Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

Summary

En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .

Abstract

Hay muchos estímulos biológicos que pueden influir en la diferenciación celular de comportamiento y la célula de vástago. General de la célula cultura enfoques dependen de factores solubles en el medio al control celular comportamiento. Sin embargo, adiciones solubles no pueden imitar ciertos motivos, como factores de crecimiento de la matriz-limite de señalización, célula señalización y espaciales señales bioquímicas, que son influencias comunes en las células. Además, propiedades biofísicas de la matriz, como rigidez de sustrato, desempeñan papeles importantes en el destino de la célula, que no es manipulada fácilmente usando celular convencional, prácticas de cultivo. En este método, se describe un protocolo sencillo para proporcionar proteínas bioactivas modeladas en hidrogel sintético polietileno glicol (PEG) con fotoquímica. Esta plataforma permite el control independiente de la rigidez de sustrato y las señales bioquímicas espaciales. Estos hidrogeles pueden lograr una amplia gama de valores de rigidez fisiológicamente relevantes. Además, las superficies de estos hidrogeles pueden ser photopatterned con péptidos bioactivos o proteínas vía tiol-ene en las reacciones química. Estos métodos han sido optimizados para retener la función de la proteína después de la inmovilización de superficie. Se trata de un protocolo versátil que se puede aplicar a cualquier proteína o péptido de interés para crear una variedad de patrones. Finalmente, las células sembradas en las superficies de estos hidrogeles bioactivos pueden controlarse con el tiempo, como responden a señales específicas espacial.

Introduction

Hay muchos estímulos que influyen en comportamiento celular. En general, técnicas de cultivo de célula típica dependen de factores solubles que provocan respuestas celulares; sin embargo, existen limitaciones a este enfoque. Estos métodos no son capaces de mostrar con precisión todos motivos señalización comúnmente en vivo. Tales mecanismos de señalización incluyen factores de crecimiento secuestradas, célula de señalización y señales bioquímicas espacial específica. Además, rigidez de sustrato puede jugar un papel importante en la diferenciación de comportamiento y célula de vástago de la célula y no se manipula fácilmente usando el cultivo común de la célul....

Protocol

1. preparación de materiales para la síntesis de hidrogel

1. Preparar soluciones madre de PEGDA, fenil litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) y fibronectina en condiciones estériles y en cálculos (tabla 1A).
   1. Pesar y disolver compuestos en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por lo general, mantener PEGDA concentraciones entre 50 y 200 mg/mL (5-20% peso/volumen) de solución de trabajo. Pipetear la solución PEGDA a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización de.
      Nota: Mantenga las soluciones PEGDA cubiertas con una papel de embalaje para proteger de la luz. Preparar una solución fresca de PEG....

Results

El protocolo para crear patrones bioactivos en la superficie del hidrogel de PEG se ilustra en la figura 1. Una hoja de cálculo fue desarrollado para calcular el volumen y la concentración de cada solución madre (tabla 1A). Modificación de proteínas para ser inmovilizado sobre la superficie de la hidrogel con 2-iminothiolane (figura 1B). Esta reacción se realiza utilizando los volúmenes del

Discussion

Este protocolo proporciona un método para la creación de patrones de proteínas bioactivas para aplicaciones biológicas. Hay varias modificaciones que pueden realizarse para adaptarse a este protocolo para diversos experimentos. En primer lugar, requisitos de accesorio celular variará para diferentes tipos de células. Si inicialmente se observa un apego pobre celular a los geles, aumentando la concentración de la proteína de la ECM en la solución precursora se recomienda. Otras proteínas de la ECM se pueden utilizar en lu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrilato (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	También se puede sintetizar o comprar a través de otros vendedores. Se pueden utilizar diferentes pesos moleculares.
Litio Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)			Sintetizado en laboratorio
Fibronectina	Corning 356008		Se pueden utilizar otras proteínas de unión celular, como laminina, matrigel
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Impresiones personalizadas en hojas transparentes con DPI de alta resolución.
Clips de carpeta	Varios proveedores
Fuente de luz UV compacta (365 nm)	UVP	UVP-21	Se pueden utilizar otras fuentes de luz UV, se requiere calibración de la potencia.
2-iminotiolano (Pierce Traut' s Reactivo)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Reactivo: DTNB; 5,5-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)	Thermo Sci.	22582
células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs)	Lonza		entre 6-10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 sin factores de crecimiento se utilizó en experimentos. Se utilizaron medios EGM-2 completos para el mantenimiento de la célula
0,25% de tripsina EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralizador de tripsina	Life Tech	R-002-100
Centrífuga	Varios vendedores
Hemocitómetro	Hausser Sci. Línea brillante
Etilendiaminoácido tetraacético (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0.22 y micro; m filter	Cell Treat	229743
1mL Jeringa de
vidrio Portaobjetos de microscopio	Fisher Sci.	12-550C
Espaciadores de plástico	Varios proveedores 0,5		mm de espesor
70% Etanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Bradford Reagent	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Columnas Microspin	Thermo Sci.
reemplazador AR-G2	TA Instruments