Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de Vibrio parahaemolyticus Células Swimmer y Swarmer

Summary

Este protocolo permite la microscopía monocelular de los nadadores diferencialmente distintos de Vibrio parahaemolyticus y células swarmer. El método produce una población de células swarmer fácilmente disponibles para el análisis de células individuales y cubre la preparación de cultivos celulares, inducción de diferenciación de swarmer, preparación de muestras y análisis de imágenes.

Abstract

La capacidad de estudiar la localización intracelular de las proteínas es esencial para la comprensión de muchos procesos celulares. A su vez, esto requiere la capacidad de obtener células individuales para la microscopía de fluorescencia, lo que puede ser particularmente difícil cuando las células de imagen que existen dentro de las comunidades bacterianas. Por ejemplo, el patógeno humano Vibrio parahaemolyticus existe como células nadadoras en forma de varilla corta en condiciones líquidas que al contacto superficial se diferencian en una subpoblación de células swarmer altamente alargadas especializadas para el crecimiento en superficies sólidas. Este artículo presenta un método para realizar análisis de microscopía de fluorescencia de células individuales de V. parahaemolyticus en sus dos estados diferenciales. Este protocolo induce de forma muy reproducible la diferenciación de V. parahaemolyticus en un ciclo de vida de células más swarmer y facilita su proliferación sobre superficies sólidas. El método produce erupciones de células swarmer diferenciadas que se extienden desde tEl borde de la colonia de enjambre. Notablemente, en la punta de las llamaradas de enjambre, las células swarmer existen en una sola capa de células, lo que permite su fácil transferencia a una diapositiva de microscopio y posterior microscopía de fluorescencia de imágenes de células individuales. Además, se presenta el flujo de trabajo de análisis de imágenes para la representación demográfica de sociedades bacterianas. Como prueba de principio, se describe el análisis de la localización intracelular de las matrices de señalización de quimiotaxis en nadadores y células swarmer de V. parahaemolyticus.

Introduction

Las bacterias experimentan constantemente cambios en su entorno externo y han desarrollado varias técnicas para cambiar y adaptar su comportamiento en consecuencia. Uno de estos mecanismos implica la diferenciación en distintos tipos de células que mejor complementan el entorno alterado. La diferenciación suele implicar cambios importantes en la regulación del ciclo celular, la morfología celular y la organización espaciotemporal de las células. Un organismo que puede sufrir diferenciación es Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus pertenece a las Vibrionaceae , que es una familia de proteobacterias que habitualmente habitan agua dulce o salada. Las Vibrionaceae están ampliamente distribuidas en el medio ambiente e incluyen varias especies que causan infecciones del tracto intestinal en humanos, incluyendo también Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus es un organismo dimórfico y es capaz de diferenciarse en dos tipos de células diferentes como una respuesta para acomodar los cambios a suMedio externo. En ambientes acuosos, existe como una célula de nadador en forma de varilla corta con un único flagelo polar situado en el antiguo polo de la célula. Al contacto superficial, se inicia la diferenciación en una célula swarmer. La diferenciación de las células Swarmer implica dos cambios importantes: la morfogénesis de las células swarmer mediante la inhibición de la división celular y la inducción de un segundo sistema de flagelos. Esto da como resultado la formación de una célula swarmer peritricosa y altamente alargada en forma de varilla, que puede continuar con el estilo de vida del swarmer, donde los eventos de división dan como resultado células progenie swarmer, o alternativamente se diferencian de nuevo en células nadadoras.

Se ha informado que varios factores inducen o influyen en la diferenciación del swarmer. El estímulo primario parece ser impulsado por la mechanosensing donde V. parahaemolyticus utiliza el flagelo polar como un sensor táctil que detecta la inhibición de la rotación al contacto superficial, pero varios otros factores están involucrados comoPozo ¹ . En el laboratorio, la rotación del flagelo polar puede inhibirse artificialmente mediante la adición de fenamilo, que bloquea la rotación flagelar conducida por el canal de sodio, induciendo así la diferenciación del swarmer ² . Además, en un estudio anterior, Vibrio alginolyticus se indujo a enjambre en medio sólido cuando las células se propagan en medio de crecimiento en una placa de Petri sellado con cinta de plástico transparente. El papel de filtro saturado con álcali impidió el enjambre en estas condiciones, sugiriendo por lo tanto que uno o más ácidos volátiles podrían estar implicados en la inducción del enjambre. Por lo tanto, el sellado de la placa de Petri con cinta plástica permitió probablemente la acumulación de ácidos volátiles, formados como subproductos del metabolismo celular, dentro del espacio de cabeza de la placa. El mismo efecto se consiguió cuando se añadió H2O2 al medio de crecimiento en placas de Petri no selladas con el fin de producir artificialmente ácidos volátiles por hidrolización de componentes de medios 3 ^{, 4 , 5} . Sin embargo, la identidad de tales ácidos volátiles permanece desconocida. Además, se ha demostrado que la disponibilidad excesiva de calcio ⁶ y limitación de hierro ⁷ mejoran tanto la diferenciación y proliferación de swarmer sobre superficies sólidas. Las células se pueden privar de hierro añadiendo el compuesto 2,2'-bipiridilo al medio de crecimiento, que se ha demostrado que influyen en la diferenciación swarmer [ ^8] . Los factores conocidos para regular la diferenciación se implementan ahora en el diseño de un protocolo que induce reproduciblemente la diferenciación de V. parahaemolyticus en células swarmer y su proliferación en superficies sólidas de agar.

La diferenciación de V. parahaemolyticus implica cambios importantes en la regulación de la división celular, morfología celular y el posicionamiento de máquinas macromoleculares como flagellA y quimiotaxis - procesos que requieren la localización específica de proteínas de acuerdo con el ciclo celular. Por lo tanto, la capacidad para estudiar la localización intracelular de tales proteínas es esencial para la comprensión de los procesos celulares antes mencionados. Para llevar a cabo tales estudios se requiere microscopía de fluorescencia en células individuales. Esto puede ser particularmente difícil cuando las células de imágenes que existen dentro de densas poblaciones bacterianas, como es el caso de las células swarmer. Ha habido intentos de inducir la diferenciación de swarmer en medios líquidos, que podrían generar células individuales para estudios de microscopía. Y aunque a nivel transcripcional estas células han inducido parcialmente el programa de diferenciación swarmer, no sufren los mismos cambios morfológicos distintos que las células swarmer completamente diferenciadas cultivadas en medio sólido ⁸ . Este documento ofrece un protocolo robusto y reproducible de un método para inducir ceLl en una superficie de agar. El protocolo produce una población de células swarmer de fácil acceso fácilmente disponibles para microscopía de célula única y análisis subsiguiente. Además, el protocolo permite estudios de localización de proteínas marcadas fluorescentemente tanto en el nadador como en el swarmer cell-types (secciones 1, 2, 3, 4). Además, el protocolo describe el flujo de trabajo subsecuente sobre cómo procesar y analizar los datos generados a partir de experimentos de microscopía de fluorescencia, lo que permite el análisis demográfico de las sociedades bacterianas (sección 5).

Protocol

1. Preparación de células V. parahaemolyticus electro-competentes y electroporación de ADN de plásmido en células nadadoras

NOTA: La siguiente sección del protocolo permite la preparación de células electro-competentes y la posterior electroporación de ADN plasmídico en células nadadoras. Este paso es importante si las proteínas fluorescentes se expresan ectopicamente a partir de un plásmido.

1. Eliminar las células de V. parahaemolyticus de una mezcla de glicerol a -80 ° C sobre una placa de agar LB fresca que contiene 100 μg / ml de ampicilina e incubar durante la noche a 37 ° C.
2. Al día siguiente, inocular 200 ml de medio LB con una única colonia de V. parahaemolyticus e incubar a 37 ° C en condiciones de agitación hasta alcanzar una DO $ ₆ $ de 1,0. Por lo general toma 5-6 h de incubación para que el cultivo celular alcance la densidad óptica deseada.
3. Inmediatamente transferir las células sobre hielo y perfOrm todos los pasos adicionales en hielo y en centrifugadoras pre-enfriadas de 4 ° C.
4. Cosechar las células a 4 ° C durante 10 min a 2.000 x g.
5. Desechar el sobrenadante por decantación y volver a suspender el sedimento celular en 25 ml de solución de sacarosa 273 mM enfriada con hielo (pH 7,4, tamponada con KOH).
6. Cosechar las células de nuevo a 4 ° C durante 10 min a 2000 x g. Repetir dos veces más.
7. Se vuelve a suspender el sedimento de células lavadas en 400 μl de solución de sacarosa 273 mM enfriada con hielo. A continuación, añadir glicerol hasta una concentración final de 15% vol / vol. Las células están listas para la electroporación, pero también pueden congelarse en alícuotas de 70 μL a -80 ° C para su uso posterior.
8. Para la electroporación, mezcle una alícuota de 70 μL de células electro-competentes con 100 - 1.000 ng de ADN plasmídico y transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación helada (0,2 cm de separación de electrodos). Realizar la electroporación con los siguientes ajustes: 25 μF, 2400 V y 200 Ω.
9. Suspender elEn la cubeta de electroporación en 600 μL de caldo LB, se transfiere a un tubo de 2 ml y se incuba mientras se agita a 37 ° C durante 3 h.
10. Girar las células a 2.000 xg durante 5 min y volver a suspender el pellet en 100 μ l de caldo LB. Se extiende la suspensión de células sobre placas de agar LB selectivas que contienen los antibióticos necesarios e incuba a 37 ° C durante la noche.
11. Al día siguiente, revise las placas para la formación de colonias. Las colonias que crecen llevan el gen de resistencia a antibióticos correcto codificado en el plásmido y ahora pueden usarse para experimentos adicionales.

2. Inducción de la diferenciación de células Swarmer

NOTA: Los siguientes pasos describen cómo inducir la diferenciación de V. parahaemolyticus en su ciclo de vida celular swarmer y cómo estimular la proliferación en superficies sólidas.

1. Suspender 4 g de infusión de corazón (HI) Agar en 100 ml ddH ₂ O con el fin de preparar las placas enjambre.
2. Hervir cuidadosamente la solución de agar HI en el microondas y agitar la botella de vez en cuando hasta que el polvo se disuelva. Autoclave a 121 ° C durante 20 min.
3. Después de esterilizar en autoclave, enfriar el agar HI hasta 60-65 ° C. Añadir 2,2'-bipiridilo hasta una concentración final de 50 μM (solución madre de 50 mM en etanol al 100%). Se añade CaCl _$ ₂ _$ a una concentración final de 4 mM (solución madre de 4 M en ddH _$ ₂ _$ O). Si es necesario, agregue antibióticos en la solución para mantener los plásmidos.
   NOTA: Si planea usar un plásmido inducible, agregue el agente inductor a su concentración final.
   PRECAUCIÓN: 2,2'-Bipiridilo: Toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación). Use guantes y gafas de seguridad cuando maneje este producto químico.
4. Verter 30 - 35 mL de la solución de agar HI final en una placa de Petri redonda de 150 mm y dejar solidificar el agar.
5. Justo antes de detectar el cultivo celular, se seca la placa de agar a 37 ° C durante al menos 10 minutos (o hasta que cualquier residuo líquido tenga disaPpeared, pero no más) arriba-derecha con una tapa abierta.
   NOTA: Los tiempos de secado dependen en gran medida de la incubadora utilizada y las placas muy secas no permitirán el enjambre de V. parahaemolyticus . (Este paso es muy importante!) Las placas se deben usar frescas y no deben ser mayores de 2 - 3 h. Los viejos platos estarán demasiado secos para estimular el enjambre.
6. Inocular una pequeña cantidad de células desde el borde de una sola colonia en 5 mL de caldo LB. Incubar el cultivo agitando a 37 ° C hasta alcanzar OD ₆₀₀ = 0,8, normalmente toma alrededor de 2-3 horas. Después de eso, las células están listas para ser manchadas sobre placas de agar enjambre HI.
7. Poner 1 μl de cultivo celular en el centro de una placa de enjambre de agar HI ( Figura 1A ).
8. Deje secar el punto ( Figura 1B ).
9. Selle la placa con cinta de plástico transparente y asegúrese de que está firmemente unida, de lo contrario podría desprenderse durante la incubación durante la noche ( Figura 1C ).
   NOTA: EsMuy importante que el sello sea perfecto. Evite la formación de burbujas de aire y pliegues en la cinta cuando se aplica.
10. Incubar la placa a 24 ° C durante la noche. Esto dará como resultado la formación de una colonia de enjambre de V. parahaemolyticus con estelas de enjambre que se extienden desde la periferia de la colonia de enjambre ( Figura 2 ).

3. Preparación de V. parahaemolyticus Swarmer Cells for Fluorescence Microscopy

NOTA: El siguiente protocolo describe cómo preparar los portaobjetos de microscopía de agarosa y la subsiguiente impresión de bengalas en un cojín de agarosa para obtener células de swarmer individuales para microscopía.

1. Para preparar láminas de agarosa para microscopía, añadir 1 g de agarosa a 100 ml de una solución de PBS al 20% vol / vol y 10% vol / vol. Hervir cuidadosamente la solución en el microondas para disolver la agarosa y dejar que se enfríe a 65-70 ° C mientras se mezcla con un agitador magnético.
2. Lugar acMagra del microscopio sobre una sección perfectamente nivel de un banco de trabajo. Cubra los dos extremos de la diapositiva con dos capas de cinta de etiquetado de laboratorio para uso general, fijando la corredera al banco de trabajo. La distancia entre las dos piezas de cinta debe ser alrededor de 3 cm.
   NOTA: Las dos capas de cinta crean una elevación muy pequeña, que determinará la altura de la almohadilla de agarosa. Es importante que el espacio de trabajo esté nivelado para asegurarse de que las células estarán en el mismo plano para el análisis de microscopía.
3. Pipetear ~ 250 μL de la solución de agarosa previamente preparada sobre la superficie de vidrio no cubierta.
4. Ahora coloque una segunda diapositiva del microscopio en la misma orientación que la inferior en la parte superior y presione ligeramente hacia abajo, de modo que la agarosa residual pueda fluir hacia los lados.
5. Deje que la agarosa se solidifique 1-2 min y luego tire lentamente de la parte superior de la diapositiva de vidrio superior en un movimiento horizontal.
6. Usando un bisturí, corte cualquier agarosa residual que esté unida a laLados de la diapositiva del microscopio y retire lentamente la cinta de los extremos de la diapositiva del microscopio.
   NOTA: El portaobjetos de agarosa ya está listo y debe utilizarse lo antes posible ya que lentamente comenzará a secarse.
7. Para realizar la microscopía en las células swarmer, cortar un pedazo de ~ 3 mm x 10 mm de agar swarming desde el borde más exterior de una colonia enjambre ( Figura 1D ). Es muy importante no romper el sello de cinta de la placa de enjambre hasta inmediatamente antes de la transferencia de células de swarmer a la diapositiva del microscopio. Una vez que se retira la cinta, las células de V. parahaemolyticus injertan la diferenciación en las células del nadador.
   NOTA: Asegúrese de dirigir los cortes desde el exterior del borde de la colonia de enjambre hasta el interior de la colonia ( Figura 1D ). De esta manera se puede prevenir la "contaminación del nadador" en el borde de la colonia enjambre.
8. Transferir el trozo de agar enjambre sobre un portaobjetos de microscopio de agarosa con las células frente a la agarosa paD ( Figura 1E ). Esto imprime las células enjambre sobre la almohadilla de agarosa.
9. Después de esperar ~ 30 s, retire la pieza de agar cuidadosamente de la almohadilla de agarosa ( Figura 1F ).
10. Coloque un cubreobjetos de vidrio sobre la almohadilla de agarosa donde las células fueron impresas. Las células están listas para la microscopía.
    NOTA: Es importante imaginar células swarmer inmediatamente, ya que las células swarmer lentamente iniciar la diferenciación al nadador estado.

4. Preparación de los cultivos celulares del nadador V. parahaemolyticus para la microscopía de fluorescencia

NOTA: Esta sección del protocolo describe cómo preparar un cultivo de V. parahaemolyticus para realizar la microscopía de fluorescencia en el tipo de célula nadadora.

1. Inocular una pequeña cantidad de células desde el borde de una sola colonia en 5 mL de caldo LB. Incubar el cultivo agitando a 37 ° C durante 1 h o hasta que se haga visible un ligero crecimiento celular.
2. AEsta etapa, si es necesario, añade un agente inductor para la expresión de proteínas de interés. En este ejemplo, se añadió L-arabinosa a una concentración final de 0,2% (p / vol) con el fin de inducir la expresión de YFP-CheW9.
3. Incubar el cultivo agitando durante 2 h adicionales a 37 ° C.
4. Siga los pasos 3.1-3.7 para preparar diapositivas de microscopia de agarosa.
5. Poner 1 μl de cultivo celular en el centro de la almohadilla de agarosa y dejar que el punto incube hasta que esté seco.
6. Coloque un cubreobjetos de vidrio sobre la almohadilla de agarosa donde las células fueron manchadas. Las células están ahora listas para ser visualizadas bajo el microscopio de fluorescencia.

5. Análisis de imágenes

Esta parte del protocolo describe un flujo de trabajo para el análisis de imágenes, en particular cómo extraer los datos de fluorescencia de células individuales para el análisis demográfico.

1. Antes de comenzar el análisis de imagen asegúrese de que todas las imágenes de microscopía se guardan en formato TIF de 16 bits.
2. Cargue el DIC (o contraste de fase) y las correspondientes imágenes de canal fluorescente en el software.
3. Genere una imagen de superposición de ambos canales seleccionando "Imágenes de visualización / superposición". Ajuste el número de imágenes ("# Imágenes:") a dos y seleccione la imagen DIC en el primer canal y la imagen fluorescente en el segundo canal.
4. Seleccione la herramienta "Multi-Line" de la barra de herramientas y marque las celdas de un polo a otro a través de la mitad de la celda. Para obtener una lista de todas las líneas generadas (objetos de línea) abra "Measure / Region Measurements". Configure las mediciones de región para mostrar sólo la etiqueta de región, la distancia y la intensidad media.
5. Calibre el tamaño de píxel en "Medir / Calibrar Distancias" al tamaño de píxel que es específico para su configuración de microscopio y haga clic en "Aplicar a todas las imágenes abiertas".
6. Transfiera todas las regiones (objetos de línea) a la imagen del canal fluorescente. En "Regiones / TransfSeleccione "Todas las regiones" y pulse "OK" para seleccionar la imagen de origen (la imagen de superposición) y la imagen de destino (la imagen del canal fluorescente).
   NOTA: Para poder volver a producir las líneas exactas (objetos de línea, regiones, ROI), abra "Regiones / Guardar regiones" y guarde las regiones.
7. Exporte todas las mediciones de región en una hoja de cálculo abriendo "Measure / Region Measurements" y presionando "Open Log". Confirme para abrir y exportar los datos. Una vez que la hoja de cálculo se abre en segundo plano, finalmente exportar los datos presionando "F9: Datos de registro".
8. Para determinar la posición de los focos fluorescentes a lo largo de la celda, abra "Measure / Linescan". Establezca "Linescan Width" en un valor para que el ancho total de una celda esté cubierto por la región que creó anteriormente. Haga clic con el botón derecho en el gráfico de barrido de línea y seleccione "Mostrar datos de gráfico". Haciendo clic con el botón izquierdo del ratón y arrastrando el cursor del ratón a lo largo delPunto de interés, la ventana "Graph Data" mostrará el pixel / distancia correspondiente entre los dos puntos. Seleccione la fila azul resaltada y luego copie el contenido.
   NOTA: Todo el perfil de intensidad de exploración de línea se puede registrar en una hoja de cálculo presionando "Datos de registro" en la ventana "Linescan". Los datos extraídos pueden ahora ser utilizados para la visualización en gráficos o análisis estadísticos adicionales. Los patrones de localización sobre el ciclo celular pueden visualizarse fácilmente en una representación demográfica de la longitud de la célula y de las intensidades fluorescentes a lo largo del cuerpo celular. Estas representaciones se pueden obtener utilizando los mismos ROI previamente seleccionados. Los siguientes pasos darán un ejemplo de cómo generar datos demográficos similares a los mostrados en las Figuras 3C y 4C .
   1. En las marcas de región de carga de Fiji / ImageJ (.rgn) creadas anteriormente en el software (paso 5.6) utilizando el "importador de archivos Metamorph nd & ROI"Unesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org Alternativamente, las regiones de interés (ROIs) de las células a analizar pueden crearse directamente en Fiji / ImageJ utilizando la herramienta "Segmented Line" incorporada.
   2. Abra "Analyze / Tools / ROI manager" y marque todas las entradas de la lista activa ".
   3. Después, haga clic en "More / Multi Plot" y luego seleccione "List" en la nueva ventana "Multi Plot". Haga clic en una entrada de tabla, luego seleccione y "copiar todo". Posteriormente, pegue en una nueva hoja de cálculo.
      NOTA: Asegúrese de que los datos de la celda más larga (dos columnas X e Y correspondientes con el mayor número de filas) sean los últimos de la derecha en la hoja de cálculo.
   4. Guarde la hoja de cálculo como "CSV (delimitado por comas) (* .csv)".
   5. Descargue los scripts R desde aquí "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" ^10. Los scripts ordenan las celdas por longitud y normalizan los perfiles de intensidad fluorescente de todas las celdas como un promedio de fluorescenc de cada celdami.
   6. Ejecute el script completo "cell profiles function.R" en R [versión 3.0.1; ¹¹ ].
   7. Edite el script "ejemplo plots.R" en la línea 30 de manera que la ruta del archivo se refiera a la carpeta donde se guarda el archivo .csv generado anteriormente. Además, cambie el nombre de archivo "profile.csv" en la línea 31 al nombre de archivo elegido para el archivo .csv generado en el paso 5.9.4. Después, ejecute "parcelas de ejemplo.R" y siga la documentación de "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles", así como los comentarios del archivo de script para generar análisis demográficos.

Results

Inducción de la diferenciación y generación de colonias enjambradas

La Figura 1 proporciona un esquema de los pasos importantes implicados en la producción de colonias de enjambre de V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Se observó un cultivo de nadador en agar enjambre y se incubó a 24 ^° C, induciendo una diferenciación y proliferación de swarmer sobre la superficie sólida de ...

Discussion

Este artículo presenta un método para la obtención de imágenes por microscopía de células de V. parahaemolyticus swarmer, seguido de análisis posteriores destinados a resolver y cuantificar la localización subcelular y otras características de las proteínas marcadas fluorescentemente. A pesar de que existen varias herramientas para el procesamiento y análisis de imágenes en microscopía ^{14 , 15 , 16 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
medios fuertes
LB	Agar Roth	X968.3
granulado	BD	214510	Para la preparación de agar LB con medio LB
Agar de infusión cardíaca Difco	BD	244400	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Agarosa NEEO, ultra calidad	Roth	2267.3	Para la preparación de almohadillas de agarosa para microscopía
Nombre	>Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>Aditivos
L-arabinosa	Roth	5118.3	Utilizado para inducir derivados de pBAD
2,2'-Bipiridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Cloruro de calcio dihidratado	Roth	5239.1	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Sal de sodio de ampicilina	Roth	K029.3
Cloranfenicol	Roth	3886.3
Tampón PBS	:		receta estándar para solución salina
D(+) Sacarosa	Roth	4621.1	Para la preparación de células electrocompetentes
Glycerol	Roth	3783.5	Para la preparación de células electrocompetentes
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Hardware
Placa de Petri 150 mm x 20 mm con levas	Sarstedt	82.1184.500	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus-Utilizado		para el secado de placas de enjambre de agar HI
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Se utiliza para la elctroporación de plásmidos
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular	Devices-Utilizado	para el análisis de imágenes de microscopía
Excel		Microsoft-Utilizado	para el análisis de datos de microscopía