Patógenos de transmisión alimentaria proyección utilizando Magneto-fluorescente Nanosensor: Detección rápida de e. Coli O157: H7

Summary

El objetivo general del presente Protocolo es sintetizar funcional nanosensores para el portable, eficiente, y rápida detección de específicamente las bacterias patógenas a través de una combinación de relajación magnética y las modalidades de emisión de fluorescencia.

Abstract

Enterohemorrágica Escherichia coli O157: H7 se ha ligado a ambas transmitidas por el agua y enfermedades transmitidas por los alimentos y sigue siendo una amenaza a pesar de los métodos de investigación de alimentos y agua utilizada en la actualidad. Mientras que los métodos convencionales de detección bacteriana, tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) detectan específicamente a contaminantes patógenos, requieren preparación de la muestra extensos y largos períodos de espera. Además, estas prácticas exigen instrumentos de laboratorio sofisticado y configuración y deben ser ejecutadas por profesionales capacitados. Aquí, se propone un protocolo para una técnica de diagnóstico más simple que ofrece una combinación única de parámetros magnéticos y fluorescentes en una plataforma basada en nanopartículas. La propuesta nanosensores de magneto-fluorescente multiparamétrico (MFnS) pueden detectar contaminación de e. coli O157: H7 con tan poco como 1 unidad formadora de colonias presente en solución en menos de 1 h. Además, la capacidad de MFnS permanecer altamente funcional en medios complejos tales como leche y agua del lago ha sido verificada. Análisis de especificidad adicional también fueron utilizados para demostrar la capacidad de MFnS para detectar sólo las bacterias objetivo específico, incluso en presencia de especies bacterianas similares. El apareamiento de las modalidades magnéticas y fluorescentes permite la detección y cuantificación de la contaminación por patógenos en una amplia gama de las concentraciones, exhibiendo su alto rendimiento en la detección de contaminación de ambas etapa temprana y tardía. La eficacia, la asequibilidad y la portabilidad de los MFnS hacen un candidato ideal para punto de atención detección de bacterias contaminantes en una amplia gama de ajustes, de reservorios acuáticos a alimentos envasados comercialmente.

Introduction

La ocurrencia persistente de contaminación bacteriana en los alimentos comercialmente producidos y fuentes de agua ha creado la necesidad de plataformas diagnóstico cada vez más rápidas y específicas. ^{1 , 2} algunos de los más comunes contaminantes bacterianos responsables de contaminación de alimentos y agua son de los géneros Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus y Escherichia. ^{3 , 4} contaminación bacteriana por estos patógenos a menudo resultados en síntomas tales como fiebre, cólera, gastroenteritis y diarrea. ⁴ contaminación de fuentes de agua a menudo tiene efectos drásticos y nocivos en las comunidades sin acceso a agua suficientemente filtrada y contaminación de los alimentos ha llevado a un gran número de enfermedades y los esfuerzos de recuperación de producto. ^{5 , 6}

Con el fin de reducir la ocurrencia de enfermedades causadas por contaminación bacteriana, ha habido una serie de esfuerzos para desarrollar métodos con que agua y comida pueden eficientemente analizará antes de la venta o consumo. ³ técnicas como PCR,^1,7,8,9,10 ELISA,^11,(¹² ) amplificación isotérmica mediada lazo LÁMPARA),^13,14 entre otros,^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24} se han utilizado recientemente para la detección de diferentes patógenos. En comparación con bacterias tradicionales métodos de cultivo, estas técnicas son mucho más eficientes en cuanto a la especificidad y el tiempo. Sin embargo, estas técnicas aún batallan con los falsos positivos y negativos, procedimientos complejos y los costos. ^{1 , 3 , 25} es por este motivo que nanosensores de magneto-fluorescente multiparamétrico (MFnS) se propusieron como un método alternativo para la detección de bacteria.

Estos nanosensores únicamente par juntos relajación magnética y modalidades fluorescentes, lo que permite una plataforma de doble detección rápida y precisa. Utilizando e. coli O157: H7 como un contaminante de la muestra, se demuestra la capacidad de MFnS para detectar tan poco como 1 UFC en minutos. Anticuerpos patógenos específicos se utilizan para aumentar la especificidad, y permite la combinación de modalidades magnéticas y fluorescentes para la detección y cuantificación de contaminantes bacterianos en dos rangos de baja y alta contaminación. ¹⁶ en el caso de contaminación bacteriana, los nanosensores que pululan alrededor de las bacterias debido a las capacidades de segmentación de los anticuerpos específicos del patógeno. La unión entre las bacterias y nanosensores magnético limita la interacción entre el núcleo de hierro magnético y los protones de agua circundantes. Esto provoca un aumento en los tiempos de relajación T2, según lo registrado por un relaxometer magnético. Medida que aumenta la concentración de bacterias en solución, los nanosensores dispersan con el aumento del número de bacterias, lo que resulta en valores más bajos de la T2. Por el contrario, emisión de fluorescencia se incrementará en proporción a la concentración de bacterias, debido al mayor número de nanosensores vinculado directamente al patógeno. Centrifugación de las muestras y el aislamiento de los pellets bacterianos, sólo conservará las nanopartículas conectadas directamente a las bacterias, la eliminación de cualquier flotante nanosensores y correlacionar directamente la emisión de fluorescencia con el número de bacterias presentes en la solución. Una representación esquemática de este mecanismo se representa en la figura 1.

Esta plataforma de MFnS ha sido diseñada con proyección del punto de atención en la mente, dando por resultado características portables y de bajo costo. MFnS son estables a temperatura ambiente y sólo son necesarios en concentraciones muy bajas para la precisa detección de contaminantes bacterianos. Además, después de la síntesis, el uso de los MFnS es simple y no requiere el uso de profesionales en el campo. Por último, esta plataforma de diagnóstico permite orientación altamente personalizable, proporcionar un medio por que esta una plataforma puede usarse para detectar patógenos de todo tipo, en muchos entornos diferentes.

Protocol

1 síntesis y funcionalización de nanosensores multi-paramétrico de Magneto-fluorescente (MFnS).

1. Síntesis de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas (IONPs)
   1. para preparar síntesis IONP, preparar las 3 siguientes soluciones: solución 1: FECLAS ₃ 0,70 g y FECLAS ₂ H ₂ O (2 mL), solución 2: NH ₄ OH (2,0 mL, 13,4 M) en H ₂ O (15 mL) y solución 3: ácido poliacrílico (0,855 g) H ₂ O (5 mL).
   2. Agregar 90 μl de 2 M de ácido clorhídrico (HCl) solución 1 y luego mezcle inmediatamente con solución 2 mientras Vortex a 875 rpm. A continuación Agregar solución 3. Continuar con un vórtex durante 60 minutos
   3. Centrifugar 20 min a 1.620 x g. Centrifugar el sobrenadante por 20 min a 2.880 x g.
   4. Purifica el sobrenadante final mediante diálisis. Añadir el sobrenadante a una bolsa de diálisis (MWCO 6 − 8 K) y colóquelo en un vaso de precipitados que contiene tamponada fosfato salino (PBS) (pH = 7,4) y el bar de la vuelta. Deje reposar 12 h, reemplazando con el almacenador intermediario fresco cada 2-3 h.
2. Conjugación de anticuerpos específicos del destino a la superficie de IONPs
   1. preparar las siguientes cuatro soluciones: solución A: 5 mg de 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida clorhidrato (EDC) en 250 μl MES [2-(N- buffer de morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido] (0.1 M, pH = 6.8), solución B: 3 mg de N-Hydroxysuccinimide (NHS) en 250 μl de tampón MES (0.1 M, pH = 6.8), solución C: 5 μg de IgG1, el mAb de e. coli, en 225 μL de tampón fosfato salino (PBS) (pH 7.4) y solución D: 4 mL de IONP (5,0 mmol) en 1 mL de PBS (pH 7.4).
   2. Añadir 2 (N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (MES) del almacenador intermediario para la solución A, entonces inmediatamente agregue solución A la solución D en incrementos pequeños dentro de los 15 s, invertir la solución después de cada adición para la mezcla de.
   3. Comenzar inmediatamente a agregar solución B solución d en pequeños incrementos durante un período de tres minutos. Mezclar por inversión la solución después de cada adición.
   4. Agregar solución C solución en incrementos de 5 μl, invirtiendo la solución después de cada adición para la mezcla de.
   5. Permitir que la reacción continúe durante 3 h a temperatura ambiente y luego continuar la incubación a 4 ° C durante la noche.
   6. Purificar las resultantes IONPs conjugado con Ab vía columna magnética con PBS (pH = 7.4, final [Fe] = 3,5 mmol) para eliminar los anticuerpos sin conjugar.
      1. Lave la columna magnética con PBS (1 mL). Coloque la columna en la placa magnética y agregar solución IONP.
      2. Lavar la columna magnética con PBS (1 mL) otra vez. Retire la columna magnética placa magnética. Añadir PBS a la columna y recoger la solución. Conservar a 4 ° C
3. encapsulado de 1,1 fluorescente ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-tinte Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) en el recubrimiento de poliacrílico (PAA) el ácido de las IONPs de anticuerpo conjugado con una método de difusión del solvente.
   1. A 4 mL de las IONPs, añadir gota a gota 2.0 μL de colorante DiI (2 mmol) en 100 μl de DMSO con mezcla continua a 1100 rpm.
   2. Dializarse la solución resultante (MWCO 6-8 KDa, 12 h) contra PBS, creando una solución de MFnS final con una concentración final de hierro [Fe] = 2 mmol.
4. Caracterización de MFnS
   1. para el análisis espectrofotométrico, usar un lector de placas para detectar encapsulado DiI tinte con la emisión de fluorescencia a 595 nM.
   2. Dispersión dinámica de luz
      1. Coloque una muestra de la solución de MFnS en zetasizer para determinar el tamaño promedio y la carga superficial de los MFnS.
         Nota: Aquí, el tamaño promedio y la carga superficial de MFnS funcional fueron encontrados para ser 77.09 nm y-22.3 mV, respectivamente.

2. Bacteriana cultivo y preparación de solución Stock

1. cultivo bacteriano
   1. hidratar un pellet liofilizado (e. coli O157: H7) en 1 mL de caldo nutritivo y luego añadir un adicional 5 mL de caldo.
   2. Aplicar 100 μl de esta solución en una placa de agar y raya utilizando un asa de inoculación estéril, seguido por incubación a 37 ° C por 24 h.
   3. Después de 24 h, seleccionar una colonia aislada de la placa de agar y añadirlo a una 15 mL de caldo de cultivo. Incubar a 37 ° C durante 4-6 h, mientras el valor de densidad óptica (absorbancia a 600 nm).
   4. Una vez que se obtiene un valor de densidad óptica de 0.1, dejar de cultivar y realizar diluciones seriadas.
2. Diluciones seriadas
   1. Agregar 900 μl de caldo nutritivo a los ocho tubos de microcentrífuga estéril.
   2. Agregar 100 μl de la suspensión bacteriana en el primer tubo (dilución 10 ^-1).
   3. Tomar 100 μl del primer tubo y añade a la segunda, para obtener una dilución de 10 ^-2. Continuar este patrón para los tubos restantes, terminando con una dilución final de 10 ^-8.
   4. Transferir 100 μl de cada tubo para separar las placas de agar e incubar por 24 h a 37 ° C.
   5. Al día siguiente, contar las colonias formando unidades (UFC) en cada placa. Seleccione la placa con ~ 100 UFC. Utilizar las diluciones correspondientes para experimentos adicionales (100 μl = ~ 100 unidades formadoras de colonias).
      Nota: Aquí es la dilución 10 ^-6 que dio lugar a la UFC de ~ 100.

3. Rápida detección de E. coli O157: H7 con MFnS

1. Spike diversas soluciones de PBS (1 X, pH 7,4, 300 μL) con cantidades crecientes de la población bacteriana de 10 ^-6, resultando en UFC oscila entre 1-100. Agregue una cantidad consistente de MFnS (100 μL) a estas soluciones.
2. Crear una solución de referencia que contiene solamente PBS (1 X, pH 7,4, 300 μL) y MFnS (100 μL).
3. Incubar soluciones durante 30 min a 37 ° C y luego déjelos enfriar a temperatura ambiente.
4. Transferencia de soluciones individuales a la relaxometer magnética (Tesla 0,47) y grabamos cambios en tiempos de relajación (T2) en relación con el UFC en cada solución.
   1. Registrar cambios en los valores de T2, comenzar midiendo el valor de T2 de la solución de referencia que contiene solamente PBS y MFnS. Relaxometer
      1. lugar la solución en el magnético. Abra el software respectivo, seleccione la " T2 relajación " programación y oprima " medida. "
   2. siguiendo la colección de la línea de base de T2, medir los valores de T2 de las soluciones adicionales que se añadieron varios concentraciones de bacterias.
      Nota: El cambio en T2 es equivalente a base T2 restada de la T2 claveteados.
5. Extraer muestras de la relaxometer magnética y centrifugar los tubos a 2880 x g durante 10 minutos
6. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano en 100 μl de PBS (1 X, pH 7.4).
7. Añadir 80 μl de cada resuspensión a una placa de 96 pocillos e intensidades de fluorescencia récord a 595 nM.
   Nota: La prueba puede repetirse utilizando diferentes solventes como agua, leche y otros, como se describe en la sección de resultados

Results

El mecanismo de acción de MFnS está representado en la figura 1. El agrupamiento de MFnS alrededor de la superficie de contaminantes bacterianas interfiere con las interacciones entre la magnetic cores de los MFnS y los núcleos de hidrógeno circundante. Como resultado de este agrupamiento, magnética relajación aumentan de valores. A medida que aumenta la concentración de contaminantes bacterianos, agrupamiento reduce, y el cambio en los valores de T2 disminuye. Por lo tanto, la adición de un...

Discussion

Este protocolo ha sido diseñado para producir MFnS completamente funcional como simplemente como sea posible. Sin embargo, hay muchos puntos claves en el que alteración del Protocolo puede ser útil, dependiendo de la finalidad del usuario. Por ejemplo, el uso de diferentes anticuerpos permitiría atacar muchos otros patógenos. Además, este Protocolo no se limita a la utilización de anticuerpos como dirigidos a moléculas. Cualquier molécula que tiene afinidad de Unión específicos para patóg...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro ferroso tetrahidratado	Fisher Scientific	I90-500
Cloruro férrico hexahidratado	Fisher Scientific	I88-500
Hidróxido de amonio	Fisher Scientific	A669S-500
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144S-500
Ácido poliacrílico	Sigma-Aldrich	323667-100G
EDC	Thermofisher Scientific	22980
NHS	Fisher Scientific	AC157270250
Anticuerpo anti-E. coli O111	SERA care	5310-0352
Anticuerpo anti-E. coli O157:H7 [P3C6]	Abcam	ab75244
DiI Stain	Fisher Scientific	D282
Caldo de nutrientes	Difco	233000
E. coli liofilizado O157:H7 pellet	ATCC	700728
Relaxomteter magnético	Bruker	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Lector de placas	Columna magnética Tecan	Infinite M200 PRO
	Centrífuga QuadroMACS	130-090-976
Centrífuga	de la serie		Eppendorf
(accuSpin Micro 17)	Fisher Scientific	13-100-676
Incubadora de agitación	modelo de suelo SHEL LAB	SSI5
Balanza analítica	Metler Toledo	ME104E
Mezclador de vórtice digital	Fisher Scientific	02-215-370
Agitador mecedora al aire libre	Fisher Scientific	02-217-765