Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer y Swarmer

Resumen

Este protocolo permite la microscopía monocelular de los nadadores diferencialmente distintos de Vibrio parahaemolyticus y células swarmer. El método produce una población de células swarmer fácilmente disponibles para el análisis de células individuales y cubre la preparación de cultivos celulares, inducción de diferenciación de swarmer, preparación de muestras y análisis de imágenes.

Resumen

La capacidad de estudiar la localización intracelular de las proteínas es esencial para la comprensión de muchos procesos celulares. A su vez, esto requiere la capacidad de obtener células individuales para la microscopía de fluorescencia, lo que puede ser particularmente difícil cuando las células de imagen que existen dentro de las comunidades bacterianas. Por ejemplo, el patógeno humano Vibrio parahaemolyticus existe como células nadadoras en forma de varilla corta en condiciones líquidas que al contacto superficial se diferencian en una subpoblación de células swarmer altamente alargadas especializadas para el crecimiento en superficies sólidas. Este artículo presenta un método para realizar análisis de microscopía de fluorescencia de células individuales de V. parahaemolyticus en sus dos estados diferenciales. Este protocolo induce de forma muy reproducible la diferenciación de V. parahaemolyticus en un ciclo de vida de células más swarmer y facilita su proliferación sobre superficies sólidas. El método produce erupciones de células swarmer diferenciadas que se extienden desde tEl borde de la colonia de enjambre. Notablemente, en la punta de las llamaradas de enjambre, las células swarmer existen en una sola capa de células, lo que permite su fácil transferencia a una diapositiva de microscopio y posterior microscopía de fluorescencia de imágenes de células individuales. Además, se presenta el flujo de trabajo de análisis de imágenes para la representación demográfica de sociedades bacterianas. Como prueba de principio, se describe el análisis de la localización intracelular de las matrices de señalización de quimiotaxis en nadadores y células swarmer de V. parahaemolyticus.

Introducción

Las bacterias experimentan constantemente cambios en su entorno externo y han desarrollado varias técnicas para cambiar y adaptar su comportamiento en consecuencia. Uno de estos mecanismos implica la diferenciación en distintos tipos de células que mejor complementan el entorno alterado. La diferenciación suele implicar cambios importantes en la regulación del ciclo celular, la morfología celular y la organización espaciotemporal de las células. Un organismo que puede sufrir diferenciación es Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus pertenece a las Vibrionaceae , que es una familia de proteobacterias que habitualmente habitan agua dulc....

Protocolo

1. Preparación de células V. parahaemolyticus electro-competentes y electroporación de ADN de plásmido en células nadadoras

NOTA: La siguiente sección del protocolo permite la preparación de células electro-competentes y la posterior electroporación de ADN plasmídico en células nadadoras. Este paso es importante si las proteínas fluorescentes se expresan ectopicamente a partir de un plásmido.

1. Eliminar las células de V. parahaemolyticus de una mezcla de glicerol a -80 ° C sobre una placa de agar LB fresca que contiene 100 μg / ml de ampicilina e incubar durante la noche a 37 ° C.
2. Al ....

Resultados

Inducción de la diferenciación y generación de colonias enjambradas

La Figura 1 proporciona un esquema de los pasos importantes implicados en la producción de colonias de enjambre de V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Se observó un cultivo de nadador en agar enjambre y se incubó a 24 ^° C, induciendo una diferenciación y proliferación de swarmer sobre la superficie sólida de .......

Discusión

Este artículo presenta un método para la obtención de imágenes por microscopía de células de V. parahaemolyticus swarmer, seguido de análisis posteriores destinados a resolver y cuantificar la localización subcelular y otras características de las proteínas marcadas fluorescentemente. A pesar de que existen varias herramientas para el procesamiento y análisis de imágenes en microscopía ^{14 , 15 , 16 ,}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
medios fuertes
LB	Agar Roth	X968.3
granulado	BD	214510	Para la preparación de agar LB con medio LB
Agar de infusión cardíaca Difco	BD	244400	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Agarosa NEEO, ultra calidad	Roth	2267.3	Para la preparación de almohadillas de agarosa para microscopía
Nombre	>Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>Aditivos
L-arabinosa	Roth	5118.3	Utilizado para inducir derivados de pBAD
2,2'-Bipiridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Cloruro de calcio dihidratado	Roth	5239.1	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Sal de sodio de ampicilina	Roth	K029.3
Cloranfenicol	Roth	3886.3
Tampón PBS	:		receta estándar para solución salina
D(+) Sacarosa	Roth	4621.1	Para la preparación de células electrocompetentes
Glycerol	Roth	3783.5	Para la preparación de células electrocompetentes
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Hardware
Placa de Petri 150 mm x 20 mm con levas	Sarstedt	82.1184.500	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus-Utilizado		para el secado de placas de enjambre de agar HI
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Se utiliza para la elctroporación de plásmidos
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular	Devices-Utilizado	para el análisis de imágenes de microscopía
Excel		Microsoft-Utilizado	para el análisis de datos de microscopía

, tamponada con fosfato