Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática.
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Artículo de método
Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales
En este artículo
Resumen
Resumen
Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de neuronas de la médula espinal. Las neuronas se obtienen a partir de ratones C57BL / 6 neonatales y se aíslan el día 1-3 postnatal. Una litera de ratón, generalmente 4-10 cachorros nacidos de un par reproductor, se recolecta para un experimento, y las médulas espinales se recogen individualmente de cada ratón después de la eutanasia con isoflurano. La columna vertebral se disecciona y luego la médula espinal se libera de la columna. Las médulas espinales se cortan entonces para aumentar el área superficial de suministro para una proteasa enzimática que permite que las neuronas y otras células sean liberadas del tejido. La trituración se utiliza entonces para liberar las células en solución. Esta solución se fracciona posteriormente en un gradiente de densidad para separar las diversas células en solución, permitiendo que las neuronas sean aisladas. Aproximadamente 1-2.5 x 10 6 neuronas se pueden aislar de un grupo de la litera. Las neuronas se sembraron luego en pocillos recubiertos con adhesivoRs que permiten un crecimiento y maduración adecuados. Las neuronas tardan aproximadamente 7 días en alcanzar la madurez en el medio de crecimiento y cultivo y pueden utilizarse posteriormente para tratamiento y análisis.
Introducción
La comprensión de la patología de la médula espinal requiere el uso de varios modelos, tanto en los niveles macroscópico y microscópico. Los modelos animales grandes y pequeños 1 , 2 , 3 se usan para investigaciones in vivo de la enfermedad y lesión de la médula espinal. Mientras que el estudio de estos temas in vivo tiene sus méritos, el análisis de la médula espinal se limita a toda la médula espinal homogenado o tejido secciones [ 4] . Esto crea cierta ambigüedad al tratar de aislar respuestas específicas y objetivos en la médula espinal entre sus neuronas residentes y la glía circundante. La creciente disponibilidad de ratones manipulados genéticamente permite realizar investigaciones más detalladas de la biología a nivel celular y molecular. Por lo tanto, un modelo de ratón neonatal se utiliza aquí, lo que permite el estudio de las propiedades únicas y la biología de las neuronas de la médula espinal in vitro .
El aislamiento y el mantenimiento de las neuronas in vitro no es particularmente sencillo.Existe una abundancia relativa de técnicas para el aislamiento neuronal del tejido cortical de los roedores adultos que parecen resultar en un número sustancial de neuronas aisladas ( es decir, millones) 5 , 6 , 7. En cambio, el rendimiento de las neuronas del tejido de la médula espinal es inferior 8 , 9 , 10 , en parte debido a la menor masa de tejido, y en los ratones existe una relativa escasez de técnicas para el aislamiento de neonatos Las neuronas de la médula espinal y los métodos existentes están limitados por rendimientos de neuronas más bajos ( es decir, cientos) 9 o por técnicas laboriosas y pesadas en recursos que requieren el aislamiento de ratones embrionarios 10 .En este protocolo,Utilice una técnica que permita el aislamiento económico y eficaz de un número sustancial de neuronas de las médulas espinales de los ratones neonatales. Como es común en las técnicas publicadas anteriormente, utilizamos la papaína como una proteasa enzimática, lo que permite la liberación de neuronas del tejido de la médula espinal 5 , 6 . Además, se utiliza un gradiente de densidad para la separación refinada de células, que se ha demostrado que es eficaz 6 , 10 . Mientras que el medio en el que las células se incuban puede variar, en nuestra experiencia y como se publicó anteriormente 11 , la suplementación con el suplemento de medio de cultivo B27 fresco ha demostrado ser crítico para la longevidad de las neuronas. Las neuronas son típicamente viables hasta 10 días, permitiendo que se realice el tratamiento.
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Protocolo
El cuidado y tratamiento de los animales en este procedimiento se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Colorado.
1. Preparación de soluciones
- Preparar y almacenar todas las soluciones a temperaturas apropiadas, como se muestra en la Tabla 1 .
2. Recubrimiento de pozos y diapositivas
NOTA: Las neuronas no se adhieren bien a superficies de plástico o vidrio.
- Un día antes del aislamiento de las neuronas, se cubren los pocillos de una placa de cultivo estéril de 24 pocillos con 0,5 ml de Poly-D-Lisina (PDL, Tabla 2 ) y se deja en una capa de flujo laminar O / N.
NOTA: El método preferido es usar placas de 24 pocillos y cubrir solamente los pocillos centrales, ya que la evaporación de los pocillos periféricos tiende a ser más acelerada y conducir a resultados inconsistentes. Adicionalmente, se pueden colocar diapositivas de vidrio dentro de los pocillos antes de tO revestimiento. Las neuronas se unirán a las diapositivas de vidrio revestidas y se pueden retirar posteriormente para obtener imágenes microscópicas adicionales . - El día del aislamiento, retire el PDL de los pozos. Lavar con agua estéril durante unos minutos antes de retirar el agua restante y dejar que se seque durante 1 h (ver más abajo).
- Después del secado, cubrir los portaobjetos con laminina ( Tabla 2 ).
NOTA: Aproximadamente 10 μl de laminina (10 μg / μl) es suficiente para revestir cada pocillo de una placa estéril de 24 pocillos. Esto se mezcla con 340 μl de medio (volumen total: 350 μl) para cubrir todo el pocillo. Dejar reposar durante 2 h a RT en una campana de cultivo y luego aspirar antes de recubrir las células.
3. Cosechando las Cuerdas Espinales
NOTA: Todos los instrumentos deben esterilizarse en autoclave (135 ° C y 30 psi durante 4 ciclos de 7 min) para la esterilidad.
- Euthanize cachorros de ratón C57BL / 6 de un día de edad en una cámara con isoflurano. Espere30 s después de la cesación del movimiento y pellizcar la pierna para confirmar la falta de respuesta.
- Separar la cabeza del cuerpo usando tijeras, con el cachorro en la posición prona.
- Estabilice las patas traseras o la cola y los brazos en la mesa de procedimientos, con el lado dorsal hacia el usuario.
- Corte la piel usando tijeras de iris curvadas.
- Corte la médula espinal de la región lumbar justo por encima de las caderas y proceda a cortar ambos lados del tórax para separarlo del cuerpo.
NOTA: Esto requiere la disección cuidadosa de la médula espinal de los órganos viscerales para evitar daños inadvertidos a otros órganos ( Figura 1a ). - Se lava secuencialmente durante 10 s en placas de Petri de 3 x 10 cm que contienen 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) esterilizada con filtro de 0,2 μm para eliminar el exceso de tejido.
- Inserte una aguja de 22 G y una jeringa llena de 5 mL de PBS esterilizado con filtro en el extremo caudal de la columna vertebral y enjuague cranealmente, permitiendo que el cordón tO salida en una cuarta placa de Petri ( Figura 1b ).
- Recoger la médula espinal en un tubo de 15 mL con 5 mL de HABG ( Tabla 1 ) sobre hielo. Tenga cuidado de no aplastar la médula espinal.
- Repita los pasos 3.1-3.8 para cada cachorro en la litera.
NOTA: Idealmente, este proceso debe tomar menos de 30 min por médula espinal para asegurar el aislamiento sano de las neuronas.
4. Aislamiento de las neuronas
NOTA: El siguiente paso debe realizarse en una campana de flujo laminar. Se espera una familiaridad con la técnica estéril básica.
- Huevo de Tejido
- Tome el tubo que contiene las cuerdas espinales y agite ligeramente para suspender el tejido.
- Vierta el tejido del tubo en una placa de Petri de vidrio de 60 mm y pásela con una hoja de afeitar para crear piezas finas de ~ 0,5 mm de tamaño.
- Transferir el tejido con una pipeta de diámetro ancho en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de HABG.
- Colóquelo en un30 ° C durante 30 min para permitir que las células se equilibren a esta temperatura. Mantenga las células en un agitador lo suficiente como para permitir que se suspendan en el líquido.
NOTA: Este paso se hace para evitar el choque de las células tras la transferencia de hielo al medio de digestión. Mantener las células a 30 ° C ayuda a disminuir la muerte celular asociada con un metabolismo de otro modo aumentado a 37 ° C.
- Preparar el medio de digestión ( Tabla 1 ).
- Preparar el gradiente de densidad (Tabla 1).
- Prepare cada una de las 4 capas en 4 tubos separados de 15 mL, como se indica en la Tabla 1 .
- Añadir 1 ml de cada capa en un nuevo tubo de 15 ml. Comience con la capa 1 en la parte inferior y agregue secuencialmente hasta llegar a la capa 4 en la parte superior. Evite perturbar las capas mientras agrega.
- Lave las placas recubiertas de PDL de la etapa 2.2. Lavar con agua estéril durante unos minutos antes de retirar el agua restante yPermitiendo que se sequen durante 1 h.
- Transferir el tejido al medio de digestión.
- Retirar el tubo que contiene los tejidos del baño de agua agitador a 30 ° C y dejar reposar durante unos minutos.
- Retirar el tubo del medio de digestión del baño de agua a 37 ° C y aspirarlo en una jeringa de su-lock.
- Aspirar el exceso de HABG del tubo que contiene los tejidos.
- Utilice un filtro su-lock de 0,2 μm en la jeringa para añadir medio de digestión al tubo que contiene tejido.
- Colocar el tubo en un baño de agua a 30 ° C durante 30 min. Mantenga las células temblando lo suficiente como para permitir que se suspendan en el líquido.
NOTA: Es importante no mantener las células en el medio de digestión durante demasiado tiempo o dejar que la temperatura se eleve demasiado, lo que podría conducir a una digestión excesiva y dar lugar a que el tejido se suspenda en una mezcla gelatinosa.
- Durante este período, se cubre la laminina como en el paso 2.3.
- Realizar la trituración ( es decir, separar las células del tejido).
- Retire el tubo del baño de agua templado a 30 ° C y deje reposar durante unos minutos.
- Aspirar el exceso de medio de digestión.
- Suspender el tejido en 2 mL de HABG.
- Usando una pipeta de ánima estrecha, tritura 10 x durante 45 s.
NOTA: Este es probablemente el paso más importante y puede disminuir significativamente el rendimiento si no se hace correctamente.- Aspirar el tejido en la pipeta y vaciar inmediatamente el contenido.
- Evitar la introducción de aire, ya que disminuirá significativamente el rendimiento viable.
NOTA: La pipeta ideal es una pipeta de vidrio de 9 "La punta de la pipeta debe ser pulida con fuego para suavizar las superficies rugosas Luego debe ser siliconada colocando en una solución 1:20 de diclorodimetilsilano (DMDCS) en cloroformo La pipeta debe ser removida y dejada secar al aire.Debe esterilizarse en autoclave.
Precaución: El DMDCS y el cloroformo son altamente inflamables, y la siliconización debe realizarse en una campana extractora.
- Aspirar la parte superior de 2 ml de sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo de 15 ml denominado "colección".
- Repita los pasos 4.7.3-4.7.5 dos veces adicionales (el tubo de recolección de células debe tener 6 mL al final).
- Transferir lentamente el contenido del tubo de recogida en el tubo de gradiente preparado en el paso 4.2, evitando la interrupción del gradiente.
- En este punto, retire el medio neurobasal previamente preparado ( Tabla 1 ) del refrigerador y deje que se caliente en un baño a 37ºC.
- Purificar las neuronas.
- Centrifugar el tubo de gradiente durante 15 minutos a 800 xg y 22 ° C.
- Recoja la (s) capa (s) deseada (s) con una pipeta ( Figura 2 ) y colóquela en un nuevo tubo de 15 ml. Para el neuro más puroN aislamiento ( es decir > 90%), recoja la capa 3. Para obtener más rendimiento con menos pureza ( es decir, > 70-80%), recoja las capas 2 y 3.
- Diluir el gradiente de densidad añadiendo 5 mL de HABG a las capas recién recolectadas.
- Centrifugar a 200 xg durante 2 min a 22 ° C.
- Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender en 5 mL de HABG y pellizque el sedimento para suspender las células.
- Centrifugar durante 2 min 200 xg a 22 ° C.
- Deseche el sobrenadante, resuspenda en 3 ml de medio neurobasal y pellizque el sedimento para resuspender las células.
- Cuente las celdas.
- Tomar 10 μL de la solución, ahora con células en medio neurobasal, y mezclar con 10 μl de azul Trypan.
- Colocar 10 μL de esta mezcla en una cámara de recuento de vidrio.
- Usando una cámara de recuento de vidrio estándar, cuente el número de células en cada uno de los cuatro cuadrantes de 4 x 4. Agregue todas las celdas contadas (n), multi(Factor de dilución), dividir por 4 (número de cuadrantes contados), multiplicar por 3 (volumen de medio neurobasal) y multiplicar por 10 4 para obtener la concentración de células en células / ml.
- Sembrar las células en las placas de cultivo
- Diluir la suspensión celular a 300.000 células en 1 mL de medio neurobasal.
NOTA: Sobre la base de la concentración de células obtenida en los pasos anteriores, se añade medio neurobasal adicional para obtener una concentración final de 3 * 10 5 células / ml. La ecuación es C 1 V 1 = C 2 V 2 , donde C 1 es la concentración inicial de células obtenidas de la cosecha; V $ ₁ $ es de 3 ml; Y C $ ₂ $ es de 3 x 10 $ ⁵ $ células / ml, como se discutió anteriormente. La ecuación se resuelve para V2. Añadir el volumen de neurobasal medio necesario para hacer el volumen total de células en solución igual aV 2 . - Agitar suavemente para distribuir las células en solución y agregar 1 ml a cada pocillo en las placas de 24 pocillos recubiertos.
- Diluir la suspensión celular a 300.000 células en 1 mL de medio neurobasal.
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Resultados
Utilizando esta técnica, una sola camada (4-10 cachorros) permite el aislamiento de 1-2.5 10 6 neuronas adecuadas para siembra en placas de cultivo. Típicamente, se sembran 4-8 pocillos a la concentración mencionada anteriormente ( es decir, 300.000 células / ml). La Figura 3 demuestra la aparición de neuronas a esta concentración después de una semana en cultivo a microscopía de luz de aumento de baja ( a ) y alta (
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Discusión
Esta técnica permite el cultivo confiable de las neuronas de la médula espinal. Una vez que la habilidad en la técnica se logra, se tarda aproximadamente 3,5 horas en completarse. Hemos podido llevar a cabo el aislamiento de neuronas de 2 camadas separadas (16 ratones en total) en aproximadamente 4 h. El paso clave en la factibilidad es ser capaces de extraer de manera competente las médulas espinales de los ratones. El rendimiento permite el chapado de varios pozos y la capacidad de probar las neuronas en diversas cond...
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones.
Agradecimientos
Los autores no tienen reconocimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hibernar A Medio - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernar A Menos Calcio - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Suplemento 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papaína, Liofilizada - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medio - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 u/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina (PDL) - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Laminina de ratón - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Azul Trypan - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Medio de Gradiente de Densidad - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US Diclorodimetilsilano ( DMDCS, Sigma Silicona) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US Cloroformo | Sigma-Aldrich | 288306-1L | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US Pippette de vidrio - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Bombilla de pipeta - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Placa de Petri, vidrio - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US Placa de cultivo celular estéril de 24 pocillos | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US Hemacitómetro Hausser (cámara de recuento de vidrio) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Portaobjetos de vidrio - 12 mm cubreobjetos estériles - sin recubrimiento | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit - 100 µ L | Abcam | ab177487 | Después de la fijación en paraformaldehído (PFA) y el bloqueo con BSA al 5%, las células en un cubreobjetos de 12 mm se incubaron en el anticuerpo diluido 1:200 durante 18 h en 4 & grados; C |
| MAP-2 Anticuerpo monoclonal de ratón - 50 µ L | Abcam | ab11267 | Después de la fijación en paraformaldehído y el bloqueo con BSA al 5%, las células en un cubreobjetos de 12 mm se incubaron en el anticuerpo diluido 1:500 durante 18 h en 4 & grados; C |
Referencias
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