Artículo de método
Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.
La electroporación in utero es un enfoque rápido y poderoso para estudiar el proceso de migración radial en la corteza cerebral de los embriones de ratón en desarrollo. Ha ayudado a describir los diferentes pasos de la migración radial y caracterizar los mecanismos moleculares que controlan este proceso. Para analizar directa y dinámicamente las neuronas migratorias tienen que ser rastreadas con el tiempo. Este protocolo describe un flujo de trabajo que combina la electroporación in utero con cultivo de corte organotípico y confocal de tiempo transcurrido, lo que permite un examen directo y análisis dinámico de las neuronas corticales que migran radialmente. Además, es posible la caracterización detallada de las neuronas migratorias, como la velocidad de migración, los perfiles de velocidad, así como los cambios de orientación radial. El método puede adaptarse fácilmente para realizar análisis funcionales de genes de interés en neuronas corticales de migración radial por pérdida y ganancia de función así como experimentos de rescate. Lapso de tiempoLa formación de imágenes de las neuronas migratorias es una técnica del estado de la técnica que una vez establecida es una potente herramienta para estudiar el desarrollo de la corteza cerebral en modelos de ratón de trastornos de migración neuronal.
El neocórtex es el sitio principal de funciones cognitivas, emocionales y sensoriomotoras. Se compone de seis capas horizontales orientadas en paralelo a la superficie del cerebro. Durante el desarrollo, las células progenitoras en la pared lateral del telencéfalo dorsal dan lugar a neuronas de proyección que migran radialmente hacia la superficie pial y adquieren una identidad neuronal específica del tipo de capa. Después de ser generadas en las zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ) estas neuronas se vuelven transitoriamente multipolar y retardan su migración. Después de una corta estancia en la zona intermedia (IZ) cambian a una morfología bipolar, se a....
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Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal (Regierungspräsidium Tübingen) y llevados a cabo de acuerdo con la Ley alemana de Bienestar Animal y la Directiva UE 2010/63 / EU.
1. En Utero Electroporación
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Anteriormente, hemos demostrado que la deleción genética de Bcl11a por electroporación in utero perjudica la migración radial de finales de nacido de capa superior de las neuronas de proyección [ 10] . La electroporación de un vector de plásmido de ADN que contiene Cre-IRES-GFP eliminó eficazmente Bcl11a en cerebros Bx11a flox / flox condicionales 11 . Cuando se analizaron los cerebros.......
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La migración radial es un proceso clave en el desarrollo del neocórtex. Mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de este proceso puede causar graves malformaciones corticales, incluida la lissencefalia y la materia blanca heterotopia [ 1 , 2] . Recientemente demostró que Bcl11a, que se expresa en jóvenes neuronas de proyección cortical migratorias, desempeña un papel en la migración radial. Utilizamos imágenes confocales de lapso de tiempo de las .......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecemos a Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka y Matthias Toberer por su excelente asistencia técnica, así como a Victor Tarabykin por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por una concesión de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| isoflurano | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 351146 | |
| placa de 12 pocillos | Corning | 351143 | |
| sutura quirúrgica no absorbible | Ethicon | K890H | 3/8 círculo, 13 mm, punta cónica |
| Micro Adson Pinzas Fine | Science Tools | 11018-12 | dentado, longitud: 12 cm |
| tijeras finas | Fine Science Tools | 14063-09 | angulado hacia un lado, longitud: 9 cm |
| Portaagujas Mathieu Fine | Science Tools | 12510-14 | carburo de tungsteno, longitud: 14 cm |
| pinzas de punta fina | Fine Science Tools | 11370-40 | recta, 11 cm |
| Vannas Tü Tijeras de resorte bingen | Fine Science Tools | 15005-08 | en ángulo hacia arriba, |
| pinza de anillo | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3 mm, ID, 2,2 mm, longitud: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030081 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| suero de caballo | Gibco | ||
| capilares de vidrio de | BME Gibco | 41010026 | |
| Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm | |
| sistema de anestesia | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| cámara de anestesia | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| cartucho de filtro fluosorber | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| agarosa de bajo punto de fusión | Invitrogen | 16520100 | |
| micrótomo de cuchilla vibratoria | Leica | VT1200 S | |
| microscopio estereoscópico de fluorescencia | Leica | M205 FA | |
| microscopio estereoscópico | Leica | M125 | |
| microscopio de cultivo de tejidos de fluorescencia invertida | Leica | DM IL LED | |
| microscopio de barrido láser confocal | Detector híbrido Leica | TCS SP5II | |
| Objetivo | Leica | HyD | |
| , 40x/0.60 NA | 11506201 | ||
| Leica Life Imaging Services | Cube, Brick & Inserto | ||
| Millipore | PICM0RG50 | ||
| micromolinillo | Narishige | EG-45 uso de | ángulo de 38 grados para biselar |
| el microinyector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofeno | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Molde |
| emdedding | Polysciences | 18986-1 | |
| plásmido libre de endotoxinas maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminina | Sigma | L2020 | |
| poli-L-lisina | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucosa | Sigma | G6152 | |
| cloruro de calcio | Sigma | C7902 | |
| sulfato de magenio | Sigma | M2643 | |
| bicarbonato de sodio | Sigma | S6297 | |
| electroporador de onda cuadrada | Sonidel | CUY21EDIT | |
| pinzas con electrodos de disco de platino de 5 mm | Sonidel | CUY650P5 | |
| extractor de micropipetas | Sutter Instrument | P-97 | |
| caja de filamento | Sutter Instrument | FB255B | 2,5 mm x 2,5 mm |
| espátula de microcuchara | VWR | 231-0191 Plato con fondo de | 185 mm x 5 mm |
| , 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
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