red Star, bolsa de 2 libras	Red Star		se puede comprar a Amazon.com u otros proveedores.
Concentrado de jugo de manzana 100% congelado			Se puede comprar en una tienda de comestibles. Tiene que decir "100% jugo de manzana" en la lata.
El 4-hidroxibenzoato de metilo	Acros Organics	también AC126965000	conoce como metilparabeno o Tegosept. Se utiliza como conservante en las placas AJ.
IGEPAL CA-630 para biología molecular, 100 ml	Sigma	I8896	utilizado para la preparación de tampón de lisis.
Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido de Nalgene con membrana CN	Fisher Scientific	09-740-2A	0.2 μ m tamaño de poro. Se utiliza para filtrar tampón de lisis 5x. Thermo Scientific gato # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Inhibidor de la Proteasa Cocktail	Sigma 11697498001		Vial de 20 comprimidos. Se utiliza para la inhibición de proteasas en tampones de lisis.
Filtros de jeringa Corning SFCA	Fisher Scientific	09-754-21	diámetro 26 mm, tamaño de poro 0,45 m. Se utiliza para filtrar muestras de extracto final.
BD  Luer-Lok Jeringas Desechables sin Agujas	Fisher Scientific	14-823-2A	para el filtrado de muestras de extracto final. BD gato # 309604.
La lejía	Clorox		utilizada para la descorionación de embriones al 50% (vol/vol) en agua, se puede comprar en cualquier supermercado. Es importante utilizar la marca Clorox, ya que otras marcas pueden dar lugar a una decorionación incompleta o pueden ser tóxicas para los embriones.
Corning Costar Netwell Plates	Fisher Scientific	07-200-213	contenedores de malla para colecciones de embriones. 74 μ M tamaño de malla, 6 pocillos.
Trituradores de tejidos Wheaton Sounce, capacidad 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	homogeneizador para embriones, con morteros sueltos y apretados. Gato Wheaton # 357544.