Medición simultánea de HDAC1 y HDAC6 actividad en HeLa células usando UHPLC-MS

Resumen

El presente método sirve para identificar inhibidores de la isoforma específica de histona deacetilasas (HDAC) en células HeLa por el análisis UHPLC-MS de múltiples sustratos. Este es un método libre de anticuerpos desarrollado para reflejar actividad HDAC1 y HDAC6 en la vida del ambiente celular, en contraste con solo isoform análisis sin células.

Resumen

La búsqueda de nuevos inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) es de creciente interés en el descubrimiento de medicamentos. Isoforma selectividad ha sido el centro de atención desde la aprobación de la romidepsina, una clase que las HDACS inhibidor para el tratamiento del cáncer y la investigación clínica de los inhibidores de la HDAC6 específico para el mieloma múltiple. El presente método permite determinar la actividad inhibitoria de los compuestos de prueba en HDAC1 y HDAC6 en las células. La actividad de la isoforma se mide utilizando la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-análisis de espectrometría de masas (UHPLC-MS) de sustratos específicos que se incubaron con células HeLa tratadas y no tratadas. El método tiene la ventaja de reflejar la actividad HDAC endógena dentro del entorno de la célula, en contraste con ensayos bioquímicos sin células en isoformas aislado. Por otra parte, porque se basa en la cuantificación de sustratos sintéticos, el método no requiere el reconocimiento de anticuerpos de proteínas endógenas acetilados. Es fácilmente adaptable a varias líneas celulares y un proceso automatizado. El método ya ha demostrado ser útil en la búsqueda de compuestos HDAC6 selectivo en neuroblastos. Aquí se muestran resultados representativos con el estándar HDAC inhibidores tricostatina A (no específica), MS275 (HDAC1-específica), y tubastatin (HDAC6-específico) con células HeLa.

Introducción

Las HDACs pertenecen a una familia de enzimas capaces de deacetylate histonas dentro de la estructura de la cromatina. También tienen otros substratos de la proteína en el citosol y se encuentran en diferentes compartimentos celulares. Un total de 18 HDAC isoformas se han identificado hasta ahora y se han relacionado con varios mecanismos de la célula, incluyendo la regulación de factores de transcripción y expresión génica, así como la señalización celular y transporte^1,2,3,4,5,

Protocolo

1. cultivo celular

Nota: Los siguientes pasos se realizan en una campana de cultivo de tejidos estándar. Se espera que la familiaridad con técnica estéril.

1. Cultivo de células HeLa a confluencia del 80% en un matraz de cultivo celular T75 en MEM suplementado con 10% suero fetal bovino, penicilina G (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/mL).
   Nota: Cultura, el tratamiento y pasos de lisis celular se llevan a cabo bajo flujo laminar, con pasos de incubación de células a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% CO₂ en condiciones estériles.
2. Lavan las células dos veces con 5 mL de DPBS, aspirar la DPBS y añadir....

Resultados

Para demostrar la aplicación del método para identificar inhibidores selectivos y no selectivos para HDAC1 (clase I) y HDAC6 (clase IIb), las células HeLa fueron tratadas con compuestos estándar conocidos: tricostatina A (no selectivo entre HDAC1 y HDAC6)¹⁸y MS275 (inhibidor selectivo de HDAC1)¹⁹tubastatin (inhibidor selectivo de HDAC6)²⁰. Mediante el método actual (figura 1), valores de .......

Discusión

Inhibición de la HDAC es un tema candente en el descubrimiento de medicamentos, con un enfoque actual en HDAC6 selectivo inhibidores de cáncer terapia²¹. Selectividad HDAC es evaluado generalmente por una serie de ensayos de alto rendimiento, libres de células, que pretenden determinar la potencia inhibitoria hacia individuales HDAC isoformas²¹. Sin embargo, la selectividad de un inhibidor debe ser además confirmada en las células vivas por evaluar el estado de acetilación .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	Sinónimo: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Tricosastatina A	Sigma-Aldrich	T8552
Tubastatina A	Sigma-Aldrich	SML0044
Acetonitrilo, grado HPLC	Fisher Scientific	10660131
ácido fórmico, grado LC/MS	Fisher Scientific	10596814
H2O, H	2O destilado de grado
Células	HeLa ATCC	ATCC CRM-CCL-2
Disociación celular reactivo TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, grado de cultivo celular	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
Suero fetal bovino	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
Penicilina-Estreptomicina	Bioconcept	4-01F00-H
10x Tampón RIPA	Abcam	ab156034
SigmaFast comprimidos inhibidores de la proteasa	Sigma-Aldrich	S8820
Placas de 96 pocillos, estériles, de fondo plano, tratadas con cultivo de tejidos Corning	VWR	29442-058
Placas de 96 pocillos, no estériles, con fondo en V Corning	VWR	29442-404	utilizadas en la etapa de centrifugación
Placa de 96 pocillos, fondo cónico, Nunc	ThermoFisher Scientific	249944	compatible con el sistema Acquity UHPLC
Matraces de cultivo celular T75 Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
Lámina de termosellado pelable	Sistema	186002789
Acquity	de Waters Centrífuga Eppendorf de Waters
5810 R	Fisher Scientific	05-413-323
Software de integración: MassLynx V4.1	Waters		Número de catálogo no disponible
Termoselladora combinada SP-0669/240	Waters		Número de catálogo no disponible
Quattro micro API Tandem Quadrupole System	Waters		Número de catálogo no disponible

HPLC filtrado a través de un sistema de purificación Milli-Q UPLC