Este protocolo describe una estrategia optogenética para modular la actividad de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario de Xenopus . Este método permite la activación reversible de la vía de señalización MAPK en el cultivo de células de mamíferos y en organismos vivos multicelulares, como los embriones Xenopus , con alta resolución espacial y temporal.
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Artículo de método
Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y
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Resumen
Resumen
La actividad quinasa es crucial para una plétora de funciones celulares, incluyendo proliferación celular, diferenciación, migración y apoptosis. Durante el desarrollo embrionario temprano, la actividad de la quinasa es altamente dinámica y generalizada a través del embrión. Los enfoques farmacológicos y genéticos se utilizan comúnmente para investigar las actividades de la quinasa. Desafortunadamente, es difícil lograr una resolución espacial y temporal superior usando estas estrategias. Además, no es factible controlar la actividad quinasa de una manera reversible en células vivas y organismos multicelulares. Tal limitación sigue siendo un cuello de botella para lograr una comprensión cuantitativa de la actividad de quinasa durante el desarrollo y la diferenciación. Este trabajo presenta una estrategia optogenética que aprovecha un sistema bicistrónico que contiene proteínas fotoactivables Arabidopsis thaliana criptocromo 2 (CRY2) y el dominio N-terminal de la hélice bucle-hélice-base que interactúa con criptocromo. ReversiBle de la ruta de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) se logra a través de la translocación de proteínas mediada por luz en células vivas. Este enfoque puede aplicarse a cultivos de células de mamíferos y embriones de vertebrados vivos. Este sistema bicistrónico puede generalizarse para controlar la actividad de otras quinasas con mecanismos de activación similares y puede aplicarse a otros sistemas modelo.
Introducción
Los factores de crecimiento están involucrados en un amplio espectro de funciones celulares, incluyendo proliferación, diferenciación, migración y apoptosis, y juegan papeles cruciales en muchos eventos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, el envejecimiento y la regulación del estado mental 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Muchos factores de crecimiento señalan a través de complejas cascadas de señalización intracelular. Estos eventos de señalización son a menudo operados por la fosforilación de proteínas ....
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Protocolo
La investigación en animales se realizó de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de Illinois (IACUC) y el Departamento de Recursos Animales de la Universidad de Illinois (DAR).
1. Inducción optogenética de la localización de proteínas en BHK21 Cultura de células de mamíferos
NOTA: Los pasos 1.1-1.3 proporcionan un método para ensamblar una cámara de cultivo de células para la obtención de imágenes con objetivos de alta ampliación ( por ejemplo, 63X o 100X), que típicamente tienen distancias de trabajo cortas. Estos objetivos requieren un cubreobje....
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Resultados
Expresión Ratiométrica de pares de proteínas fotoactivables: La Figura 1A muestra el diseño de una construcción optogenética bicistrónica, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (denominada CRY2-2A-2CIBN), basada en la proteína teschovirum- 1 2A (P2A), que muestra la más alta eficiencia de omisión de ribosomas entre las líneas celulares de mamíferos [ 42] . En trabajos previos, se ha determinado que la relación óptima para CIBN-GFP-.......
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Discusión
Cuando se construye la caja de luz, se debe medir la potencia de los LED individuales. Según la experiencia anterior, la potencia de salida puede variar entre LED individuales debido a la variación de fabricación. Seleccione un conjunto de LED que tengan una potencia de salida de 10% entre sí. El número de LEDs, la resistencia de limitación de corriente y la entrada de potencia se pueden modificar para diferentes tipos de recipientes de cultivo celular ( por ejemplo, una placa de 6 pocillos o de 24 pocillos). U.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign (UIUC) y los Institutos Nacionales de Salud (NIGMS R01GM111816).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cubreobjetos de vidrio | VWR | 48393 230 | Sustrato para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Soporte de cubreobjetos | Newcomer Supply | 6817B | Soporte para cubreobjetos |
| Detergente | ThermoFisher | 16 000 104 | Para la limpieza de cubreobjetos |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B6768-500G | Para hacer tampón PLL |
| Tetraborato disódico | Sigma-Aldrich | 71996-250G | Para hacer Tampón PLL |
| Vaso de precipitados de plástico | Nalgene | 1201-1000 | Para la limpieza de cubreobjetos |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | Para ajustar el pH |
| Hidrobromuro de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | Para recubrimiento de cubreobjetos |
| Agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) | ThermoFisher Scientific 750024 | Para la preparación de ADN | |
| Pinza de cubreobjetos | Ted Pella | 5645 | Manipulación de cubreobjetos |
| Plato de corte de pañuelos | Thermofisher | 12565321 | Placa de cultivo celular |
| Tubos de centrífuga estériles | ThermoFisher | 12-565-271 | Almacenamiento tampón |
| Reactivo de transfección | ThermoFisher | R0534 | Transfección |
| < CO>2 | independiente ThermoFisher 18045088 | Para la adquisición de imágenes de células vivas | |
| Polidimetilsiloxano (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Forma de hacer cámara celular |
| Plásmido Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Preparación de plásmidos |
| Medio DMEM | ThermoFisher | 11965-084 | Componente del medio de cultivo celular |
| F12K | Medio ThermoFisher | 21127022 | Componente del medio de cultivo celular |
| Suero de caballo | ThermoFisher | 16050122 | Componente del medio de cultivo celular |
| Suero fetal bovino | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Componente del medio de cultivo celular |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina | ThermoFisher | 10378016 | Componente del medio de cultivo |
| celular Tripsina (0,25%), rojo de fenol | ThermoFisher Scientific 15050065 | Para la disociación de células de mamíferos | |
| Agarosa | Fisher Scientific | BP1356-100 | Para la preparación de ADN |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | Para tampón embrionario |
| Clorhidrato de L-Cisteína monohidrato | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Preparación de ovocitos |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | Para la linealización de plásmidos |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | Para la eliminación de la plantilla de ADN en el ensayo de transcripción in vitro |
| Materiales de coincidencia de índice (aceite de inmersión) | Thorlabs | MOIL-20LN | Para hacer coincidir el índice entre el sustrato de la muestra y el objetivo |
| LED azul | Adafruit | 301 | Fuente de luz para estimulación optogenética |
| Kit de resistencias | Resistencia limitadora de corriente | Amazon | EPC-103 |
| Cajas de aluminio | BUD Industries | AC-401 caja de | luz |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | Para hacer matriz de LED |
| Cable de conexión | Electronix Express | 27WK22SLD25 | Para hacer matriz de LED |
| Módulo de relé | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | Para control de luz intermitente |
| Fuente de alimentación de CC | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Fuente de alimentación para silicio LED |
| Potencia Cabezal | Thorlabs | S121C | Para la medición de la intensidad de la luz |
| Medidor | de potencia Thorlabs | PM100D | Para la medición de la intensidad de la luz |
| Microscopio | Leica Biosystems | DMI8 | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Cabina de bioseguridad | ThermoFisher | 1300 Series A2 | Para la manipulación de células |
| de mamíferos Incubadora de CO2 | ThermoFisher | Isotemp | Para el cultivo de células de mamíferos |
| Microscopio estereoscópico | Leica | M60 | Para la micromanipulación de embriones |
| Microinyector | Narishige | IM300 | Para microinyección de embriones |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instruments | P87 | Extractor de agujas |
| in vitro kit de transcripción | ThermoFisher | AM1340 | Para transcripción in vitro. El kit incluye agua libre de nucleasas, SP6 RNA Polimerasa, mezcla de ribonucleótidos, análogo de tapa, solución de precipitación de chorro de litio y columna de centrifugación |
| de purificación de ARN | Qiagen | 74104 | Columna de espín de membrana de sílice para la purificación de ARN sintetizado |
| Horno de convección | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | curado PDMS |
| y contenedor de teflón | THINKY | AR310 | Para mezclar PDMS |
| Oblea de silicona | UniversityWafer | 452 | Base para hacer dispositivos PDMS |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | Para cortar PDMS |
| Vidrio capilar | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Para la fabricación de agujas de inyección.& nbsp; |
Referencias
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 39....
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Reimpresiones y permisos
