Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Resumen

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Resumen

Genoma de todo el mapa de las interacciones proteína-ADN es fundamental para la comprensión de la regulación de genes, la remodelación de la cromatina, y otros procesos de cromatina-residente. La reticulación del formaldehído seguida por la inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (X-ChIP-seq) se ha utilizado para obtener muchas ideas valiosas sobre la biología del genoma. Sin embargo, X-ChIP-seq tiene limitaciones notables ligadas a reticulación y sonicación. ChIP nativo evita estos inconvenientes omitiendo la reticulación, pero a menudo da como resultado una recuperación deficiente de las proteínas unidas a la cromatina. Además, todos los métodos basados ​​en ChIP están sujetos a consideraciones de calidad de anticuerpos. También se han utilizado métodos enzimáticos para correlacionar interacciones proteína-ADN, que implican la fusión de una proteína de interés con una enzima modificadora de ADN, para mapear interacciones proteína-ADN. Recientemente hemos combinado uno de estos métodos, la cromatina endógena escisión (ChEC), con alto rendimiento de secuenciación como ChEC-seq. ChEC-seq se basa en la fusión de una cromatina-assoc(MNase) para generar segmentación de ADN dirigida en presencia de calcio en células vivas. ChEC-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto eludir las preocupaciones potenciales con la reticulación, sonicación, solubilización de la cromatina, y la calidad de anticuerpos, mientras que la asignación de alta resolución con una mínima señal de fondo. Prevemos que ChEC-seq será una poderosa contrapartida a ChIP, proporcionando un medio independiente para validar los hallazgos de ChIP-seq y descubrir nuevos conocimientos sobre la regulación genómica.

Introducción

El mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción (FT), remodeladores de cromatina y otros factores reguladores asociados a la cromatina es clave para comprender todos los procesos basados ​​en la cromatina. Mientras que la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) enfoques se han utilizado para obtener muchas ideas importantes en la biología del genoma, tienen limitaciones notables. Recientemente hemos introducido un método alternativo, denominado cromatina endógena clivaje y de alto rendimiento de secuenciación (ChEC-seq) ¹ , para eludir estos inconvenientes.

Ch....

Protocolo

1. Generación de cepas de levadura

1. Genere una cepa de levadura que tenga el factor de interés marcado con MNase.
   1. PCR amplifican el casete de marcado MNase del vector deseado ( Tabla 1 ) usando la mezcla de reacción especificada ( Tabla 2 ) y las condiciones de ciclación ( Tabla 3 ). Mezclar 5 μL de la reacción de PCR y 1 μl de colorante de carga de ADN 6X. Ejecutar cada alícuota de PCR en un gel de agarosa al 0,8% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 2.3 kb.
   2. Transformar el casete de marcado amplificado en la cepa de elección utilizando la transfor....

Resultados

En el caso de un experimento de ChEC exitoso, el análisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa revelará un aumento dependiente de calcio en la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo, tal como se indica por el desprendimiento y la digestión completa final del ADN genómico. En algunos casos, se observa una escalera de bandas similar a la observada con una digestión MNasa tradicional después de una digestión prolongada. Este es el caso de ChEC análisis de Reb1, un factor re.......

Discusión

Hemos demostrado que ChEC puede mapear diversas clases de proteínas de levadura en la cromatina, y anticipar que será ampliamente aplicable a diferentes familias de TFs y otros factores de unión a la cromatina en la levadura. ChEC-seq es ventajoso en que no requiere reticulación, solubilización de cromatina, o anticuerpos. Por lo tanto, ChEC evita artefactos potencialmente presentes en X-ChIP-seq, como el artefacto hiper-ChIPable ^{3 , 4} , y ChIP nativo, tales com.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
dNTPs	NEB	N0447
Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad	NEB	M0491L	Otras ADN polimerasas de alta fidelidad, como Phusion, se pueden utilizar para la amplificación de casetes.
Escalera de ADN TrackIt 1 Kb Plus	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq ADN polimerasa	NEB	M0273L
cOmplete Mini cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA	Sigma-Aldrich	11836170001	Es importante que se utilice una mezcla de inhibidores de proteasa sin EDTA, para no inhibir la escisión de MNasa mediante la quelación de Ca2+.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonina, EMD de alta pureza	Millipore	300410-250MG	Haga un caldo del 2% disolviendo 20 mg de digitonina en 1 mL DMSO con vórtice vigoroso.
Proteinasa K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNasa A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Perlas Ampure XP	Beckman Coulter	A63880	Las perlas similares a Ampures se pueden generar utilizando un protocolo publicado (ref 24).
Bastidor magnético MagneSphere	Promega	Z5342