Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria

Summary

Endotelio vascular controla firmemente el reclutamiento leucocitario. Extravasación leucocitaria inadecuada contribuye a enfermedades inflamatorias humanas. Por lo tanto, es necesario diseñar mejores terapias para trastornos inflamatorios buscando nuevos elementos reguladores de la activación endotelial. Aquí, describimos una completa metodología para caracterizar nuevos reguladores endoteliales que pueden modificar el tráfico de leucocitos durante la inflamación.

Abstract

La capa endotelial es esencial para mantener la homeostasis en el cuerpo mediante el control de muchas funciones diferentes. Regulación de la respuesta inflamatoria por la capa endotelial es crucial para combatir eficientemente insumos perjudiciales y ayuda en la recuperación de áreas dañadas. Cuando las células endoteliales están expuestas a un ambiente inflamatorio, como el componente externo de la membrana de bacterias Gram-negativas, lipopolisacárido (LPS), express soluble citoquinas proinflamatorias, tales como Ccl5, Cxcl1 y Cxcl10 y desencadenar la activación de leucocitos en circulación. Además, la expresión de moléculas de adhesión E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1 en la superficie endotelial permite la interacción y adhesión de los leucocitos activados a la capa endotelial y finalmente la extravasación hacia los tejidos inflamados. En este escenario, la función endotelial debe ser estrictamente regulada debido a una activación excesiva o defectuosa en el reclutamiento de leucocitos podría conducir a trastornos inflamatorios. Puesto que muchos de estos trastornos no tienen un tratamiento eficaz, deben investigarse nuevas estrategias con un enfoque en la capa vascular. Proponemos el análisis integrales que son útiles para la búsqueda de nuevos reguladores endoteliales que modifican la función leucocitaria. Analizamos activación endotelial utilizando objetivos de expresión específicos involucrados en el reclutamiento de leucocitos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión) con varias técnicas, incluyendo: (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real RT-qPCR), western-blot, ensayos de citometría y adhesión de flujo. Estos enfoques determinan la función endotelial en el contexto inflamatorio y son muy útiles para llevar a cabo ensayos de investigación para caracterizar nuevos reguladores inflamatorios endoteliales que son potencialmente valiosos para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.

Introduction

La inflamación es una respuesta biológica beneficiosa frente a agentes infecciosos, con el objetivo principal para eliminar el patógeno y reparar el tejido dañado. Bajo ciertas condiciones, como infecciones crónicas o enfermedades autoinmunes, la inflamación no se resuelve. En cambio, es una reacción aberrante con la continua infiltración de leucocitos, dando por resultado una respuesta inmune prolongada que conduce a daño de tejido, fibrosis, pérdida de función y en general, discapacidad y en algunos casos la muerte del paciente. Estos trastornos humanos, catalogados como enfermedades inflamatorias, todas involucran los vasos sanguíneos para el control de leucocitos ....

Protocol

1. cultivo de células endoteliales

1. cultivo de tejidos tratados placas
   1. placas de cultivo de tejidos capa 100 mm con gelatina de 2,5 mL de solución (autoclave, 0.1% gelatina en agua destilada) por 30 min a 37 ° C; esta puede ser extrapolado para el formato bien requerido. Aspirar la solución de gelatina y dejar placas secar al aire en la campana de cultivo de tejido.
2. Las condiciones de cultivo de tejidos
   1. cultivar las células de la LMCE-04 dentro de una incubadora biológica (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO ₂). Crecer las células en un medio completo de Dulbecco ' s Modified Eag....

Results

Evaluación de la activación de células endoteliales inducida por LPS por RT-qPCR

El suero de hambre LMCE-04 las células fueron estimuladas por 100 ng/mL de LPS durante 6 h, y la expresión de genes endoteliales se evaluó mediante RT-qPCR comparando la expresión de marcadores de activación a la condición de reposo. Como se muestra en la figura 1A, las células se incubaron LPS LMCE-04 indujeron la expresi.......

Discussion

Este protocolo endotelial describe una tecnología paso a paso que establece las bases para explorar nuevos mecanismos implicados en la regulación de la respuesta inflamatoria. Estos enfoques se basan en el estudio de la actividad endotelial estimulado por LPS y evaluar los pasos críticos involucrados en el reclutamiento de leucocitos durante la respuesta inflamatoria, específicamente: liberación de citoquinas endotelial, adhesión endotelial las moléculas expresión y leucocito adherencia a la capa vascular. Una vez que se.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatina	Sigma	G9391
DMEM-F12	Lonza	BE12-719F
Suero fetal bovino	Sigma	A4503
Penicilina estreptomicina	Lonza	DE17-602E
Tripsina	Lonza	BE17-160E
EDTA	Sigma	ED2SS
LPS	Sigma	L2880
Trizol	Sigma	T9424	Tampón de extracción de ARN
Isopropanol	Sigma	33539
Etanol absoluto	Panreac	1.310.861.612
H2O	Qiagen	1017979	Agarosa libre de ARNasa
	Pronadisa	8020
Tinción para geles de agarosa	Invitrogen	s33102
SuperScript III Sintetizador de primera cadena	de 18080051	Invitrogen	para RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385610	Tinción fluorescente para qPCR
MicroAmp Fast Optical Biosystems de 96 pocillos	aplicados	4346906	para qPCR
Placas de 96 pocillos con fondo en U	Falcon	353072
Tubos de citometría	Falcon	352054
TX100	Panreac	212314	Tensioactivo no iónico
Tris-HCl	Panreac	1.319.401.211
Cloruro de sodio	Merck	1.064.041.000
Pirofosfato de sodio	Sigma	221368
Fluoruro de sodio	Sigma	S7920
Ortovanadato de sodio	sigma	13721-39-6
Cóctel de inhibidores de la proteasa	sigma	P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225	Reactivos para el ensayo de ácido bicinconínico
β-mercaptoetanol	merck	805,740
PVDF Membrana de transferencia, 0.45 µ m	Thermo Scientific	88518
Tween-20	Panreac	1.623.121.611	Polisorbato 20
PBS	Lonza	BE17-515Q
ECL	Millipore	WBKLS0500
Fibronectina	Sigma	F1141
Laminina	Sigma	L2020
Colágeno tipo I	Sigma	c8919
Ácido acético	Panreac	1.310.081.611
Azul de tripán	Sigma	T8154
Paraformaldehído	Sigma	P6148
Metanol	Panreac	1.310.911.612
Violeta cristalino	Sigma	HT90132
Citrato de sodio	Sigma	C7254
Etanol 96%	Panreac	1.410.851.212
CFSE	Sigma	21888
RPMI	Lonza	BE12-115F
SDS	Bio-Rad	161-0418
Infinite M200	Tecan	M200	Lector de microplacas multimodo
Gel Doc 2000	Bio-Rad	2000	Sistema de documentación de gel
StepOnePlus	qPCR	StepOnePlus	Applied Biosystems
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	Analyzer 10	Equipo de citometría
ChemiDoc MP	Bio-Rad	MP	Sistema de detección de quimioluminiscencia
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpos
PECAM-1	BD Biosciences	553370	Uso en 10 y micro; g/mL
ICAM-2	Biolegend	1054602	Uso a 10 µ g/mL
E-selectina	BD Biosciences	553749	Uso a 10 µ g/mL
VCAM-1	BD Biosciences	553330	Uso a 10 y micro; g/mL
ICAM-1	Becton Dickinson	553250	Uso a 10 µ g/mL
anti-ratas IgG-FITC	Jackson Immuno Research	112-095-006	Uso en 10 µ g/mL
anti hámster armenio-FITC	Jackson Immuno Research	127-095-160	Uso a las 10 & g/mL
Rata IgG isotyope control	Invitrogen	10700	Uso a 10 µ g/mL
Hámster armenio IgG control de isotipo	Invitrogen	PA5-33220	Uso a 10 µ g/mL
P-Iκ β-&alfa;	Señalización celular	2859	Uso a las 10 y micro; g/mL
β-Actina	Sigma	A5441	Uso a 10 µ g/mL
P-ERK	Señalización de celdas	9101	Uso a 10 y micro; g/mL
anti-ratón HRP	GE Healthcare	LNXA931/AE	Uso a 1:10.000
anti-conejo HRP	GE Healthcare	LNA934V/AG	Uso a 1:10.000
anti-ratas HRP	Santa Cruz	Sc-3823	Uso a 1:10.000