Métodos para la extracción de endosimbiontes de la mosca blanca Bemisia tabaci

Resumen

En este sentido, se presenta un protocolo para aislar endosimbiontes de la mosca blanca Bemisia tabaci a través de la disección y la filtración. Después de la amplificación, las muestras de ADN son adecuadas para la posterior secuenciación y estudio del mutualismo entre los endosimbiontes y la mosca blanca.

Resumen

Los simbiontes bacterianos forman una relación íntima con sus huéspedes y otorgan ventajas a los huéspedes en la mayoría de los casos. La información genómica es fundamental para estudiar las funciones y la evolución de los simbiontes bacterianos en su huésped. Como la mayoría de los simbiontes no pueden cultivarse in vitro , los métodos para aislar una cantidad adecuada de bacterias para la secuenciación del genoma son muy importantes. En la mosca blanca Bemisia tabaci , se ha identificado una serie de endosimbiontes y se prevé que sean importantes en el desarrollo y la reproducción de las plagas mediante múltiples enfoques. Sin embargo, el mecanismo que sustenta a las asociaciones sigue siendo en gran parte desconocido. El obstáculo proviene parcialmente del hecho de que los endosimbiontes en la mosca blanca, en su mayoría restringidos en bacteriocitos, son difíciles de separar de las células huésped. Aquí presentamos un protocolo paso a paso para la identificación, extracción y purificación de endosimbiontes de la mosca blanca B. tabaci principalmente por disectiY filtración. Las muestras de endosymbiont preparadas por este método, aunque todavía son una mezcla de diferentes especies endosymbiont, son adecuadas para secuenciación subsecuente del genoma y análisis de las posibles funciones de los endosimbiontes en B. tabaci . Este método también puede usarse para aislar endosimbiontes de otros insectos.

Introducción

Las bacterias que forman una relación simbiótica íntima con huéspedes relativos están muy extendidas en los artrópodos ¹ . Se ha demostrado que los endosimbiontes afectan aspectos de los huéspedes, como el metabolismo nutricional, la reproducción, las respuestas a las tensiones ambientales ^{2 , 3 , 4} , etc. , en casi todas las etapas del desarrollo ⁵ . Sin embargo, el mecanismo que sustenta a las asociaciones sigue siendo en gran parte desconocido. La genómica es de prioridad e importancia al estudiar las posibles funci....

Protocolo

1. Identificación de especies blancas y de cría de moscas blancas

1. Mantener las especies de mosca blanca en el algodón Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) en jaulas bajo condiciones estándar de 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% de humedad y 14 h de luz: 10 h de régimen oscuro.
2. Recoger una mosca blanca adulta individual y homogeneizar en 30 μl de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, Tween-20 al 0,45% [p / v], gelatina al 0,2% [p / Vol] Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinase K).
3. Incubar el homogeneizado a 65 ° C durante 1 hy luego 100 ° C durante 10 min.
   NOTA: El tiempo de incubación a 65 ° C puede aumentarse si es....

Resultados

La especie de Asia Menor 1 de Oriente Medio (MEAM1) del complejo de B. tabaci se tomó como ejemplo aquí para descripción. El algodón para la cría de la mosca blanca y varias etapas de desarrollo de la mosca blanca se muestran en la Figura 1, incluyendo una planta de algodón, mosca blanca adulta y las ninfas ^{1ª, 2ª} y ^4ª instar de mosca blanca (la ninfa de ^3ª instar se ve similarmente a la ninfa de ^4º

Discusión

Dado que los endosimbiontes dentro de las moscas blancas no se pueden cultivar in vitro, la disección y el ensamblaje de bacteriocitos es una forma efectiva de obtener suficiente material genético de endosimbiontes. Antes de la disección, se deben confirmar explícitamente las especies de mosca blanca y endosimbiontes involucradas. La mosca blanca B. tabaci es un complejo de especies con más de 35 especies morfológicamente indistinguibles y diferentes especies crípticas pueden contener diferentes endosim.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Taq ADN polimerasa	Takara	R001A	incluyendo rTaq, 10&veces; Tampón y dNTP
Gel kit de extracción de ADN	Qiagen	28704
Sistema de secuenciación de muestras de ADN	ABI	ABI-3730XL
Microtomo	Leica	EM UC7
Microscopía electrónica de transmisión	Hitachi	H-7650 TEM
Microscopio estereoscópico	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μ L microcargador	Eppendorf	F2771951
Portafiltros	Millipore	SX0001300
Filtro de membrana	Millipore	SMWP001300	5.0 μ m SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	kit de amlificación de ADN
NanoDrop	Thermo Scientific	Fluorímetro NanoDrop 2000
Qubit	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Secuenciador de genoma	Illumina	Hiseq 2000