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Artículo de método

Un sistema de tomografía fotoacústica compacta de alto rendimiento para

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⸱

DOI:

10.3791/55811

⸱

21 de junio de 2017

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

En este artículo

Resumen

Se demuestra un sistema compacto de tomografía fotoacústica por diodos láser pulsado (PLD-PAT) para la obtención de imágenes cerebrales in vivo de alta velocidad en animales pequeños.

Resumen

La formación de imágenes de animales pequeños in vivo tiene un papel importante que desempeñar en los estudios preclínicos. La tomografía fotoacústica (PAT) es una modalidad emergente de imágenes híbridas que muestra un gran potencial tanto para aplicaciones preclínicas como clínicas. Los sistemas PAT (OPO-PAT) basados ​​en osciladores paramétricos ópticos convencionales son voluminosos y caros y no pueden proporcionar imágenes de alta velocidad. Recientemente, diodos láser pulsado (PLDs) han sido demostrados con éxito como una fuente de excitación alternativa para PAT. El diodo láser pulsado PAT (PLD-PAT) ha sido demostrado con éxito para imágenes de alta velocidad en fantasmas fotoacústicos y tejidos biológicos. Este trabajo proporciona un protocolo experimental visualizado para la imagenología cerebral in vivo utilizando PLD-PAT. El protocolo incluye la configuración compacta del sistema PLD-PAT y su descripción, la preparación de los animales para la obtención de imágenes cerebrales y un procedimiento experimental típico para la obtención de imágenes en 2D de cerebro de rata en sección transversal. El sistema PLD-PAT es compacto y económicoY puede proporcionar alta velocidad, imágenes de alta calidad. Se presentan imágenes cerebrales recogidas in vivo a diversas velocidades de exploración.

Introducción

La tomografía fotoacústica (PAT) es una modalidad de imagen híbrida que tiene muchas aplicaciones tanto en estudios clínicos como preclínicos 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . En PAT, los pulsos láser de nanosecondos irradian tejido biológico. La absorción de la luz incidente por los cromóforos del tejido conduce a un aumento local de la temperatura, que luego produce ondas de presión emitidas en forma de ondas sonoras. Un detector de ultrasonidos recoge las señales fotoacústicas en varias posiciones alrededor de la muestra. Las señales fotoacústicas (PA) se reconstruyen utilizando varios algoritmos (como un algoritmo de retardo y suma) 6 para generar la imagen fotoacústica.

Esta modalidad de imagen híbrida ofrece alta resolución, imágenes de tejidos profundos y contraste de absorción óptica alta 7 ,Class = "xref"> 8. Recientemente, se consiguió una profundidad de formación de imágenes de ~ 12 cm en el tejido del pecho de pollo con la ayuda de una longitud de onda más larga (~ 1.064 nm) y un agente de contraste exógeno llamado ftalocianina de fósforo. Esta sensibilidad a la profundidad es mucho mayor que la sensibilidad a la profundidad de otros métodos ópticos, como la microscopía confocal de fluorescencia, la microscopía de fluorescencia de dos fotones, la tomografía de coherencia óptica 11 , etc. Utilizando más de una longitud de onda, PAT puede demostrar cambios estructurales y funcionales en los órganos . Para muchas enfermedades humanas, los modelos de animales pequeños han sido bien establecidos 12 , 13 , 14 , 15 . Para la imagen de animales pequeños, se han demostrado varias modalidades. De todos estos enfoques, la imagen de PA ha ganado atención con bastante rapidez debido a las ventajas mencionadas anteriormente. PensilvaniaT ha demostrado su potencial para la imagen de los vasos sanguíneos en los tejidos y órganos ( es decir, el corazón, los pulmones, el hígado, los ojos, el bazo, el cerebro, la piel, la médula espinal, el riñón, etc ) de los animales pequeños 4 , 16 , 17 , 18 . PAT es una modalidad bien establecida para la imagen de cerebro de animales pequeños. PA ondas se producen debido a la absorción de luz por los cromóforos, por lo que de múltiples longitudes de onda PAT permite la cartografía de la concentración total de hemoglobina (HbT) y saturación de oxígeno (SO 2 ) 19 , 20 , 21 , 22 . La imagen neurovascular del cerebro se logró con la ayuda de agentes de contraste exógenos 12 , 23 , 24 . La modalidad PA puede ayudar a dar una mejor comprensión de la salud del cerebroProporcionando información a nivel molecular y genético.

Para la obtención de imágenes de animales pequeños, los láseres Nd: YAG / OPO son ampliamente utilizados como fuentes de excitación PAT. Estos láseres suministran ~ 5 ns pulsos de infrarrojo cercano con energía (~ 100 mJ en la ventana de salida OPO) a una frecuencia de repetición de ~ 10 Hz 25 . El sistema de PA equipado con tales láseres es costoso y voluminoso y permite la formación de imágenes a baja velocidad con transductores de ultrasonido de un solo elemento (UST) debido a la baja tasa de repetición de la fuente láser. Un tiempo típico de adquisición de línea A en tales sistemas de PA es ~ 5 min por sección transversal 25 . Un sistema de imágenes con un tiempo de medición tan largo no es ideal para la formación de imágenes de animales pequeños, ya que es difícil controlar los parámetros fisiológicos para la imagen de todo el cuerpo, imágenes temporales resueltas en el tiempo, etc. , O un láser de alta frecuencia de repetición, es posible aumentar la velocidad de formación de imágenes de PASistemas. El uso de un solo UST de un solo elemento para recoger todas las señales PA alrededor de la muestra limitará la velocidad de imagen del sistema. Múltiples UST de un solo elemento dispuestos en geometría circular o semicircular se demuestran para técnicas de imagen de alta velocidad y altamente sensibles. Los UST 26 basados ​​en matrices, tales como arrays lineales, semicirculares, circulares y volumétricos, se han utilizado con éxito para la obtención de imágenes en tiempo real 1 . Estos USTs basados ​​en array incrementarán la velocidad de imagen y reducirán la sensibilidad de medición, pero son caros. Sin embargo, la velocidad de formación de imágenes de los sistemas de PA que usan USTs basados ​​en array está todavía limitada por la velocidad de repetición del láser.

La tecnología de láser pulsado avanzó para producir diodos láser pulsado de alta frecuencia (PLD). 7.000 imágenes / s de imagen B-scan fotoacústica se demostró con PLDs utilizando una plataforma clínica de ultrasonido [ 27] . Tales PLD pueden mejorar la velocidad deE PAT, incluso con la geometría de exploración circular UST de un solo elemento. Los UST de un solo elemento son menos costosos y altamente sensibles, a diferencia de los UST basados ​​en array. Durante la última década, se informó poca investigación sobre el uso de PLDs de alta tasa de repetición como la fuente de excitación para la imagenología PA. Una fibra basada en el infrarrojo cercano-PLD se demostró para la imagen de PA fantasmas [ 28] . La imagen in vivo de los vasos sanguíneos a una profundidad de ~ 1 mm por debajo de la piel humana se demostró utilizando PLD de baja energía [ 29] . Se informó de un microscopio fotoacústico de resolución óptica basado en PLD (ORPAM). Utilizando PLDs, se demostró una imagen de 1,5 cm de profundidad a una velocidad de fotogramas de 0,43 Hz 30 . Muy recientemente, se informó de un sistema PLD-PAT que proporcionó imágenes en tan corto como ~ 3 sy a ~ 2 cm de profundidad de imagen en el tejido biológico [ 25 , 31] . Este estudio demostró que un sistema compacto de bajo costo puede proporcionarIncluso a altas velocidades. El sistema PLD-PAT puede utilizarse para la imagen fotoacústica de alta velocidad de fotogramas (7,000 fps), imágenes de vasos sanguíneos superficiales, imágenes de las articulaciones de los dedos, imágenes de tejidos de 2 cm de profundidad, imágenes cerebrales de animales pequeños, etc. Los pulsos de energía de pulsos bajos de PLD limitan su aplicación a imágenes multi-espectrales y de tejidos profundos. Se han llevado a cabo experimentos en animales pequeños utilizando el mismo sistema PLD-PAT usado para aplicaciones preclínicas. El propósito de este trabajo es proporcionar la demostración experimental visualizada del sistema PLD-PAT para la obtención de imágenes en vivo en 2D en vivo de animales pequeños.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur (Número de Protocolo Animal ARF-SBS / NIE-A0263).

1. Descripción del sistema

  1. Monte el PLD dentro del escáner circular, como se muestra en la Figura 1a . Conecte el PLD a la unidad de control del láser (LDU).
    NOTA: El PLD proporciona impulsos ~ 136-ns a una longitud de onda de ~ 803 nm, con una energía de impulso máxima de ~ 1,42 mJ y una tasa de repetición de hasta 7 kHz. La unidad de accionamiento de láser (LDU) incluye: un controlador de temperatura, una fuente de alimentación variable, una fuente de alimentación (12 V) y un generador de funciones; Ver la Tabla de Materiales. La fuente de alimentación variable se utiliza para controlar la potencia del láser, y el generador de funciones se utiliza para cambiar la tasa de repetición del PLD.
  2. Encienda el láser PLD. Establezca la tasa de repetición de PLD en "7,000" HZ utilizando el generador de funciones en la LDU. Aumentar la energía del pulso a 1,42 mJ ajustando la tensión de la fuente de alimentación variable a "3,1" V.
  3. Monte el difusor óptico (OD) delante de la ventana de salida PLD para hacer el haz de salida homogéneo, como se muestra en la Figura 1a .
    NOTA: Utilice un difusor con un grano fino ( es decir, pulimento de grano 1.500).
  4. Monte la UST enfocada en el soporte UST, de tal manera que se encuentre en el centro del área de exploración, como se muestra en la Figura 1a .
    NOTA: La frecuencia central de la UST es 2,25 MHz, y la distancia focal es 1,9 pulg.
  5. Coloque el detector de ultrasonidos dentro del tanque de acrílico, como se muestra en la Figura 1a . Llene el tanque con agua de modo que el UST esté totalmente sumergido.
    NOTA: Se utiliza un medio acuoso para acoplar la señal fotoacústica del cerebro (muestra) a la UST. Un tanque de agua de acrílico (WT, véase la tabla de materiales) era costumbre-designado para imágenes de animales pequeños. El esquema del diseño del tanque de agua se muestra en la Figura 1b .
  6. Compruebe la señal de PA de la muestra usando una unidad de pulsador / receptor (PRU, vea la Tabla de Materiales ).
    NOTA: Estas señales fueron digitalizadas por una tarjeta DAQ de 12 bits (ver la Tabla de Materiales ) a una velocidad de muestreo de 100 MS / s y se guardaron en una computadora.

2. Preparación de animales para imágenes cerebrales de ratas

NOTA: Se demostró el sistema PLD-PAT descrito anteriormente para la formación de imágenes de cerebros de animales pequeños. Para estos experimentos, se utilizaron ratas hembra sanas (véase la Tabla de Materiales ).

  1. Anestesiar al animal inyectando intraperitonealmente un cóctel de 2 ml de ketamina, 1 ml de xilazina y 1 ml de solución salina (dosificación de 0,2 ml / 100 g).
  2. Quitar la piel en el cuero cabelludo del animal con una podadora de pelo. Aplicar suavemente la crema depilatoria en el afeitadoPara el agotamiento de la piel.
    1. Retire la crema aplicada después de 4-5 min usando un hisopo de algodón.
    2. Aplicar ungüento desgarrante artificial a los ojos del animal para evitar la sequedad debido a la anestesia y la iluminación láser.
  3. Montar el soporte para animales (ver la Tabla de Materiales ) equipado con una máscara respiratoria (ver la Tabla de Materiales ) en un gato de laboratorio.
  4. Coloque el animal en posición prona sobre el soporte. Asegúrelo al soporte usando cinta quirúrgica para evitar el movimiento del animal durante la formación de imágenes.
  5. Asegúrese de que la máscara respiratoria cubre la nariz y la boca de la rata para administrar anestésico inhalado.

3. In Vivo Rat Brain Imaging

  1. Conecte la máscara de respiración a la máquina de anestesia. Encienda la máquina de anestesia y colóquela para suministrar 1,0 L / min de oxígeno con isoflurano al 0,75%.
    1. Sujete el oxímetro de pulsoS para controlar la condición fisiológica del animal.
  2. Aplicar una capa de gel de ultrasonido incoloro en el cuero cabelludo de la rata. Ajuste la posición del gato de laboratorio al centro del escáner. La máscara de respiración se personaliza para adaptarse a la ventana de imagen. El 10% del cono de la nariz comercialmente disponible se corta y luego se conecta a un trozo de guante.
    1. Ajuste la altura del gato de laboratorio manualmente para que el plano de imagen esté en el foco de la UST.
  3. Ajuste los parámetros en el software de adquisición de datos (consulte la Tabla de Materiales) según sea necesario. Ejecute el programa de adquisición de datos para iniciar la adquisición ( es decir, imágenes).
    NOTA: El programa se utiliza para girar el UST y recoger las señales PA de una línea. Las líneas A recogidas se guardarán en el ordenador.
  4. Observe al animal durante todo el período de formación de imágenes y proceda a la reconstrucción PAT después de completar la imagen.
  5. Una vez finalizada la adquisición de datos,Reconstruir la imagen del cerebro transversal de las líneas A utilizando el programa de software de reconstrucción.
  6. Apague el sistema de anestesia, retire al animal del escenario, devuélvalo a su jaula, y vigírelo hasta que recupere la conciencia.
    NOTA: Por ejemplo, si el UST se gira durante 5 s, el PLD entrega 35.000 pulsos (= 5 x 7.000) y el UST recoge 35.000 líneas A. Las 35.000 líneas A se reducen a 500 en un promedio de más de 70 señales (después de promediar líneas A = 35.000 / 70 = 500). La figura 1c ilustra la iluminación de los pulsos de láser y la recopilación de líneas A. Se debe utilizar un programa de reconstrucción basado en el algoritmo de retroproyección de demora y suma.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquemas del sistema PLD-PAT. (A) Esquema del PLD-PAT. PLD: diodo láser pulsado, CSP: circuUnidad de impulsión del láser, unidad de pulsador / receptor, UST: transductor de ultrasonido, WT: depósito de agua, PF: película de polímero y DAQ: Tarjeta de adquisición de datos. ( B ) Esquema del tanque de agua, vista superior (1) y vista en sección transversal (2) para imágenes de cerebro de animal pequeño in vivo . A: tornillo métrico, B: placa anular de acrílico, C: anillo de silicona "O", D: 100 μm de espesor, cubierta de polietileno transparente. El tanque tenıa un orificio de 9 cm de diámetro en su fondo y se selló con una membrana de polietileno de 100 μm de grosor ultrasónica y ópticamente transparente. ( C ) Esquema de la iluminación de pulsos láser de las líneas PLD y A, recogida en un tiempo de exploración continua de 5 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

En esta sección se presentan los resultados in vivo de la obtención de imágenes cerebrales que demuestran las capacidades del sistema PLD-PAT descrito. Para demostrar las capacidades de formación de imágenes a alta velocidad del sistema PLD-PAT, se realizó la formación de imágenes en vivo de dos ratas sanas diferentes en vivo . La Figura 2 muestra las imágenes cerebrales de una rata hembra (93 g) a diversas velocidades de exploraci...

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Discusión

Este trabajo presenta un protocolo para la realización de imágenes cerebrales in vivo en ratas utilizando un sistema PLD-PAT. El protocolo incluye una descripción detallada del sistema de imagen y su alineación, así como una ilustración de imágenes cerebrales en ratas. Los sistemas de PAT existentes basados ​​en OPO son caros y voluminosos y pueden proporcionar una imagen en sección transversal en 5-10 min. El sistema PLD-PAT es compacto, portátil y de bajo costo y puede proporcionar imágenes de buena ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros relevantes en el manuscrito y no hay otros posibles conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

La investigación está respaldada por la subvención de Nivel 2 financiada por el Ministerio de Educación de Singapur (ARC2 / 15: M4020238) y el Consejo Nacional de Investigación Médica del Ministerio de Salud de Singapur (NMRC / OFIRG / 0005/2016: M4062012). Los autores desean agradecer al Sr. Chow Wai Hoong Bobby por la ayuda de la tienda de maquinaria.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Diodo láser pulsadoQuantel, FranciaQD-Q1910-SA-TECEs la fuente láser de excitación con especificaciones 803 nm, 1,4 mJ por pulso, 136 ns pulso, 7 kHz máximo, dimensiones: 11,0 x 6,0 x 3,6 cm, peso: ~150 gm
Motor paso a paso con caja de cambiosLIN Engineering (Servo Dynamics)Motor: CO-5718-01P, Caja de cambios: DPL64/1, I = 10 para NEMA 23; fuente de alimentación PW100-48Para mover el soporte del detector en una geometría circular. Torque: 2,08 N-m, Inercia del rotor: 2,6 kg-cm2
Emisor/receptor ultrasónicoOlympus5072PRPara recibir, filtrar y amplificar la señal PA de UST. Su ancho de banda es de 35 MHz y la ganancia es ± 59 dB.
Transductor de ultrasonidosOlympusV306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069Sensores ultrasónicos utilizados para la detección fotoacústica. Frecuencia central 2,25 MHz, 0,5 pulgadas, enfoque cilíndrico 1,9 pulgadas
PCIe DAQ (adquisición de datos) TarjetaGaGeCSE4227/ A6000610/B0E0061012 bits, 100 Ms/s, 2 canales, 1 Gs memoria integrada, interfaz PCIe x16
RatsIn Vivos Pte Ltd, SingapurNTac:SD, Sprague Dawley / SDHembra, peso 100 ±
Tanque de agua acrílico de 10 g Taller de NTUHecho a medidaContiene el agua que actúa como medio de acoplamiento acústico entre el cerebro y el detector
Escáner circular hecho a medidataller de NTUestá hecho de aluminio  
Máquina de anestesiamedical plus pte ltdMáquina de anestesia sin reinhalación con concentrador de oxígeno.Suministra oxígeno e isoflurano a los animales
Oxímetro de pulso portátilMedtronicPM10N con sensor veterinarioMonitorea la oximetría de pulso del animal
Gel de ultrasonidoProgress/parker gel acquasonic PA-GEL-CLEA-5000Gel de ultrasonido transparente
Software de adquisición de datosNational Instruments Corporation,Austin,TX,EE. UU)NI LabVIEW 2015 SP1El programa basado en LabVIEW fue desarrollado en nuestro laboratorio para controlar el motor paso a paso y adquirir los sencillos de PA del detector
Software de procesamiento de datosMatlab (Mathworks, Natick, MA, EE. UU.)Matlab R2012bEl código de Matlab para la reconstrucción de imágenes de PA se desarrolló en nuestro laboratorio
Controlador de temperatura LaridTech, MO, EE. UU. MTTC1410Controlará constantemente la temperatura del PLD  
Fuente de alimentación de 12 V Voltcraft PPS-11810Para suministrar voltaje de funcionamiento para fuente
alimentación variable PLD BASETechBT-153Para cambiar la potencia de salida del láser
Generador de función FunktionsgeneratorFG250DPara cambiar la tasa de repetición del PLD. Proporcionará una señal TTL para sincronizar el DAQ con la excitación del láser.
Distribuidor de animalesIn Vivos Pte Ltd, SingapurDistribuidor de animales que suministra animales pequeños con fines de investigación.
Soporte para animalesTallerNTU Hecho a medidaSe utiliza para sujetar al animal en su abdomen
MascarillaTaller NTU HechomedidaSe utiliza junto con el soporte para animales para suministrar una mezcla de anestesia al animal
Pentobarbital sodioValabarbSe utiliza para eutanasiar al animal después de la experimento.
Difusor ópticoThorlabsDG10-1500Se utiliza para hacer que el rayo láser sea homogéneo
El escáner del de respiratoria a

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