Este protocolo describe la recuperación del virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADNc infeccioso de dos plásmidos.
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Artículo de método
Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone
En este artículo
Resumen
Resumen
Los clones de cDNA infecciosos permiten la manipulación genética de un virus, facilitando así el trabajo sobre vacunas, patogénesis, replicación, transmisión y evolución viral. Aquí se describe la construcción de un clon infeccioso para el virus Zika (ZIKV), que actualmente está causando un brote explosivo en las Américas. Para evitar la toxicidad a las bacterias que se observa comúnmente con los plásmidos derivados de flavivirus, se generó un sistema de dos plásmidos que separa el genoma en el gen NS1 y es más estable que las construcciones de longitud completa que no pudo ser recuperado con éxito sin mutaciones. Después de la digestión y la ligación para unir los dos fragmentos, ARN viral de longitud completa puede ser generado por transcripción in vitro con ARN polimerasa T7. Tras la electroporación del ARN transcrito en las células, se recuperó el virus que exhibía cinética de crecimiento in vitro similar y fenotipos de virulencia e infección in vivo en ratones y mosquitos, respectivamente.
Introducción
El virus Zika (ZIKV, Familia Flaviviridae : Género Flavivirus ) es un flavivirus transmitido por mosquitos que llegó a Brasil en 2013-14 y posteriormente se asoció con un brote masivo de enfermedad febril que se extendió a través de las Américas 1 . Además, ZIKV se ha relacionado con graves resultados de la enfermedad, como el síndrome de Guillain-Barré en adultos y microcefalia en fetos y neonatos [ 2] . Poco se sabía acerca de ZIKV antes de su rápida propagación en el hemisferio occidental. Esto incluyó la falta de herramientas moleculares, dificultando así la investigación mecanicista. Las herramien....
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Protocolo
1. Transformación y recuperación de plásmidos de clones infecciosos
- Transformar ambos plásmidos (por separado) utilizando un protocolo de transformación comercial ( por ejemplo , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con algunas modificaciones. Ambos plásmidos contienen un gen que codifica la resistencia a ampicilina, por lo tanto, usan ampicilina o carbenicilina para la selección. Se prefiere la carbenicilina, ya que es más estable.
- Retirar las células (ver tabla de materiales) de -80 ° C congelador y descongelar en hielo durante 5-10 min. Caldo de lysogénesis pre-calcinado (LB) (conteniendo 10 g / L de NaCl y 25 μg / mL....
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Resultados
El protocolo descrito aquí permite la recuperación de virus Zika derivados de clones infecciosos. Manipular el sistema de clones infecciosos de dos plásmidos es sencillo cuando se realiza con cuidado, en comparación con las versiones de longitud completa que son altamente inestables (datos no mostrados). Después de la digestión y la ligación de las dos piezas distintas, ARN tapado se produce utilizando la transcripción in vitro con T7 polimerasa que luego se electropora.......
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Discusión
Aquí describimos un método para la recuperación de un sistema de clonación de ADNc infeccioso bipartito para ZIKV. Los clones descritos anteriormente para ZIKV sufren de atenuación o requieren la adición de intrones, lo que hace que los plásmidos sean más grandes y evita el rescate en las células de insectos. El virus infeccioso se puede recuperar utilizando el sistema de clones de dos plásmidos en células de mamíferos o insectos (datos no mostrados). Además, el virus recuperado de este sistema se comporta de manera simi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Kristen Bullard-Feibelman, a Milena Veselinovic ya Claudia Rückert por su ayuda en la caracterización del virus derivado de clones. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, NIH bajo las concesiones AI114675 (BJG) y AI067380 (GDE).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillina, Sal Disódica | Varios | ||
| Kit de Minipreparación de Plásmidos Zyppy | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 unidades/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20.000 unidades/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10.000 unidades/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20.000 unidades/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20.000 unidades/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20.000 unidades/ml |
| illustra TempliPhi 100 Kit de amplificación | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel y limpieza de PCR | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Camarones Fosfatasa alcalina (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1.000 unidades/ml |
| Fosfatasa alcalina, ternera intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10.000 unidades/ml |
| ADN T4 Ligasa | New England BioLabs | M0202S | 400,000 unidades/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Células Vero | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 Sistema de electroporación de alto rendimiento | BTX | 45-0423 | Se aceptan otras máquinas. |
| LB Caldo con agar (Miller) | Sigma | L3147 | También se puede hacer en casa. |
| Excelente caldo | Sigma | T0918 | También se puede hacer en casa. |
| Placa de Petri | Celltreat | 229693 | |
| tubos de cultivo VWR | International | 60818-576 | |
| Matraces T75 | Celltreat | 229340 | |
| Matraces T182 | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 con L-glutamina | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM con L-glutamina y 4,5 g/L de glucosa | Corning | 10-017-CV | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacantth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Etanol Desnaturalizado | VWR International | BDH1156-1LP | |
| Placa | de 6 pocillosCelltreat | 229106 | |
| placa de 12 pocillos | Celltreat | 229111 | |
| Secuenciación Oligos | IDT | , consulte la tabla 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | otros métodos son aceptables. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher | Q32850 | otros métodos son aceptables. | |
| Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher | Q32852 | otros métodos son aceptables. | |
| El gabinete de bioseguridad de clase II | varía | N/A | Esto es necesario para el trabajo con virus vivos. |
Referencias
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
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Reimpresiones y permisos
