Artículo de método

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

DOI:

10.3791/55848

⸱

10 de enero de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 3School of Biomedical Engineering, Drexel University, 4Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 5Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurotrauma y neurodegenerative de la enfermedad a menudo resultan en duradero déficit neurológico debido a la limitada capacidad del sistema nervioso central (SNC) para reemplazar las neuronas perdidas y regenerar caminos axonales. Sin embargo, durante el desarrollo del sistema nervioso, la migración neuronal y la extensión axonal ocurren a menudo por caminos formados por otras células, conocido como "andamios de vida". Buscando emular estos mecanismos y diseñar una estrategia que evita el entorno inhibidor del SNC, este manuscrito presenta un protocolo para fabricar ingeniería tisular basada en astrositos "andamios de vida". Para crear estas construcciones, se empleó un esquema protector de nuevo biomaterial inducir astrocitos uno mismo-montar en densos paquetes tridimensionales de somata bipolar alineados longitudinalmente y procesos. Hidrogel en primer lugar, hueco micro-columnas estaban reunidos, y la luz interior estaba recubierta con matriz extracelular colágeno. Astrocitos corticales cerebrales disociados luego fueron entregados en el lumen de la micro-columna cilíndrica y un diámetro interior crítico de < 350 μm, espontáneamente auto alineado y contratado para producir largas de fibra como cables consisten en paquetes densos de los procesos de astrositos y fibrillas de colágeno de medición < 150 μm de diámetro pero que se extiende varios centímetros de longitud. Estos diseñado andamios vida exhibió > 97% viabilidad celular y eran casi exclusivamente compuesta por astrocitos expresan una combinación del filamento intermedio proteínas glial fibrilar proteína ácida (GFAP), vimentina y nestin. Estos alinean astrositos redes fueron encontradas para proporcionar un substrato permisivo para conexión neuronal y alineación la extensión del neurite. Por otra parte, estas construcciones mantienen integridad y alineación cuando extrae del protector de hidrogel, haciéndolas adecuadas para la implantación de la CNS. Estas construcciones preformadas estructuralmente emulan citoarquitectónica clave elementos de origen natural basada en glial "andamios de vida" en vivo. Como tal, estos andamios de ingeniería de la vida pueden servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico en vitro o facilitar la Neurorregeneración dirigiendo la migración neuronal y axonal pathfinding tras degeneración CNS en vivo .

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistema nervioso central (SNC) tiene una capacidad limitada para contrarrestar la pérdida o disfunción de las neuronas y vías axonales que acompañan las condiciones tales como lesión cerebral traumática (TBI), movimiento, médula espinal lesión (SCI) y neurodegenerative enfermedad1 ,2,3,4,5. Neurogénesis en el SNC se limita a un número limitado de áreas en el cerebro, dificultando la restauración de las neuronas perdidas6,7. Además, la regeneración de caminos perdidas axonales en el SNC es insuficiente debido a la falta de orientación dirigida, la presencia de inhibidores de la consecuencia y astrogliosis reactiva después de daño al tejido neural2,8, 9,10. Los astrocitos tienen diversas funciones para ayudar a las neuronas con la homeostasis de iones, separación de neurotransmisores, formación de sinapsis y neurovasculares acoplamiento11. Sin embargo, siguiendo incluso leves daños de tejido neural, astrocytes pueden sufrir cambios moleculares, estructurales y funcionales en su transición a un estado hipertrófico11. En respuesta al neurotrauma grave, estos cambios resultan en la formación de una cicatriz con una penumbra que contienen astrocitos reactivos migrando y un núcleo de la lesión que incluye leucocitos se filtró desde el rota barrera blood - brain (BBB), microglia, oligodendrocitos y fibroblastos11,12,13. Estos astrocitos reactivos logran una morfología de procesos filamentosos, desorganizados y presentan aumento de la expresión de proteínas de filamentos intermediarios y proteoglicanos de sulfato del chondroitin (CSPGs), que impiden la regeneración de los nervios12. A pesar de la cicatriz glial inicialmente ayuda a restaurar la integridad de la BBB y evitar la transmisión de la respuesta inflamatoria al tejido sano circundante, sirve como una barrera física y bioquímica contra axon regeneración12,14 ,15,16. Por ejemplo, axones que encuentran la cicatriz glial mostrar los conos de crecimiento distrófico con bulbo y retraso de crecimiento12. Además, la desorganización de los procesos astrocytic después de la lesión impide la extensión de regenerar axones17. El resultado de estas características inhibitorias se manifiesta en las debilitaciones físicas y neurológicas a menudo permanente que los pacientes sufren después de neurotrauma grave, incluyendo TBI y la médula espinal.

Independientemente de los retos extrínsecos de regeneración funcional en el SNC, axones han demostrado poseer una capacidad intrínseca de regeneración. Por ejemplo, la naturaleza dinámica de los conos de crecimiento distrófico en contacto con la cicatriz glial sugiere que estas terminaciones conservan su capacidad para ampliar a12. En consecuencia, se cree que un obstáculo principal para el crecimiento axonal es el entorno inhibidor del SNC después de la lesión y proporciona un ambiente más permisivo a través de reducción de la cicatrización glial o proporcionar puentes regenerativas a través de la cicatriz sería ventajoso. De hecho, estudios anteriores han demostrado que las neuronas de la CNS fueron capaces de extender axones a través de una lesión mediante injertos de nervios periféricos como puentes, que presentan un entorno más favorable para la regeneración de axón12,18, 19. Varias otras estrategias han sido llevadas a cabo para explotar esta capacidad regenerativa vestigial. Por ejemplo, manipulación de vías de señalización de crecimiento celular en varios modelos de lesión ha dado lugar a la regeneración axonal y disminución de cicatriz glial10,20,21. Además, los estudios han demostrado que el tratamiento con Condroitinasa ABC, que hiende la mayoría de las cadenas de azúcar en CSPGs, disminuye el efecto inhibitorio de CSPGs segregada por los astrocitos reactivos22. A pesar de alentador resultados, estos métodos no proporcionan dirigida orientación de conos de crecimiento, que potencialmente puede resultar en la regeneración aberrante12y también no tienen en cuenta para la pérdida de neuronas. Enfoques basados en la célula se han utilizado en tentativas de superar los efectos de la cicatriz glial y para reponer las células perdidas, particularmente de las neuronas. Algunos grupos han dedifferentiated astrocitos reactivos en las neuronas, mientras que otros han trasplantado células progenitoras neurales en lesiones CNS para repoblar la zona de lesión y promover axon regeneración23,24, 25. sin embargo, la célula de vástago trasplante solo está limitado por las tasas de supervivencia bajas, pobre integración y retención modesta en el tejido dañado5. Además, estas estrategias basadas en células incapaces de restaurar zonas interurbana axonal, especialmente en forma controlada. Por lo tanto, biomateriales en combinación con otros enfoques se están estudiando como vectores para varios nervios y factores de crecimiento y células progenitoras26. Enfoques basados en el biomaterial cuentan con un alto grado de control del diseño para producir construcciones que imitan a la haptotaxic física, específica, y chemotaxic señales presentan en el microambiente (3D) tridimensional del destino anfitrión tejido27, 28,29,30,31,32,33,34. Reproducción de estas señales ambientales es de suma importancia para las células trasplantadas presentar nativo-como morfología, proliferación, migración y señalización, entre otras características neurobiológicas29. A pesar de estas propiedades ventajosas, avance más allá de la tradicional células sembradas biomaterial andamios es necesario simultáneamente promover la regeneración axonal larga distancia dirigida y reemplazar las neuronas perdidas.

Un prometedor enfoque alternativo se basa en el tejido neural ingeniería "andamios de vida", que son distintos de otros enfoques basados en la célula debido a la presencia de células neuronales vivas con una Citoarquitectura preformado que emula neuroanatomía nativa o desarrollo mecanismos que faciliten la sustitución específica, reconstrucción y regeneración de los circuitos neuronales4,35. Consideraciones para el diseño de matrices de soporte de vida incluyen los fenotipos y las fuentes de las células neuronales, así como las propiedades físico mecánicas y las señales bioquímicas dictaron por la composición de cualquier adjunto de biomateriales35. Después de la fabricación en vitro, estos andamios de vida pueden ser implantados en vivo quimiotácticos y moléculas de adhesión celular presentes y neurotróficos señales para regular activamente migración de células neuronales y consecuencia del axón dependiendo del estado y progresión de procesos regenerativos35. Las células gliales pueden servir como base para la ingeniería Citoarquitectura de andamios de la vida ya que estas células median varios mecanismos del desarrollo en vivo. Durante el desarrollo del cerebro, las neuronas nuevas dependen de procesos basals extendidos por glia radial desde la zona ventricular hacia la placa cortical en vías de desarrollo como andamios de vida migración dirigida36,37. Además, extender crecimiento conos son muestra a orientarse detectando señales atractivas y repulsivo provocadas por las células gliales hito y supuesto "pioneras" axones son sugeridas para alcanzar los objetivos correctos por que se extiende a lo largo de los estampados glial Andamios de38,35,39. Así, las células gliales son necesarias para la dirección del pionero axons, que luego sirven como base de axon "andamios de vida" para dirigir la proyección de axones "seguidor". Por otra parte, mecanismos de crecimiento mediada por la glía han demostrado persistencia postnatal, como neuroblastos siguen la corriente migratoria rostral (RMS) para poder navegar desde la zona subventricular (SVZ), una de las pocas áreas restantes de la neurogénesis en el cerebro adulto, la bulbo olfatorio (OB)40. Estos neuroblastos en el RMS migran dentro del tubo de glial (figura 1A-1), que se compone de procesos astrocytic alineadas longitudinalmente, mediante adhesiones célula-célula directa y localizada de factores solubles37, 41. por último, mientras que el daño del CNS en causas de mamíferos interrumpió arreglo astrocytic proceso formando una cicatriz glial que físicamente impide la regeneración axonal17, muchos sistemas no mamíferos carecen de la formación de una cicatriz glial perjudicial. Más bien, las células gliales de las especies de animales no mamíferos mantienen más organizado, alineados los patrones que se utilizan como guías a través de la región lesionada17,42,43. Por ejemplo, en modelos de animales no mamíferos SCI, se muestran axones que crecen en estrecha asociación con puentes gliales cruzar la lesión, lo que sugiere un papel importante para andamios gliales organizados como sustratos facilitando la regeneración axonal y recuperación funcional ( Figura 1A -2) 42 , 44 , 45. recapitulación de las características neuroanatómicas y los mecanismos del desarrollo/regenerativa descritos anteriormente puede producir una nueva clase de andamios de ingeniería vida glial base que puede conducir al mismo tiempo la migración neuronal inmadura y axonal pathfinding a través de entornos no permisiva, de tal modo potencialmente mitigar los efectos de neuronal y degeneración de la zona de axón asociado a enfermedad y lesión del CNS.

Nuestro grupo de investigación previamente ha diseñado varios tipos de matrices de soporte de vida para la reconstrucción y regeneración del tracto axonal en el SNC y sistema nervioso periférico (SNP) a través de micro-tejido ingeniería de redes neuronales (micro-adolescentes) y tejido Ingeniería injertos del nervio (TENGs), respectivamente27,46,47,48. Ambas estrategias están basados inherentemente en biomimética. Micro-adolescentes son estructuras anatómicamente inspiración estructural y funcionalmente sustituye extensiones axonales conectar distintas poblaciones neuronales del cerebro. TENGs explotan el mecanismo del desarrollo de la regeneración axonal facilitado por axon, ejemplificado por el crecimiento del axon de "seguidor" a lo largo de axones de "pionero", para lograr la regeneración axonal de host destino35,46,48. Nos recientemente aprovechó la versatilidad de la matriz de soporte de vida técnica mediante un esquema similar de protector como micro-adolescentes y buscando inspiración en los mecanismos basados en la glia presentes en todo el desarrollo. Aquí, hemos desarrollado construcciones consisten en paquetes astrocytic alineados que atraviesan el lumen colagenoso de una micro columna de hidrogel49. Estos andamios vida astrocíticos son desarrollados por el primer llenado de un conjunto de agujas de acupuntura de tubo capilar con agarosa líquida para crear un hidrogel cilíndrico hueco con un diámetro exterior (OD) y diámetro interno (ID) correspondiente a los diámetros de la tubo y aguja, respectivamente. Gelificación de agarosa y extracción de la hidrogel micro-columna de tubo capilar, el hueco interior es revestido con tipo y colágeno para suministrar un entorno permisivo para la adherencia de astrositos y alineado paquete formación (figura 1B -1). Luego, la luz es sembrada con astrocitos corticales cerebrales aislados de crías de rata postnatal (figura 1B-2). Contrariamente a las técnicas bidimensionales (2D) alineación que se basan en la aplicación de campos eléctricos, micropatterned surcos y matriz extracelular proteína (ECM) patrones, alineación de astrositos en el andamio de la vida técnica depende de uno mismo-Asamblea de acuerdo a las variables controlables como curvatura de sustrato (columna ID), la densidad celular y la concentración de colágeno50,51,52. Los astrocitos contratan y remodelan el colágeno y adquieran una morfología bipolar, alineados longitudinalmente análoga a las matrices de soporte naturales en vivo (figura 1B-3). De hecho, estamos persiguiendo activamente el uso de estas estructuras de cable como sustratos físicos específicos guía de migración de las neuronas inmaduras, así como facilitar la regeneración axonal a través del ambiente desfavorable del SNC dañado, particularmente la cicatriz glial mamífera (figura 1). Este artículo se presenta el método de fabricación detallado para las columnas de micro astrocytic, fase imágenes de contraste, inmunofluorescencia y de la Citoarquitectura esperado y una amplia discusión sobre las limitaciones actuales y direcciones futuras de la técnica.

figure-introduction-1
Figura 1: inspiración, protocolo de fabricación y aplicaciones propuestos para las redes Astrocytic alineadas. (A) inspiración neurobiológica: neuroblastos (1) origina la neurogénica zona subventricular (SVZ) utilizan el tubo glial longitudinalmente alineado en la corriente migratoria rostral (RMS) para la migración dirigida hacia el bulbo olfatorio (OB); (2) no de mamíferos como peces y anfibios pueden sostener la regeneración después de tejido neural dañar en parte debido a la formación de un puente glial que conecta los extremos de una lesión (por ejemplo médula espinal transected) y sirve como un andamio para la dirección de regeneración de axones. (B) Resumen de fabricación: (1) construcción de una micro columna hidrogel de tamaño micrométrico, hueco con recubierta de ECM, la luz de la (2) siembra de astrocitos corticales primarios aislados de crías de rata postnatal, (3) uno mismo-Asamblea de longitudinalmente orientados paquetes en la cultura y (4) extracción del paquete del encasement del biomaterial para estudios de implantación futura. (C) In vivo usos: (1) estos andamios de vida pueden servir como tubos gliales ingeniería para la migración de la neurona dirigida de centros neurogénicas a repoblar las regiones deficientes en neurona; (2) Resumen del mecanismo del desarrollo de pioneras orientación axón y el mecanismo regenerativo de puentes gliales en los mamíferos no puede dotar a estos andamios astrocytic con capacidad de dirigir la regeneración del axón a través de la no-permisivo medio ambiente de la cicatriz glial mamífera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y comités de uso en la Universidad de Pennsylvania y el centro médico de Michael J. Crescenz veteranos asuntos y adheridos a las directrices establecidas en la Directiva de servicio de salud pública de NIH en humano Uso y cuidado de animales de laboratorio (2015).

1. desarrollo de las Micro hidrogel-columnas de agarosa

  1. Pesar 3 g de agarosa y transferirla a un vaso de precipitados estéril que contiene 100 mL de solución salina amortiguadora de fosfatos de Dulbecco (DPBS) para hacer una solución de agarosa al 3% peso/volumen (p/v). Añadir una barra magnética estéril en el vaso y colóquelo en la superficie de una parrilla caliente/agitador. Mantener el recipiente cubierto para evitar la evaporación de su contenido en el siguiente paso.
  2. La agarosa y la DPBS a una temperatura de 100 ° C de calor y revuelva en 60-120 rpm. Ajustar estas opciones según sea necesario y controlar permanentemente el avance del proceso de disolución como la solución inicialmente cambia de opaco a un claro aspecto que significa que la agarosa se ha disuelto completamente.
    PRECAUCIÓN: El vaso caliente y la solución están calientes!
  3. Como la solución de agarosa se calienta y agita, recuperar cuatro placas de Petri vacías de 10 cm y añadir 20 mL de DPBS a dos de ellos. Colocar agujas de acupuntura (diámetro: 300 μm, longitud: 40 mm), microlitro tubos capilares de cristal (diámetro: 701,04 μm, longitud: 65 mm capacidad: 25.0 μL) y un dispensador de la bombilla dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología. Cuando la solución de agarosa líquida despeja hacia fuera, mantener la calefacción a aproximadamente 50 ° C constante y revolviendo para evitar la gelificación de la agarosa.
  4. Introducir una aguja de acupuntura en la abertura de la parte inferior de un dispensador de bulbo. Inserte un tubo capilar sobre la aguja expuesta al exterior. Fije el tubo capilar introduciendo parte de ella en la sección de goma del cilindro dispensador de bulbo.
  5. Transferir 1 mL de agarosa líquida con una micropipeta a la superficie de una placa de Petri vacía y coloque un extremo del tubo capilar verticalmente (con la aguja insertada) en contacto con agarosa, mientras que la tapa de goma del depósito del bulbo se pellizquen hacia adentro. Suelte lentamente la presión sobre la tapa del distribuidor de bombilla para dibujar la agarosa en el tubo capilar.
    Nota: La transferencia de agarosa líquida en los tubos capilares debe realizarse rápidamente. Si la agarosa líquida se deja enfriar en la superficie del plato de Petri durante suficiente tiempo (aproximadamente 60 s), comienza a gelificarse, prevención de aspiración adecuada de agarosa a lo largo del tubo capilar.
  6. Lugar cada conjunto de lámpara tubo de aguja en una placa Petri libre y deje la agarosa del gel interior de los tubos capilares solidificar por 5 min con cuidado jale el tubo capilar con las manos fuera del tapón de goma en el cilindro dispensador de foco, dejando la aguja y el gel de agarosa en el interior del tubo.
  7. Extraer manualmente la aguja de acupuntura tirando lentamente el tubo capilar; el cilindro de agarosa solidificada nuevamente también las diapositivas del tubo en este procedimiento, que todavía rodea la aguja. Suavemente empujar la micro columna a lo largo de la aguja de acupuntura con la punta de las pinzas estériles para pasar al final. Coloque la aguja sobre un plato de Petri que contiene la DPBS abierto y empuje la columna micro la DPBS con fórceps.
    Nota: Si el micro-columna de agarosa permanece dentro del tubo capilar de vidrio al retirar la aguja de acupuntura, Presione lentamente la agarosa micro-columna del tubo capilar con una aguja de calibre 25 mm y en el plato con DPBS.
  8. Esterilizar microscalpels o pinzas utilizando un esterilizador de grano caliente. Hacer 4% w/v agarosa pesar 4 g de agarosa y transfiriendo a 100 mL de DPBS. Calentar y remover como se explica en el paso 1.2 para obtener una solución de agarosa líquida clara de 4%. Mantener el calentamiento y la agitación de la solución a lo largo de los siguientes pasos.
  9. Transferencia de las cajas Petri que contienen el micro-columnas a una campana de disección y mover una columna micro con unas pinzas finas para una placa de Petri vacía. Utilizar el Estereoscopio para la orientación visual y una microscalpel para cortar las columnas de micro a la longitud deseada. Recortar ambos extremos extremos forma biselado 45o ángulos respecto a la horizontal para facilitar el manejo del micro-columnas durante la adición de ECM y de la célula.
  10. Repite el anterior paso durante tres más micro-columnas en el mismo plato de Petri y alinee las cuatro construcciones en paralelo con una separación de < 3 mm entre cada uno de los cilindros. Carga 50 μl de solución de agarosa al 4% con una micropipeta y vierta una raya/línea de líquido en la matriz columna de micro para conectar y agrupar las construcciones en grupos de cuatro (en adelante llamado "micro-columna barcos"). Evitar el movimiento de agarosa al 4% en los extremos de las columnas de micro que pueden obstruir el interior, minimizando la distancia entre las construcciones y agregando la agarosa rápidamente en una delgada línea.
    Nota: Organizar grupos de cuatro columnas de micro en "barcos" no es necesario para la fabricación de los andamios astrocytic. Sin embargo, los barcos sirven para acelerar el proceso de fabricación y ofrecer un camino más seguro para moverse y manejar micro-columnas en pasos posteriores.
  11. Deje que el micro columna barco se enfríe durante 1-2 minutos permitir la congelación de la agarosa de 4% adicional. Coge el barco columna de micro con pinzas finas por la conexión 4% agarosa y mover las columnas de micro a la otra que contiene DPBS Petri preparada en el paso 1.1.3. Fabricar barcos más con las restantes columnas de micro como se desee.
  12. Mueva las cajas Petri que contienen el micro-columnas y botes a un gabinete de bioseguridad y esterilización con exposición a luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos.
    PRECAUCIÓN: Use protección adecuada para evitar la exposición a los rayos UV.
  13. Almacenar los platos con los barcos de micro columnas de DPBS a 4 ° C, si además de ECM y galjanoplastia del celular no se producirán inmediatamente después, hasta 1 semana. Repita los pasos de fabricación de micro columnas si las construcciones no se utilizan durante este tiempo.

2. aislamiento y cultivo celular de primaria de

  1. Aislamiento de astrositos cortical de crías de rata
    1. En preparación para los siguientes pasos, agregar 20 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) para cuatro platos de Petri de 10 cm que servirán como depósitos de los tejidos disecados. Mantener todos los platos de hielo. Esterilizar tijeras quirúrgicas limpias, pinzas, espátula de micro y micro bisturís en un esterilizador de grano caliente.
    2. Precaliente la tripsina 0.25% con ácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA) y desoxirribonucleasa (DNasa) de 0,15 mg/mL en HBSS a 37 ° C. Además, precaliente astrositos medio de cultivo a 37 ° C, que consta de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con mezcla de nutrientes del jamón F-12 y 10% suero bovino fetal (FBS).
    3. Anestesiar el día postnatal 0 o crías de rata Sprague-Dawley día 1 por exponerlos a condiciones hipotérmicas y eutanasia por decapitación. Perno de la cabeza en un escenario con un 19 mm calibre de aguja en el hocico anterior a los ojos.
    4. Hacer una incisión con un bisturí por la mitad posterior a la anterior, desde la base del cuello hasta sólo detrás de los ojos. Realizar otra incisión pasando lateralmente de directamente detrás de los ojos hacia abajo, formando una forma de T. Usar pinzas finas para retirar el piel craneal, el cráneo al lado.
    5. Mantenga la cabeza por el hocico (hacia arriba) mediante la colocación de uno de los dientes de las pinzas en la boca del animal y el otro en la superficie exterior. Quitar el cerebro con una micro-espátula estéril y colocar en uno de los platos de Petri con HBSS refrigerados. Lugar este plato de Petri en el hielo inmediatamente después y en todo momento excepto cuando esté en uso.
    6. Coloque un bloque de granito previamente almacenado a-20 ° C por debajo de un estereoscopio dentro de una campana de disección. Coloque la placa de Petri con el tejido cerebral en la superficie del bloque de granito para preservar su temperatura baja durante el procedimiento de disección. Uso del estereoscopio como orientación visual a lo largo de los siguientes pasos.
    7. Si los bulbos olfativos se mantienen intactos, extraerlos por corte con pinzas o microscalpels. Además, utilice un microscalpel para eliminar el cerebelo y haga una incisión de línea media que separa los dos hemisferios cerebrales. Transferencia de los hemisferios con pinzas a una placa Petri conteniendo HBSS frescos, refrigerados.
    8. Disecar las estructuras del cerebro medio desde el interior de los hemisferios con un microscalpel para obtener sólo las cortezas separadas. Usar pinzas finas de pelar las meninges, una estructura de hoja-como, desde el tejido cortical y las cortezas aisladas una nueva placa de Petri con HBSS frío. Utilice el microscalpel para picar el tejido con el fin de aumentar la superficie de acción de la tripsina en el paso siguiente.
    9. Utilice una pipeta Pasteur transferir las cortezas a un tubo de centrífuga de 15 mL que contiene 4 mL de tripsina-EDTA precalentado (8 cortezas en cada tubo). Exponer el tejido cortical de tripsina-EDTA para 5-7 min a 37 ° C.
    10. Con una pipeta Pasteur, retirar cuidadosamente el tripsina-EDTA y añadir 400 μL de 0,15 mg/mL DNasa I solución al tubo de centrífuga. Agitar el tubo o el vortex hasta que el tejido está disociado y no hay piezas de tejido restante en el líquido. Si no es posible disolver completamente el tejido, retirar los fragmentos restantes con la punta de una pipeta Pasteur.
    11. Centrifugar el tubo que contiene la solución de células disociadas a 200 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur sin molestar a las células. Añadir 1 mL de medio de cultivo de astrositos (definido en el paso 2.1.2) al tubo con una micropipeta y agitar para resuspender y crear una solución homogénea.
    12. Transferir 10 mL de medio de cultivo de astrositos con una pipeta serológica a un matraz de T-75. Añadir 250 μl de la solución de la célula de 1 mL (preparada en el paso 2.1.11) con una micropipeta en el matraz de la placa de un cerebro de cachorro digno de células por frasco. Distribuir uniformemente la solución descargada de la célula en el medio de cultivo y agitar suavemente el frasco para promover una distribución uniforme.
    13. La cultura los frascos plateados en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2. Después de llegar a 24 y 72 h en cultura, mecánicamente agitar el frasco para separar tipos de celulares no adherente, como neuronas y oligodendrocitos.
    14. Luego, en cada uno de estos puntos de tiempo, realizar un cambio de los medios de comunicación. Sostenga el frasco verticalmente por lo que los medios de cultivo se encuentra en la parte inferior del frasco, no cubriendo las células adheridas. Aspire el medio de cultivo con una pipeta Pasteur, presionando la punta de la pipeta contra la parte inferior del frasco para evitar la extracción de las células. Colocar el matraz en posición horizontal original y suavemente agregue 10 mL de medio de astrositos sobre las células con una pipeta serológica.
    15. Devolver los frascos a la incubadora después de cada cambio de los medios de comunicación. Después de 90% de confluencia, mecánicamente agita el frasco una vez más para eliminar cualquier célula restante no adherentes.
    16. Paso los astrocitos por sacar el medio de cultivo con un vacío y una pipeta Pasteur. Añadir 5 mL de 0.25% tripsina-EDTA con una pipeta serológica sobre las células adheridas. Agite suavemente el frasco para asegurar que la tripsina cubre todas las células e Incube el frasco por 5-7 min a 37 ° C y 5% CO2.
    17. Quench tripsina añadiendo 1 mL de medio de astrositos a las células con una pipeta serológica. Extraer la solución de células del frasco con una pipeta serológica y transferirlo a un tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 3 minutos.
    18. Quite el sobrenadante con una pipeta serológica y resuspender en 1 mL de medio de cultivo de astrositos. Agitar el tubo para asegurar que la solución celular es homogénea. Contar el número de células en la solución con un hemocitómetro o un contador celular automático.
      Nota: Un frasco que es típicamente 90% confluente rinde aproximadamente 3 millones astrocitos.
    19. Añadir 10 mL de medio de cultivo de astrositos en un matraz de T-75. Realizar una dilución de 1:4 por transferir 250 μl de la solución (paso 2.1.18) del celular con una micropipeta en el matraz de T-75 ya que contiene medio de cultivo. Frote suavemente para asegurar una distribución homogénea de la célula a través de la superficie del frasco.
    20. Repita los pasos 2.1.16-2.1.19 cada vez que se logra el 90% de confluencia para las células de paso.
  2. Aislamiento de neuronas corticales de fetos de rata
    1. Siguen preparativos similares como pasos 2.1.1 y 2.1.2, con la excepción de que los medios precalentado son medios de co-cultivo, de Neurobasal medio + 2% B-27 suplemento (neuronas) + 1% G-5 libre de suero suplemento (astrocitos) + 0.25% L-glutamina.
    2. Eutanasia a día embrionario embarazo programado 18 ratas Sprague-Dawley con asfixia dióxido de carbono y confirmar la muerte por decapitación.
    3. Extraer los fetos de rata y diseccionar las cortezas del resto del tejido cerebral en cajas Petri que contienen HBSS en la superficie del bloque de granito frío, utilizando un estereoscopio para la orientación visual y tijeras estériles, microscalpel y pinzas53 . Después de la disección sucesivos de la cabeza, cerebro, hemisferios cerebrales y cortezas, transferir cada tejido para un nuevo plato de Petri llenas de HBSS.
    4. Pique el tejido cortical en fragmentos más pequeños para aumentar el área superficial para la tripsina. Transferencia de 4-6 cortezas con un Pasteur pipeta en un tubo con 5 mL de tripsina-EDTA precalentada y mantienen a 37 ° C para disociar el tejido. A los 5-7 min manualmente agitar el tubo para mezclar y evitar la aglutinación de los tejidos.
    5. Retire el tubo de 37 ° C después de 10 min. Como se explicó previamente en el paso 2.1, extracto de tripsina-EDTA y sustituir con 1,8 mL de 0,15 mg/mL solución ADNasa. Luego, vórtice el tejido hasta que la solución aparece homogéneo, no fragmentos de tejido flotando en el líquido.
    6. Centrifugue la solución disociada tejido a 200 x g durante 3 minutos. Después de retirar el sobrenadante, resuspender en 2 mL de medio de cocultivo. Contar el número de células en esta solución con un hemocitómetro o un contador celular automático.
      Nota: El rendimiento generalmente es de 3.0-5.0 x 106 células corteza hemisferio.
    7. Preparar una nueva solución de celular con una densidad de 2.0-4.0 x 105 células/mL en los medios de cultivo Co definidos anteriormente.

3. desarrollo de los Cables Astrocytic dentro de las columnas de Micro

  1. Fabricación de núcleo de ECM
    Nota: El ECM debe añadirse al interior de las micro-columnas de hidrogel en el mismo día en que se realizará siembra celular.
    1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, preparar un 1 mg/mL solución de cola de rata colágeno tipo I Co medio de cultivo en un tubo de microcentrífuga estéril. Mantener el tubo de microcentrífuga con la solución de ECM en el hielo en todo momento excepto cuando esté en uso.
    2. Transferencia de 1-2 μl de la solución de ECM con una micropipeta en una tira de papel de tornasol para calcular su pH. Añadir 1 μl de 1 N hidróxido de sodio (NaOH) o de ácido clorhídrico (HCl) con una micropipeta para aumentar o disminuir el pH de la solución de ECM, respectivamente y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar. Verificar el pH nuevo con una tira de papel de tornasol y agregar más ácido o base, según sea necesario, hasta que el pH es estable en el rango de 7.2-7.4.
    3. Mueva las cajas Petri de paso 1.2 a una campana de disección y transferencia 4-5 micro-columnas o un barco con pinzas finas estériles a un vacío y estéril 35 o 60 mm plato de Petri. Usando el Estereoscopio para la dirección, coloque la punta de 10 μl de una micropipeta en un extremo de cada columna de micro y succión para vaciar el lumen de DPBS y aire burbujas. Confirmar la ausencia de burbujas de aire con el Estereoscopio para asegurar que el ECM ha añadido en el paso siguiente puede fluir libremente a través de la luz.
    4. Cargar una micropipeta P10 con solución de ECM, lugar 10 μl Punta contra uno de los extremos de las columnas de micro hidrogel y suficiente solución para llenar el lumen (aproximadamente 3-5 μl), observando la entrada de ECM con el estereoscopio. Pipeta un pequeño reservorio (2-4 μL) de solución de ECM en cualquiera de los extremos de la columna de micro.
      Nota: Siempre administrar 4-5 micro-columnas o un barco a la vez para evitar la prolongada sequedad de las construcciones, ya que puede producir en el plegamiento de la estructura micro-columna. Micro-columnas totalmente secos se adhiera firmemente a la superficie de los platos de Petri, que impide su utilización para la siembra de células. Cantidades excesivas de medios de cultivo Co (medida de hidratación) no se puede Agregar a las columnas de micro porque esto puede causar el ECM a salir durante el período de incubación que se describe a continuación.
    5. Medios de cultivo Co de la pipeta en un anillo alrededor de la caja Petri para proporcionar una humedad del fregadero para evitar que las columnas se seque durante la incubación. Incubar la placa de Petri que contiene el micro-columnas que contienen el ECM a 37 ° C y 5% de CO2 por 1 h para promover la polimerización de colágeno antes de añadir las neuronas o astrocitos.
      Nota: El ECM debe formar una capa cubriendo la superficie interna del lumen del hueco, en lugar de un núcleo sólido de ECM que abarca el interior, que pueden ser observados mediante el estereoscopio. Si el ECM forma una base, continuar la incubación hasta que quede sólo la capa. Con esta capa formada, la solución de la célula de astrositos puede llenar el interior de la columna de micro en los pasos de la galjanoplastia.
    6. Durante el período de incubación, preparar la solución de la célula de astrositos (como se describe a continuación).
  2. Astrositos y sembrador de la neurona en las columnas de Micro
    1. Paso los astrocitos plateados (entre el cuarto y duodécimo paso) como se explica en pasos 2.1.16-2.1.19. Después de contar el número de células en el matraz, preparar la solución de células a una densidad de 9.0-12.0 x 105 células/mL de solución en medios de cultivo celular.
    2. Utilizando un estereoscopio, coloque la punta de una micropipeta P10 en uno de los extremos de las columnas de micro y transferir suficiente solución celular (~ 5 μl) en el lumen para llenarlo completamente. Como hecho por encima con el ECM, añadir pequeños embalses de solución celular a ambos extremos de cada columna de micro.
    3. Incubar las columnas de micro plateadas en las cajas Petri a 37 ° C y 5% de CO2 por 1 h para promover la fijación de los astrocitos al ECM. Si las neuronas no se añadirán a las micro-columnas, proceda al paso 3.2.5.
    4. Después del período inicial de incubación, añadir 1-2 μl de la solución de neurona cortical obtenida en el paso 2.2.7 en ambos extremos de las columnas de micro con una micropipeta, observando bajo el estereoscopio. Asegúrese de que los medios suficiente está presente en los platos para evitar que se sequen y otra vez incubar durante 40 min a 37 ° C y 5% CO2 para permitir la adherencia de las neuronas.
      Nota: Solución de neurona Cortical también se puede añadir 1-2 días después de la formación del paquete, realizar paso 3.2.4 después de retirar cuidadosamente los medios de cultivo de la placa de Petri con una micropipeta.
    5. Después de la incubación, cuidadosamente llenar los platos de Petri que contiene las columnas de micro plateadas con 3 ó 6 mL de medio de cocultivo de 35 o 60 mm placas de Petri, respectivamente. Mantener las columnas de micro plateadas en cultivo a 37 ° C y 5% CO2 para promover la uno mismo-montaje de los paquetes astrocytic alineados, que forman una estructura incluida, cable-como después de 6-10 h.
  3. Estabilización de astrositos Cable arquitectura
    Nota: Después de la formación de paquetes, aproximadamente 6-12 h de cultivo de las construcciones, realice los pasos siguientes para evitar el colapso de la estructura alineada de los andamios astrocytic.
    1. En un tubo de microcentrífuga estéril, prepare un colágeno de cola de rata de 3 mg/mL solución en medios de cultivo conjunto. Ajustar el pH de la solución de 7.2-7.4 siguiendo el procedimiento descrito en el paso 3.1.2. Mantener los medios de acción y cultura Co colágeno en el hielo cuando no esté en uso y coloque la solución de colágeno dispuestos en hielo en todo momento.
    2. Retire los medios de comunicación de las cajas Petri que contienen los andamios astrocytic con una micropipeta, dejando algunos medios de los lados del plato para crear un disipador de humedad que asegure la hidratación de las micro-columnas. Coloque el plato bajo un estereoscopio para ayudar en la visualización.
    3. Con una micropipeta, tomar 2-3 μl de solución de colágeno y descarga en cada extremo de las micro-columnas, usando el Estereoscopio para la orientación visual. Asegúrese de que el plato tiene suficientes medios alrededor de los lados para actuar como un disipador de humedad alrededor de los bordes del plato. Incubar las cajas Petri con las columnas de micro de 30 min a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada para promover la gelificación del colágeno recién agregado.
    4. Agregar lentamente 3 ó 6 mL de medio de cocultivo (35 o 60 mm Petri platos, respectivamente) para el Petri platos con una pipeta y la cultura de los platos en un incubador humedecido a 37 oC y 5% CO2.

4. extracción de los paquetes Astrocytic desde el Interior del hidrogel

  1. Cubreobjetos de vidrio en una autoclave de esterilización. Preparar un 20 μg/mL de solución de poli-l-lisina (PLL) en agua de grado de cultura de célula estéril.
  2. Dentro de un gabinete de bioseguridad, manualmente transferir el cubreobjetos de vidrio esterilizada a un estéril 10 cm plato de Petri y añadir suficiente solución PLL para cubrir el cubreobjetos.
  3. Incubar el cubreobjetos, cubierto con la solución PLL, durante 30 min a 37 ° C para cubrir la superficie. Retirar la solución PLL con una pipeta Pasteur después de 30 minutos enjuague tres veces, añadiendo agua de grado de cultura de célula para el cubreobjetos y quitando con una pipeta Pasteur.
  4. Después de la formación del paquete glial alineado, transferir la columna micro delicadamente a una caja Petri estéril con pinzas finas estériles y añadir una pequeña piscina de 10 μl cooperación de medios de cultivo con una micropipeta para prevenir la deshidratación y asegurar salud de paquete. Extraiga el paquete astrocytic de la micro-columna de hidrogel tirando suavemente de un lado con pinzas quirúrgicas estériles, utilizando un estereoscopio para la orientación visual.
  5. Sostiene el paquete astrocytic con fórceps, montarlo en un cubreobjetos recubierto de PLL. Fijar y teñir con el protocolo siguiente.

5. inmunocitoquímica para estudios In Vitro

Nota: Para este estudio, los anticuerpos primarios fueron proteína fibrilar ácida (GFAP) (1: 500), de anti-glial de conejo anti-β-tubulina III (1: 500) de ratón, conejo anti colágeno I (1: 500), ratón nestina anti (1: 200) y conejo anti-vimentina (1: 100). Los anticuerpos secundarios fueron burro anti-ratón 568, burro anti-conejo 568, anti-conejo burro 488 y burro anti-ratón 568 (1: 500 para todos). En todos los casos, agregar suficiente volumen de cada solución para cubrir completamente el micro-columnas.

  1. Preparar una solución de formaldehído 4% volumen/volumen (v/v) en 1 x DPBS dentro de una campana de humos químicos.
    PRECAUCIÓN: formaldehído es un compuesto tóxico conocido cancerígeno y debe desecharse en un contenedor separado. Siempre manipular este compuesto dentro de una campana de humos químicos y utilizar equipo de protección personal (EPP) como capa de laboratorio, gafas de seguridad y guantes.
  2. En el caso de las micro-columnas, desechar los medios de cultivo de los platos de Petri que contiene las construcciones con una pipeta Pasteur sin aspirar accidentalmente los cilindros de hidrogel. Añadir suficiente solución de formaldehído para cubrir el micro-columnas o el cubreobjetos montado (que permanecen en las cajas Petri) e incubar por 35 min a 18-24 ° C.
  3. Extraer la solución de formaldehído de 4.0% de las micro-columnas fijas o el cubreobjetos con una pipeta serológica. Enjuague las micro-columnas fijadas tres veces con PBS rápidamente añadiendo y quitando PBS dos veces y luego dejar que se remoje por 10 minutos una tercera vez.
  4. Suero de caballo normal (NHS) se disuelven en PBS a una concentración de 4% v / v. preparar una solución con detergente no iónico a una concentración de 0.3% v/v usando la solución de NHS como el solvente.
  5. Retire el PBS de las cajas Petri que contienen el micro-columnas o el cubreobjetos con una pipeta. Añadir suficiente solución de detergente de 0.3% para cubrir el micro-columnas/cubreobjetos por 60 min a 18-24 ° C para permeabilizar las células.
  6. Sacar la solución de detergente y enjuague rápidamente dos veces con PBS y tres veces sumergiéndolos durante 5 minutos, calcular el volumen requerido del NHS de 4% y cada uno de los anticuerpos primarios para preparar una solución con las concentraciones de anticuerpo deseado.
  7. Retirar el PBS de las cajas Petri y añadir suficiente anticuerpo primario (diluido en 4% NHS DPBS) solución para cubrir las columnas micro o los paquetes extraídos astrocytic. Incubar durante la noche (12-16 h) a 4 ° C.
  8. Sacar la solución del anticuerpo primario y rápido enjuague dos veces con PBS y tres veces por remojo de 5 minutos cada uno. Preparar la solución de anticuerpo secundario, en la oscuridad, con cada anticuerpo presente en una dilución de 1: 500 en solución de NHS de 4.0%.
  9. Incubar las células con la solución de anticuerpo secundario por 2 h a 18-24 ° C. A lo largo de todo el tiempo de incubación, cubrir los platos de Petri que contiene el micro columnas con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
  10. Retirar la solución de anticuerpo secundario y agregue solución de Hoechst (1:10, 000) por 10 min a 18-24 ° C para teñir los núcleos.
    PRECAUCIÓN: Hoechst es un mutágeno conocido que debe ser tratado como un carcinógeno. Por lo tanto, debe eliminarse en un recipiente separado y PPE debe usarse en todo momento al manipular este agente.
  11. Lavar con PBS cinco veces, cada vez durante 5-10 minutos luego, almacenar las columnas manchadas de micro a 4 ° C en PBS y cubierta con papel de aluminio. En el caso de los paquetes astrocytic montados, añadir una gota de medio de montaje acuoso al paquete, coloque otro cubreobjetos de cristal sobre el paquete fijo y ambos cubreobjetos con esmalte de uñas para el almacenamiento a largo plazo y posterior proyección de imagen del sello.

6. viabilidad ensayo con vivo-muerto (homodímero de etidio-AM/calceína) tinción

  1. Preparar la solución de reactivo al añadir 5 μl calceína AM (a 4 mM en anhidro dimetil sulfóxido (DMSO)) y 20 μl homodímero de etidio-1 (EthD-1) (a 2 mM en DMSO/H2O 1:4 v/v) a 10 mL de 1 x DPBS. Cubrir la solución con papel de aluminio o almacenar en la oscuridad para proteger de la luz.
  2. Aspire los medios de comunicación desde la placa de Petri que contiene las columnas de micro plateadas con una pipeta Pasteur y agregar suficiente solución (preparada anteriormente) para cubrir las construcciones. Incubar durante 30 min a 37 ° C y 5% CO2, manteniendo la caja Petri cubierto para proteger la solución de la luz.
  3. Retirar la solución con una micropipeta o pipeta Pasteur. Enjuague 2 ó 3 veces con DPBS como se explica en el paso 5.3. Las cajas Petri con DPBS de inundación según el tamaño del plato. Imagen células inmediatamente después con epifluorescencia o proyección de imagen confocal.
    Nota: Conversión de la membrana permeable calceína AM a calceína por células metabólicamente activas produce la fluorescencia verde de calceína. Las células muertas se marcan como células comprometidas de membrana, que permiten la entrada de EthD-1 en la célula y su unión a ácidos nucleicos, causando fluorescencia roja.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inicialmente, fase-pone en contraste microscopia fue utilizada para supervisar la progresión de astrositos adherencia y paquete de formación y la estabilidad general de la Citoarquitectura en función del tiempo. A 1 h después de la galjanoplastia, los astrocytes fueron encontrados a lo largo del lumen de las columnas de micro con una morfología esférica (figura 2A). En 5 h, astrocitos comenzaron ampliar procesos y contratación, mientras que 8 h células exhibi...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En comparación con el entorno más propicio del PNS, el SNC se ve particularmente limitado en el manejo de las consecuencias perjudiciales de neurotrauma y neurodegeneración. Después de un grave insulto al SNC mamífero, se forma una cicatriz glial, consistente en un núcleo de células inflamatorias y fibróticas rodeado por una densa red de astrocitos reactivos desorganizados que secretan axón inhibidor consecuencia proteoglicanos14. Esta cicatriz actúa como una obstrucción física y bioquímica contra...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apoyo financiero fue provisto por los institutos nacionales de salud [U01-NS094340 (Cullen) y F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [9998 de # terapéutica de la programa de tubería (Cullen)], Penn medicina Neurociencias centro piloto Premio (Cullen), Fundación Nacional de ciencia [investigación becas DGE-1321851 (Struzyna)], Departamento de Veterans Affairs [RR & D mérito revisión #B1097-I (Cullen)] y la investigación médica del ejército de Estados Unidos y comando del material [#W81XWH-13-207004 (Cullen) y W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de acupuntura (300 y micro; m diámetro)Lhasa MedicalHS.30x40El diámetro puede variar según el tamaño deseado para el lumen de la microcolumna.
Placa de PetriFisher08772B
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de DulbeccoInvitrogen14200075
Pipeta serológica desechable de poliestirenoFisher13-678-11D
AgarosaSigmaA9539-50G
Tubo capilar de vidrio de microlitros (701 µ m)Fisher21-170JEl diámetro puede variar de acuerdo con el tamaño deseado para la carcasa de la microcolumna.
Dispensador de bombillas MicrocapFisher21-170Jviene con los tubos microcap.
Placa calefactoraFisherSP88857200
Barra magnéticaFisher1451352
MicropipetaSigmaZ683884-1EA
Aguja de calibre 25 mmFisher14-826-49
MicrobisturíRoboz SurgicalRS-6270
TijerasFine Science Tools14081-09
PinzasWorld Precision Instruments501985
Esterilizador de perlas calientesSigmaZ378550-1EA
EstereoscopioNikon SMZ800N
MicroespátulaFisherS50821
Cola de rata tipo I colágenoCorning 354236Mantener a 4 º C y retirar solo cuando sea necesario. Use hielo para preservar su temperatura cuando esté en uso.
Tubo de microcentrífugaFisher02-681-256
Hidróxido de sodio (NaOH)FisherSS2661
Ácido clorhídrico (HCl)FisherSA48-1
Papel tornasolFisher09-876-18
Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS)Invitrogen14170112Almacene a 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen 25200056Almacene a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Desoxirribonucleasa pancreática bovina (Dnase) ISigma10104159001Tienda a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con Mezcla de Nutrientes F-12 de JamónGibco11330-032Almacene en 4 ºC.
Suero fetal bovino (FBS)Atlanta BiologicalsS11195Tienda en -20ºC.
Postnatal día 0 o día 1 crías de rata Sprague DawleyCharlesRiver Strain 001
Neuroneurobasal neuroneuronal embrionario medio basalInvitrogen21103049Almacene en 4º C y cálido a 37 º C antes de usar.
B-27 suplemento sin sueroInvitrogen 12587010Tienda en -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
L-glutaminaInvitrogen 35050061Tienda a -20 º C y cálido a 37 º C antes de usar.
G5 suplemento astrocíticoInvitrogen17503012
Sprague Dawley embrionario día 18 ratasCharlesRiver Strain 001
pipeta PasteurFisher22-042816
tubo de centrífuga de 15 mLEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
centrífugaFisher05-413-115
HemocitómetroFisher02-671-6
IncubadoraFisher13 998 076
Formaldehído 40%FisherF77P-4El formaldehído es un compuesto tóxico conocido por ser cancerígeno y debe eliminarse en un recipiente separado.
Cubreobjetosde vidrio Fisher12-548-5M
Esmalte de uñasElectron Microscopy Sciences (EMS)72180
Medio de montaje fluoromontSouthern Biotech0100-01
Poly-L-lisinaSigmaP4707
Solución salina tamponada con fosfatoFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Suero normal de caballoGibco16050-122
Anticuerpo primario anti-glial proteína fibrilar ácida (GFAP) de conejoMilliporeAB5804Almacenar a -20ºC.
Anticuerpo primario anti-beta-tubulina III de ratónSigmaT8578Almacene a -20ºC.
Anticuerpo primario anticolágeno I de conejoAbcamab34710Almacenar a -20ºC.
Anti-vimentinade conejo MilliporeAB3400Tienda en -20ºC.
Ratón anti-nestinaMilliporeAB5326Tienda a -20ºC.
Burro anti-ratón 568 anticuerpo secundarioInvitrogenA10037Almacenar en 4ºC.
Burro anti-conejo 568 anticuerpo secundarioInvitrogenA10042Almacenar en 4ºC.
Burro anti-conejo 488 anticuerpo secundarioInvitrogenA21206Almacenar en 4ºC.
Hoechst 33342, TrihidrocloruroInvitrogenH3570Almacene en 4ºC. Hoechst es un mutágeno conocido que debe tratarse como un carcinógeno. Por lo tanto, debe desecharse en un contenedor separado.
Calceína AMSigmaC13594 mM en DMSO anhidro
Homodímero de etidio-1Life TechnologiesE11692 mM en DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimetilsulfoxano (DMSO)Sigma276855
A1RSI Microscopio Confocal de Barrido LáserNikonSe utiliza para tomar las reconstrucciones confocales de construcciones inmunomarcadas.
Microscopio Eclipse Ti-SNikonSe utiliza para tomar imágenes de contraste de fase. Con adquisición de imágenes digitales utilizando una cámara QiClick interconectada con el software Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
La bombilla

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  2. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  3. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  4. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  5. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  6. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  7. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  8. Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  9. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  10. Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  11. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
  12. Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
  13. Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79 (2), 77-89 (2010).
  14. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146-156 (2004).
  15. Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22 (2), 68-76 (2013).
  16. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  17. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  18. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  19. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  20. Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58 (4), 423-433 (2010).
  21. Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7 (1), 66-72 (2014).
  22. Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 306-316 (2011).
  23. Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
  24. Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22 (12), 2187-2201 (2013).
  25. Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  26. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  27. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  28. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  29. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  30. Morrison, B. I. III, Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  31. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  32. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  33. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  34. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).
  35. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  36. Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20 (4), 327-348 (2010).
  37. Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67 (2), 213-223 (2010).
  38. Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127 (2), 393-402 (2000).
  39. Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27 (11), 655-661 (2004).
  40. Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21 (11), 1534-1550 (2011).
  41. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487 (4), 407-427 (2005).
  42. Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
  43. Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164 (1-2), 61-68 (1979).
  44. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  45. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32 (22), 7477-7492 (2012).
  46. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  47. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  48. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  49. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  50. Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2 (2), 93-103 (2006).
  51. Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
  52. Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28 (36), 5498-5508 (2007).
  53. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  54. Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32 (510), 1220-1229 (2014).
  55. Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50 (3), 187-197 (2005).
  56. Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101 (3), 794-805 (2007).
  57. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  58. Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22 (10), 1077-1084 (2001).
  59. Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213 (2), 281-292 (2008).
  60. Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33 (3), 376-382 (2005).
  61. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  62. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2016).
  63. McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  64. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  65. Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274 (1), 79-86 (1983).
  66. Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (11), 7205-7209 (1981).
  67. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  68. Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9 (7), 7200-7208 (2013).
  69. Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11 (9), 1611-1617 (2005).
  70. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  71. Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70 (12), 826-841 (2010).
  72. Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443 (3), 237-249 (2002).
  73. Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11 (1), 17-24 (2014).
  74. Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
  75. Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2 (1), 56-67 (2009).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Aligned Astrocyte NetworksTissue Engineered ScaffoldsHydrogel Micro columnAstrocyte Self assemblyCollagen CoatingConfocal ImagingGFAP ExpressionNeurite ExtensionCNS RegenerationLiving Scaffolds

Artículos relacionados