Microfluidic Imaging Cytometría de flujo por Asimétrica de detección de tiempo de estiramiento Microscopía óptica (ATOM)

Resumen

Este protocolo describe la implementación de un sistema de microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica para la obtención de imágenes de una sola célula en el flujo microfluídico ultrarrápido y sus aplicaciones en citometría de flujo por imágenes.

Resumen

Escalar el número de parámetros medibles, lo que permite el análisis de datos multidimensionales y, por tanto, resultados estadísticos de mayor confianza, ha sido la principal tendencia en el desarrollo avanzado de la citometría de flujo. En particular, la adición de capacidades de imagen de alta resolución permite el análisis morfológico complejo de estructuras celulares / sub-celulares. Esto no es posible con citómetros de flujo estándar. Sin embargo, es valiosa para avanzar en nuestro conocimiento de las funciones celulares y puede beneficiar la investigación de las ciencias de la vida, el diagnóstico clínico y el monitoreo ambiental. La incorporación de capacidades de imagen en citometría de flujo compromete el rendimiento del análisis, principalmente debido a las limitaciones en la velocidad y sensibilidad en las tecnologías de cámara. Para superar este reto de velocidad o rendimiento enfrentado a la citometría de flujo de imágenes mientras se preserva la calidad de imagen, se ha demostrado que la microscopía óptica de estiramiento de tiempo de detección asimétrica (ATOM) permiteCon una resolución sub-celular, con una capacidad de procesamiento de imágenes de hasta 100.000 células / s. Basado en el concepto de imagen de imágenes de estiramiento de tiempo convencional, que se basa en la codificación y recuperación de toda la imagen óptica mediante el uso de pulsos de láser de banda ancha ultrarrápidos, ATOM avanza adicionalmente el rendimiento de imagen aumentando el contraste de imagen de células no etiquetadas / no teñidas. Esto se logra accediendo a la información de gradiente de fase de las células, que se codifica espectralmente en impulsos de banda ancha de un solo disparo. Por lo tanto, el ATOM es particularmente ventajoso en mediciones de alto rendimiento de la morfología de una sola célula y de la textura - información indicativa de tipos de células, estados e incluso funciones. En última instancia, esto podría convertirse en una potente plataforma de citometría de flujo de imágenes para el fenotipado biofísico de las células, que complementa el estado actual de la técnica bioquímica basada en marcador de ensayo celular. Este trabajo describe un protocolo para establecer los módulos clave de un sistema ATOM (desde el frontend óptico a los datos pRocessing y visualización backend), así como el flujo de trabajo de citometría de flujo de imagen basado en ATOM, utilizando células humanas y microalgas como ejemplos.

Introducción

La imagen óptica presenta una poderosa herramienta y un ensayo basado en células para visualizar (casi) de forma no invasiva la distribución espacial detallada de muchos componentes celulares / subcelulares, descubriendo así una multitud de firmas morfológicas, biofísicas y biomoléculas de células. Sin embargo, esta capacidad para extraer información de alto contenido de células individuales ha sido generalmente comprometida cuando una enorme y heterogénea población de células tuvo que ser investigado. Esto marca una compensación común en los ensayos basados ​​en células entre el rendimiento de medición y el contenido. Un ejemplo notable es que la adición de capacida....

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Preparación de la muestra (células adherentes, células MCF-7)
   1. Saque el plato de cultivo celular de la incubadora y drene el medio de cultivo.
   2. Enjuague las células en un plato con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el medio de cultivo excesivo.
   3. Añadir 3 ml de una solución de 0,25% de tripsina al plato de cultivo (diámetro de 100 mm) y ponerlo en una incubadora a 37ºC, 5% de CO ₂ durante 4 min.
      NOTA: La tripsina disuelve la proteína adhesiva de las células para que se separen del plato de cultivo.
   4. Compruebe si todas las células se ha....

Resultados

Este trabajo ilustra dos demostraciones de una sola célula de imágenes por ATOM: una con células de mamíferos (células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y células de cáncer de mama (MCF-7)) y otra con fitoplancton s (Scenedesmus y Chlamydomonas). El primer experimento fue motivado por el creciente interés en la biopsia líquida para la detección, enumeración y caracterización de células tumorales circulantes (CTC) en la sangre ²³ . L.......

Discusión

Hay varios detalles técnicos que requieren atención especial durante la configuración del sistema ATOM. En primer lugar, es esencial observar que la iluminación codificada espectralmente asimétrica / oblicua podría introducir componentes de gradiente de fase residual ( es decir, el efecto de sombreado) en el contraste de absorción e influir en el aumento del contraste de gradiente de fase en ATOM. Por lo tanto, este efecto de la iluminación oblicua debe ser minimizado. En segundo lugar, se debe enfatizar que el.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Objetivos de fisiología de fluorita Nikon Plan 40X	Lente de objetivo Nikon	MRF07420	Obj2)
Objetivo de fluorita Olympus Plan, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X	Olympus	RMS40X-PF	Lente de objetivo (Obj1)
N-BK7 Lentes plano-convexas	Thorlabs	LA1145-C	Para retransmisión de lluvia espectral
Paquete de colimación de fibra FC/APC	Thorlabs	F220APC-1064	Para la emisión y recolección de pulsos láser
Divisor de haz de película	Thorlabs	BP145B3	Para hacer réplica de haz
Espejo de plata protegido	Thorlabs	PF10-03-P01	Para luz reflectante
800-1650nm 12GHz monomodo DC-coupled NIR Photoreceiver	Newport	1544-B	Para convertir la luz en señal eléctrica
Osciloscopio	de alto rendimiento InfiniiumAgilent	DSOX91604A	Para guardar las señales eléctricas convertidas en luz
Fibra óptica HI1060	Corning	HI1060	Fibra óptica para estiramientos de tiempo
AMPLIFICADOR DE FIBRA DOPADA CON ITERBIO	Keopsys	KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA	Amplificador óptico en línea
Rejilla holográfica	Wasatch Photonics	020305-6	Rejilla
Jeringa de infusión/retirada Bombas	Harvard Apparatus	PHD 2000	Bomba de jeringa para la carga de muestras en canales microfluídicos