Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

Summary

En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .

Abstract

Hay muchos estímulos biológicos que pueden influir en la diferenciación celular de comportamiento y la célula de vástago. General de la célula cultura enfoques dependen de factores solubles en el medio al control celular comportamiento. Sin embargo, adiciones solubles no pueden imitar ciertos motivos, como factores de crecimiento de la matriz-limite de señalización, célula señalización y espaciales señales bioquímicas, que son influencias comunes en las células. Además, propiedades biofísicas de la matriz, como rigidez de sustrato, desempeñan papeles importantes en el destino de la célula, que no es manipulada fácilmente usando celular convencional, prácticas de cultivo. En este método, se describe un protocolo sencillo para proporcionar proteínas bioactivas modeladas en hidrogel sintético polietileno glicol (PEG) con fotoquímica. Esta plataforma permite el control independiente de la rigidez de sustrato y las señales bioquímicas espaciales. Estos hidrogeles pueden lograr una amplia gama de valores de rigidez fisiológicamente relevantes. Además, las superficies de estos hidrogeles pueden ser photopatterned con péptidos bioactivos o proteínas vía tiol-ene en las reacciones química. Estos métodos han sido optimizados para retener la función de la proteína después de la inmovilización de superficie. Se trata de un protocolo versátil que se puede aplicar a cualquier proteína o péptido de interés para crear una variedad de patrones. Finalmente, las células sembradas en las superficies de estos hidrogeles bioactivos pueden controlarse con el tiempo, como responden a señales específicas espacial.

Introduction

Hay muchos estímulos que influyen en comportamiento celular. En general, técnicas de cultivo de célula típica dependen de factores solubles que provocan respuestas celulares; sin embargo, existen limitaciones a este enfoque. Estos métodos no son capaces de mostrar con precisión todos motivos señalización comúnmente en vivo. Tales mecanismos de señalización incluyen factores de crecimiento secuestradas, célula de señalización y señales bioquímicas espacial específica. Además, rigidez de sustrato puede jugar un papel importante en la diferenciación de comportamiento y célula de vástago de la célula y no se manipula fácilmente usando el cultivo común de la célula^1,de prácticas². Biomaterial enfoques ofrecen una nueva plataforma para comenzar a explorar estos mecanismos de señalización. En particular, los hidrogeles son excelentes candidatos para tuning sustrato rigidez^3,4, inmovilización de proteínas y péptidos^5,6y la creación de patrones espacialmente específica^{7, 8}.

Los hidrogeles se usan como andamios en la ingeniería del tejido fino debido a sus características biofísicas y bioquímicas comunes con la matriz extracelular (MEC)^9,10. Polímeros naturales son opciones comunes para andamios, ya que son biocompatibles y se encuentran en muchos tejidos del cuerpo. La limitación del uso de polímeros naturales como sustratos es que carecen de grupos químicos fácilmente manipulables para bioconjugation. Por otro lado, hidrogel sintético, así como PEG, es excelentes plataformas para químicos específicos^11,12. Además, hidrogeles de PEG no provocan una respuesta celular y por lo tanto se utilizan como columna vertebral inerte para crear andamios bioactivos.

Para crear hidrogeles bioactivos, fotopolimerización y tiol-ene química se emplean reacciones click. Estos photoreactions requieren un fotoiniciador y una fuente de luz UV. Cuando fotoiniciadores se introducen a la luz UV, bonos rompen para formar radicales. Los radicales de la tesis son necesarios para iniciar la reacción pero pueden afectar negativamente la proteína bioactividad^12,13. Por lo tanto, es crucial optimizar el fotoiniciador y tiempos de exposición de rayos UV para mantener la bioactividad de la proteína.

En este método, los hidrogeles se sintetizan mediante fotopolimerización de crecimiento de cadena acrylate-acrilato. PEG-diacrylate (PEGDA) monómeros reaccionan entre sí para formar redes de polímeros ramificados responsables de la estructura del hidrogel. La concentración de monómeros PEGDA dentro de la solución precursora de gel de control de la rigidez del sustrato. Debido al pequeño tamaño del hidrogel de poro, proteínas ECM como la fibronectina pueden ser fácilmente incorporadas en el hidrogel con el fin de archivo adjunto de la celular. Finalmente, estos hidrogeles pueden ser superficie modelada con péptidos bioactivos o proteínas vía tiol-ene en reacciones de química. Aquí, acrilatos libre sin reaccionar dentro del sistema de hidrogel reaccionará con tioles libres en la proteína o péptido cuando se expone a la luz UV. Después de que las proteínas o péptidos son inmovilizados en la superficie del hidrogel, el hidrogel puede almacenarse a 4 ° C durante varias semanas sin perder la bioactividad. Esto ofrece conveniencia, planificación experimental flexible y la posibilidad de colaboración entre laboratorios. En general, esta plataforma permite controlar bioquímica biomecánica y espacial, independiente unos de otros, por la oportunidad de influir en el comportamiento celular.

Protocol

1. preparación de materiales para la síntesis de hidrogel

1. Preparar soluciones madre de PEGDA, fenil litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) y fibronectina en condiciones estériles y en cálculos (tabla 1A).
   1. Pesar y disolver compuestos en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por lo general, mantener PEGDA concentraciones entre 50 y 200 mg/mL (5-20% peso/volumen) de solución de trabajo. Pipetear la solución PEGDA a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización de.
      Nota: Mantenga las soluciones PEGDA cubiertas con una papel de embalaje para proteger de la luz. Preparar una solución fresca de PEGDA (recomendado) para cada experimento.
   2. Reconstituir fibronectina proteína en polvo basado en el fabricante ' recomendación de s. Mantener la solución 1 mg/ml, de alícuota fibronectina en alícuotas de 60 a 100 μl y almacenarlos a-20 ° C hasta su uso. Descongelar las alícuotas a 4 º C durante varias horas o durante la noche antes de usar. Si la acción de la proteína ya no está prevista en condiciones estériles, utilice un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización.
      Nota: Fibronectina se utiliza para la fijación de la célula. Pueden sustituirse otras proteínas ECM.
   3. Pesar LAP para la solución y disolverlo en PBS, una típica concentración stock es 25 mg/mL. Someter a ultrasonidos si hay algún problema con la disolución. Pasar la solución por un filtro 0,22 μm de esterilización. Cubrir la vuelta con un envoltorio de papel de aluminio y guardar a 4 ° C por hasta varios meses.
      Nota: LAP es el fotoiniciador utilizado para la fotoquímica.
2. Preparar moldes de diapositivas de vidrio estéril para hidrogel formación.
   1. Autoclave un poliéster HOJA; uno es necesario para cada molde de gel. Remoje dos portaobjetos de cristal y tres espaciadores de plástico (0,5 mm de espesor) para cada molde de gel en etanol al 70% durante al menos 2 h, pero generalmente, déjelos remojando la noche anterior. Remojar cinco clips de carpeta para cada molde de gel en etanol al 70% para 10 minutos antes del uso.
   2. Colocar el portaobjetos de vidrio, separadores y clips binder sobre una pequeña hoja esterilizada en la campana de la cultura de célula para permitirles al aire seco durante varias horas.
   3. Moldes de hidrogel preparación colocando espaciadores de plástico alrededor del borde de un portaobjetos de vidrio. Colocar el segundo portaobjetos de cristal en la parte superior. Garantizar los espaciadores firmemente al lado de uno con los clips de la carpeta, dos en cada lado largo y uno en la parte superior.
      Nota: Si esto no es montado correctamente, la solución gel se derramará.
   4. Esterilización de superficie el molde con cultivo celular campana UV luz 30 minutos antes de usar. A la mitad, voltear el molde para exponer las dos superficies.

2. Modificación de proteínas con un tiol libre

1. Preparar soluciones madre, utilizando cálculos de la hoja de cálculo para convertir aminas en grupos tiol en proteínas (tabla 1A).
   1. Para hacer el tampón de reacción, ajuste el PBS a pH 8 y añadir 5 mM EDTA. Tampón de reacción de pipeta a un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización de.
      Nota: El EDTA es importante, como protege tioles formando enlaces disulfuro. Grupos tiol deben permanecer en su forma reducida por la reacción ocurrir.
   2. Pesar 2-iminothiolane (Traut ' s reactivo) y disolver en buffer de reacción para la concentración de una solución de 2 mg/mL (14 mM). Pasar la solución por un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización. Almacenar la solución a 4 ° C por hasta varios meses.
      Nota: 2-iminothiolane es la molécula que reacciona con las aminas libres expuestos al solvente de las proteínas y las convierte en tioles gratis.
   3. Reconstituir la proteína en buffer de reacción a una concentración entre 0,1 y 1 mg/mL. A menos que previamente estéril, pipeta esta solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización de.
      Nota: Esta proteína es la señal bioquímica que va estampada en la superficie del hidrogel. También, mientras que las concentraciones de proteína pueden variar, concentraciones más altas son ideales para patrones de proteína mayor.
2. Reaccionar las proteínas con 2 iminothiolane mezclando dos soluciones madre; utilizar 1B de la tabla para calcular el ratio de volumen correcto. Normalmente, utilizar una relación molar de 2-iminothiolane de 8:1 a la proteína de.
   Nota: Para las proteínas más grandes o más diluir concentraciones, usar una mayor fracción molar de 2-iminothiolane. Consulte al fabricante ' s protocolo ¹⁵.
3. Incubar la reacción por 1 h a temperatura ambiente. Utilizar una micro-columna de desalación centrifugado para extraer el producto de la proteína thiolated los reactivos restantes, siguiendo el fabricante ' s protocolo ¹⁶.
   Nota: El límite de exclusión de esta resina es KDa 5.
4. Uso Ellman ' s de ensayo para medir cuantitativamente el número de tioles libres por proteína. Siga el fabricante ' protocolo de s para el ensayo ¹⁷.

3. Formación de hidrogel

1. crear la solución precursora de gel basada en valores calculados a partir de tabla 1. Mezclar el PEGDA, fibronectina, volúmenes de vuelta. Pipetear la solución vigorosamente para asegurar una solución homogénea y evitar la creación de burbujas. Mantener la solución protegida de la luz.
2. Pipetear la solución precursora de gel cuidadosamente entre los dos portaobjetos del molde del gel. Por lo general, añadir un volumen de entre 800 y 1.000 μl al molde. Exponga la solución del gel en el molde a la luz UV (longitud de onda: 365 nm, potencia: 3-4 mW/cm ²) por 1-2 min formar el hidrogel.
   Nota: No exponer el hidrogel a la luz UV prolongada, ya que limitará la proteína superficial patrones capacidades.
3. Quitar los clips de la carpeta y eliminar suavemente el portaobjeto superior aplicando frente a la presión a los espaciadores laterales.
4. Utilizar un punch de biopsia de tamaño adecuado para cortar las muestras de hidrogel. Perfore múltiples hidrogeles de rectángulo gel repeticiones y las muestras de control.

4. Medidas de rigidez de hidrogel

sacador de biopsia

1. Punch out hidrogeles con 8 mm de diámetro para un reómetro de placas paralelas de 8 mm. Cargar una muestra de hidrogel en el Reómetro (véase la Tabla de materiales).
2. Bajo la geometría de placas paralelas es de 8 mm de diámetro hasta hacer contacto con la superficie del gel. Mantenga una distancia de separación de 0,5 mm para una muestra de 0,5 mm de espesor hidrogel.
3. Realizar barridos de tiempo durante 5 minutos a la tensión de 0,1%, frecuencia de 0.1 Hz y 37 º C. promedio el G ' valores a través de cada barrido de tiempo. Funcionamiento independiente hidrogeles para réplicas de cada composición.
   Nota: La G ' valores deben ser estables a través de puntos de tiempo; Si no, colar por ciento y barridos de frecuencia se deben realizar para seleccionar los apropiados valores de ¹⁴.

5. Proteína patrón

1. preparar el patrón deseado de la fotomáscara utilizando un programa de diseño asistido por ordenador. Imprimir el photomask en una hoja transparente utilizando una impresora de alta resolución. Remoje el photomask en etanol al 70% para 10 minutos antes de usar. Seque el photomask al aire en una campana de cultivo celular antes de su uso.
2. Añadir la solución de proteína thiolated preparada en el paso 2 a la superficie del hidrogel para modelar superficial. Pipeta de 1-2 μl/cm ² de thiolated solución de proteína a la superficie de cada corte gel.
   Nota: Es importante minimizar el volumen de proteína; sólo añadir lo suficiente para cubrir uniformemente toda la superficie de la muestra de hidrogel.
3. Coloque con cuidado el photomask en la superficie del hidrogel. No permita que las burbujas de aire entre el photomask y la superficie del hidrogel. Suavemente presione la mascarilla para eliminar las posibles burbujas que se forman.
4. Exponer el hidrogel a una segunda ronda de la luz UV (longitud de onda: 365 nm, potencia: 3-4 mW/cm ²) de 30-60 s.
   Nota: Es importante el patrón de exposición a suficiente luz ultravioleta para crear un patrón fuerte sin causar la pérdida de función de la proteína.
5. Lave los hidrogeles con PBS para eliminar especies no reaccionadas y colocar cada hidrogel dentro de la placa de la pozo. Tenga cuidado al colocar los geles en cada pozo; Asegúrese de que la superficie estampada está boca arriba. Los geles de lavado en PBS a 4 ° C; los geles son estables por al menos dos semanas a 4 ° C.

6. Preparación de hidrogeles para la siembra de células

1. incubar los geles en medio basal durante 5-10 min a 37 ° C antes de la siembra. Células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs), utilizar medio EGM-2 sin factores de crecimiento. Minimizar el volumen del medio añadido a cada uno para evitar la flotación de hidrogel. Para una placa de 48 pozos, utilice un volumen de 250 μl de medio.
2. Vuelta abajo de la placa a 300 x g durante 3 minutos asegurar que los hidrogeles están situados en la parte inferior del pozo y no flotantes. Hacer esto inmediatamente antes de la siembra celular.

7. Siembra en los hidrogeles de la célula

1. uso procedimientos de cultivo de células de mamífero estéril estándar para la siembra de células y procedimientos experimentales. Saque de HUVECs de frascos de cultivo de tejidos, utilizando protocolos de separación celular estándar. Lavar el plato de cultivo de tejido con PBS estéril e incubar con tripsina para 3-5 min a 37 ° C.
2. Saciar la suspensión celular tripsinizaron con exceso celular medio o tripsina neutralizador solución.
3. Girar por la suspensión de células en la centrifugadora a 300 x g por 5 min con cuidado quite el sobrenadante y mantener el sedimento celular.
4. Resuspender el precipitado de células en el EGM-2 basal sin factores de crecimiento. Utilizar un hemocitómetro para recuento celular.
Superficie de
5. añadir 75.000 células/cm ² para cada hidrogel transfiriendo poco a poco en el centro de cada bien para no molestar a los geles. Coloque la placa de la pozo en una incubadora de cultivo de células a 37 ° C. Para varios días, periódicamente Retire el plato para la observación de.

8. Evaluación de bioactividad

1. cultura e. coli durante la noche en suspensión en caldo LB en una orbital suspensión a 37 ° C y 200 rpm. Desactivación de la cultura de e. coli, decantar y reconstituir el precipitado de células en volumen mínimo de PBS. Pesar la lisozima y reconstituir en 1 mg/mL de la solución.
2. Pipetear un volumen pequeño (25 μl) de solución stock de lisozima en tubos de microcentrífuga. Añadir diferentes niveles de fotoiniciador de vuelta (0-12 mM) y exponer las muestras a 1 minuto de la luz UV. En un grupo separado, agregue la misma cantidad de vueltas (2 mM) a solución de lisozima y exponer las muestras a diferentes tiempos de luz UV (0-4 min). Son repeticiones para cada tratamiento.
Solución de
3. Agregar un volumen igual de concentrada e. coli para cada muestra de lisozima a una concentración de proteína lisozima final de 0,5 mg/mL. Incubar las soluciones mixtas de 4 h a temperatura ambiente.
   Nota: Esto permite tiempo para lisozima funcional lisar la pared celular bacteriana y liberar las proteínas en la solución de.
4. Uso lisozima no tratada se incubaron con e. coli para un control positivo, considera esto una medida bioactivos del 100%. Use una solución de lisozima se incubaron con PBS solo como control negativo.
5. Vuelta abajo las muestras para eliminar restos celulares y conservar el sobrenadante. Ejecutar un ensayo de Bradford para cuantificar la concentración total de proteína en el sobrenadante para medir la cantidad de lisado bacteriano.
6. Ejecutar un ensayo de Bradford tras el fabricante ' s protocolo ¹⁸. Calcular el doble cambio en la concentración de proteína en comparación con el control negativo.

Results

El protocolo para crear patrones bioactivos en la superficie del hidrogel de PEG se ilustra en la figura 1. Una hoja de cálculo fue desarrollado para calcular el volumen y la concentración de cada solución madre (tabla 1A). Modificación de proteínas para ser inmovilizado sobre la superficie de la hidrogel con 2-iminothiolane (figura 1B). Esta reacción se realiza utilizando los volúmenes del

Discussion

Este protocolo proporciona un método para la creación de patrones de proteínas bioactivas para aplicaciones biológicas. Hay varias modificaciones que pueden realizarse para adaptarse a este protocolo para diversos experimentos. En primer lugar, requisitos de accesorio celular variará para diferentes tipos de células. Si inicialmente se observa un apego pobre celular a los geles, aumentando la concentración de la proteína de la ECM en la solución precursora se recomienda. Otras proteínas de la ECM se pueden utilizar en lu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrilato (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	También se puede sintetizar o comprar a través de otros vendedores. Se pueden utilizar diferentes pesos moleculares.
Litio Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)			Sintetizado en laboratorio
Fibronectina	Corning 356008		Se pueden utilizar otras proteínas de unión celular, como laminina, matrigel
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Impresiones personalizadas en hojas transparentes con DPI de alta resolución.
Clips de carpeta	Varios proveedores
Fuente de luz UV compacta (365 nm)	UVP	UVP-21	Se pueden utilizar otras fuentes de luz UV, se requiere calibración de la potencia.
2-iminotiolano (Pierce Traut' s Reactivo)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Reactivo: DTNB; 5,5-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)	Thermo Sci.	22582
células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs)	Lonza		entre 6-10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 sin factores de crecimiento se utilizó en experimentos. Se utilizaron medios EGM-2 completos para el mantenimiento de la célula
0,25% de tripsina EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralizador de tripsina	Life Tech	R-002-100
Centrífuga	Varios vendedores
Hemocitómetro	Hausser Sci. Línea brillante
Etilendiaminoácido tetraacético (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0.22 y micro; m filter	Cell Treat	229743
1mL Jeringa de
vidrio Portaobjetos de microscopio	Fisher Sci.	12-550C
Espaciadores de plástico	Varios proveedores 0,5		mm de espesor
70% Etanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Bradford Reagent	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Columnas Microspin	Thermo Sci.
reemplazador AR-G2	TA Instruments