Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.
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Artículo de método
Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario
En este artículo
Resumen
Resumen
La electroporación in utero es un enfoque rápido y poderoso para estudiar el proceso de migración radial en la corteza cerebral de los embriones de ratón en desarrollo. Ha ayudado a describir los diferentes pasos de la migración radial y caracterizar los mecanismos moleculares que controlan este proceso. Para analizar directa y dinámicamente las neuronas migratorias tienen que ser rastreadas con el tiempo. Este protocolo describe un flujo de trabajo que combina la electroporación in utero con cultivo de corte organotípico y confocal de tiempo transcurrido, lo que permite un examen directo y análisis dinámico de las neuronas corticales que migran radialmente. Además, es posible la caracterización detallada de las neuronas migratorias, como la velocidad de migración, los perfiles de velocidad, así como los cambios de orientación radial. El método puede adaptarse fácilmente para realizar análisis funcionales de genes de interés en neuronas corticales de migración radial por pérdida y ganancia de función así como experimentos de rescate. Lapso de tiempoLa formación de imágenes de las neuronas migratorias es una técnica del estado de la técnica que una vez establecida es una potente herramienta para estudiar el desarrollo de la corteza cerebral en modelos de ratón de trastornos de migración neuronal.
Introducción
El neocórtex es el sitio principal de funciones cognitivas, emocionales y sensoriomotoras. Se compone de seis capas horizontales orientadas en paralelo a la superficie del cerebro. Durante el desarrollo, las células progenitoras en la pared lateral del telencéfalo dorsal dan lugar a neuronas de proyección que migran radialmente hacia la superficie pial y adquieren una identidad neuronal específica del tipo de capa. Después de ser generadas en las zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ) estas neuronas se vuelven transitoriamente multipolar y retardan su migración. Después de una corta estancia en la zona intermedia (IZ) cambian a una morfología bipolar, se adhieren al andamio glial radial, y continúan la migración orientada radialmente hacia la placa cortical (CP). Al alcanzar su objetivo final, las neuronas se separan de los procesos radiales de la glía y adquieren una identidad específica de la capa. Las mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de la migración neuronal pueden causar malformaciones corticales graves, tales como lissencEferencia o heterotopía de la materia blanca 1 , 2 .
La electroporación in utero es una técnica rápida y potente para transfectar células progenitoras neurales en el cerebro en desarrollo de embriones de roedores 3 , 4 . Con esta técnica es posible desmontar y / o sobreexpresar genes de interés con el fin de estudiar sus funciones en el desarrollo de neuronas. Este método ha ayudado específicamente a describir los detalles morfológicos y caracterizar los mecanismos moleculares del proceso de migración radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Las neuronas que migran radialmente experimentan cambios dinámicos en la forma celular, velocidad de migración, así como la dirección migratoria, que requieren observación directa y continua a lo largo del tiempo. Organotypic slice cultuRe y time-lapse imágenes confocales de cerebros electroporados permiten observar directamente las neuronas migratorias con el tiempo. Utilizando este enfoque combinado, es posible analizar características distintas de las neuronas migratorias que no pueden ser investigadas en secciones de tejido fijas de cerebros electroporados.
Recientemente hemos aplicado imágenes confocales de lapso de tiempo de migración de neuronas en cultivos de rebanada de cerebro electroporado para estudiar el papel de la CL de células de factor B de transcripción / linfoma 11a (Bcl11a) durante el desarrollo cortical 10 . Bcl11a se expresa en jóvenes neuronas corticales migratorias y se utilizó un alelo condicional Bcl11a ( Bcl11a flox ) 11 para estudiar sus funciones. La electroporación de la recombinasa Cre junto con la proteína fluorescente verde (GFP) en los progenitores corticales de los cerebros flox / flox Bcl11a nos permitió crear una situación de mutante de mosaico, en la que sólo unas pocas células se mutan en unaDe lo contrario de tipo salvaje de fondo. De esta manera, fue posible estudiar las funciones autónomas de células de Bcl11a en el nivel de célula única. Hemos encontrado que Bcl11a mutante neuronas muestran velocidad reducida, cambios en sus perfiles de velocidad, así como al azar-como orientación cambios durante su migración [ 10] . En el protocolo descrito describimos un flujo de trabajo para la electroporación exitosa y la preparación del cultivo en rebanadas 12 de cerebros de ratón, así como imágenes confocales en intervalos de tiempo de cultivos de corte cortical.
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal (Regierungspräsidium Tübingen) y llevados a cabo de acuerdo con la Ley alemana de Bienestar Animal y la Directiva UE 2010/63 / EU.
1. En Utero Electroporación
- Agujas de microinyección
- Tirar capilares de vidrio borosilicato (diámetro exterior: 1,0 mm, diámetro interior: 0,58 mm, longitud: 100 mm) en agujas de microinyección utilizando un extractor de micropipeta con un filamento de caja (2,5 mm x 2,5 mm) y el siguiente programa: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, y DELAY: 140. Determine el valor HEAT para cada filamento individual realizando una prueba RAMP (HEAT value: RAMP + 25).
- Agujas biseladas en un ángulo de 38 ° y velocidad de revolución intermedia a alta con un microgrinder para obtener un tamaño de punta de 20 a 30 μm para inyección en el día embrionario (E) 13,5 o menor y de 30 a 40 μm para inyección en células embrionarias más viejasEtapas. Para el almacenamiento, fije las agujas en una caja o en una placa de Petri con arcilla de modelado para evitar daños en las puntas.
- Solución de ADN plasmídico
- Preparar una construcción de ADN plasmídico que contenga proteína reportera fluorescente ( por ejemplo GFP) usando un kit de preparación maxi sin endotoxina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Diluir la solución de ADN plasmídico a una concentración final de 1 - 2 μg / μl en tampón Tris-EDTA libre de endotoxina que contiene Fast Green a una concentración final de 0,01%. Una solución alícuota y almacenar a -20 ° C.
- Solución Bacteriostatica de Cloruro de Sodio
- Preparar solución bacteriostática de cloruro sódico añadiendo alcohol bencílico a una concentración final de 0,9% a una solución isotónica de cloruro de sodio al 0,9%. Solución de filtro estéril inmediatamente antes de su uso.
- Carprofen Solución de inyección
- Preparar la solución de inyección de carprofenoAñadiendo carprofeno a una concentración final de 0,5 mg / ml a una solución isotónica estéril de cloruro de sodio al 0,9%. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 28 días.
- Anestesia, Inyección de ADN y Electroporación
- Pesar un ratón E14.5 cronometrado-embarazado y colocarlo en una cámara de anestesia transparente conectado a un vaporizador y saturado con isoflurano al 5%. Cuando el animal está inconsciente, transfiéralo a una mascarilla anestesiadora unida a una placa calentadora a 37 ° C y manténgala anestesiada con 1,8-2,2% de isoflurano.
Nota: Evalúe el desarrollo de la anestesia quirúrgica por la pérdida de pellizco de la cola y los reflejos del pedal (pinzamiento del dedo del pie). - Para la analgesia, inyectar 100 μL de solución de inyección de carprofeno por cada 10 mg de peso corporal de ratón (5 mg / kg de peso corporal) por vía subcutánea. Gire el ratón con la espalda hacia abajo y cubra cuidadosamente los ojos con vaselina para evitar que se sequen.
- Extienda suavemente las extremidades y fíjelasA la placa de calentamiento con cinta quirúrgica. Esterilizar el abdomen con etanol al 70% seguido de solución de yodo (7,5 mg / ml) usando hisopos de celulosa. Repita este procedimiento tres veces para asegurar una desinfección adecuada.
- Cubra el abdomen con una gasa estéril en la que se ha cortado una incisión para recoger un campo (diámetro: 2 - 2,5 cm) para la incisión abdominal. Humedecer la gasa con solución bacteriostática de cloruro sódico.
Precaución: Reevalúe el desarrollo de la anestesia quirúrgica mediante la pérdida del reflejo del pedal. - Usando pinzas Micro Adson (dentadas, longitud: 12 cm) y tijeras finas (anguladas a la cara, longitud: 9 cm) cortar la piel aproximadamente 1,5 cm a lo largo de la línea media del abdomen. Corte el músculo subyacente a lo largo de la linea alba.
- Quitar un cuerno uterino con pinzas anulares (longitud: 9 cm, diámetro exterior: 3 mm, diámetro interior: 2,2 mm) y colocarlo suavemente sobre la gasa humedecida.
Precaución: Sostener el cuerno uterino con pinzas anulares sólo entre embriones yD no perturbar las placentas o cualquier recipiente de suministro. Mantenga el útero húmedo en todo momento con solución bacteriostática de cloruro sódico. - Coloque con cuidado un embrión con pinzas anulares y localice el ventrículo lateral, que se presenta como una sombra en forma de media luna paralela al seno sagital. El punto de inyección se encuentra aproximadamente en el centro de una línea entre el ojo pigmentado y la confluencia de los senos, donde el seno sagital se ramifica a dos senos transversales. Empuje la aguja de microinyección a través de la pared uterina y hacia el ventrículo lateral.
Nota: Si es necesario, la profundidad de la inyección puede ser corregida por retracción de la aguja. - Inyecte 1 a 2 μl de solución de ADN en el ventrículo lateral con un microinyector que se acciona con un pedal, utilizando los siguientes ajustes: 25 psi, 10 a 20 ms por pulso y 5 a 10 pulsos. La inyección exitosa puede ser monitorizada por la solución de ADN coloreada, que debe llenar el sistema ventricular.
- Coloque los electrodos tipo pinzas (3 mm de diámetro para E13.5 o menos y 5 mm de diámetro para E14.5 o mayores) de tal manera que el terminal "positivo" esté del mismo lado que el ventrículo inyectado y el terminal "negativo" Terminal está en el lado opuesto del ventrículo inyectado debajo de la oreja de la cabeza del embrión.
- Humedezca el sitio de electroporación con unas gotas de solución bacteriostática de cloruro de sodio y aplique 5 pulsos de corriente eléctrica (35 V para E13.5 o menos y 40 V para E14.5 o mayores) de 50 ms de duración con intervalos de 950 ms.
Nota: Las corrientes de 60 a 90 mA son usualmente suficientes para una electroporación exitosa. Las corrientes más bajas no transfectan eficientemente las neuronas, mientras que las corrientes más altas pueden conducir a la muerte embrionaria. - Repita el procedimiento (ver los pasos 1.5.7 a 1.5.10.) Para cada embrión del cuerno uterino y colóquelo suavemente en la cavidad abdominal.
- Quite el cuerno uterino del otro lado y repita el procesoDescrito en el paso 1.5.7. A 1,5.11.
- Cierre la cavidad abdominal suturando la capa muscular antes de suturar la piel usando fórceps Micro Adson, soporte de aguja Mathieu (carburo de tungsteno, longitud: 14 cm) y sutura quirúrgica no absorbible (3/8 de círculo, 13 mm).
Precaución: Tenga cuidado de no capturar el útero u otros órganos durante la sutura. - Desinfecte cuidadosamente la sutura de la piel con solución de yodo (7,5 mg / ml) y elimine suavemente el exceso periocular de vaselina usando hisopos de celulosa. Coloque el ratón debajo de una lámpara infrarroja hasta que se despierte. Vigilar de cerca el ratón durante los próximos dos días. Repita el tratamiento analgésico como se describe en el paso 1.5.2 después de 12 a 24 h.
- Pesar un ratón E14.5 cronometrado-embarazado y colocarlo en una cámara de anestesia transparente conectado a un vaporizador y saturado con isoflurano al 5%. Cuando el animal está inconsciente, transfiéralo a una mascarilla anestesiadora unida a una placa calentadora a 37 ° C y manténgala anestesiada con 1,8-2,2% de isoflurano.
2. Cultivo organístico de la rebanada
- Laminin Stock Solution
- Disolver 1 mg de laminina liofilizada en agua estéril para obtener una solución madre de laminina de 1 mg / ml. Preparar alícuotas de 50 μL aAlmacenar a -80 ° C.
- Solución de inventario de poli-L-lisina
- Disolver 50 mg de poli-L-lisina en agua estéril para obtener una solución madre de poli-L-lisina de 1 mg / ml. Preparar alícuotas de 0,5 ml y almacenar a -20 ° C.
- Solución completa de sal equilibrada de Hank (HBSS completo)
- Preparar HBSS completo combinando 50 ml de solución de HBSS 10x, 1,25 ml de tampón HEPES 1 M (pH 7,4), 15 ml de solución de D-glucosa 1 M, 5 ml de solución de cloruro de calcio 100 mM, 5 ml de sulfato de magnesio 100 mM , Y 2 ml de solución 1 M de hidrogenocarbonato de sodio. Añadir agua estéril hasta 0,5 L, filtro estéril, y almacenar a 4 ° C.
- Medio de cultivo de la rebanada
- Combine 35 ml de Eagle Basal Medium (BME), 12,9 ml de HBSS completo (ver sección 2.3.1.), 1,35 ml de D-glucosa 1 M, 0,25 ml de L-glutamina 200 mM y 0,5 ml de penicilina-estreptomicina a Obtener 50 ml de cultivo en rebanadasmedio. Filtro estéril y añadir suero de caballo a una concentración final del 5%. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
- Solución de Agarosa de bajo punto de fusión (LMP)
- Preparar solución de agarosa LMP al 3% disolviendo 1,5 g de agarosa LMP en 50 ml de HBSS completo calentando en un horno de microondas durante 1 a 2 min a potencia intermedia.
Nota: Controle cuidadosamente el calor para evitar que se desborde durante la ebullición. - Colocar la solución en un baño de agua a 38 ° C hasta que esté lista para su uso. Guarde a 4 ° C y reutilice una vez.
- Preparar solución de agarosa LMP al 3% disolviendo 1,5 g de agarosa LMP en 50 ml de HBSS completo calentando en un horno de microondas durante 1 a 2 min a potencia intermedia.
- Revestimiento de insertos de membrana
- Añadir una alícuota de la solución madre de laminina (véase el paso 2.1.1.) Y una alícuota de solución madre de poli-L-lisina (véase el paso 2.2.1.) A 6 ml de agua estéril para obtener una solución de revestimiento (suficiente para 6 insertos) .
- Coloque los insertos de membrana en una placa de 6 pocillos que contenga 2 mL de agua estéril en el fondo de cada pocillo. Añadir 1 ml de solución de revestimiento(Véase el paso 2.6.1.) Encima de cada membrana e incubar durante la noche a 37ºC y atmósfera de dióxido de carbono al 5%.
Nota: Únicamente utilice insertos con membranas ópticamente transparentes, como la membrana de PTFE (politetrafluoroetileno). - Lavar las membranas tres veces con 1 mL de agua estéril y secar. Utilizar membranas recubiertas el mismo día o almacenar en una placa limpia de 6 pocillos a 4 ° C durante un máximo de cuatro semanas.
- Disección cerebral e incorporación
- Dos días después de la electroporación colocar el ratón en una cámara transparente conectada a un vaporizador y saturada con isoflurano al 5%. Cuando el animal está inconsciente, sacarlo de la cámara y sacrificarlo por dislocación cervical.
- Retire el útero que contiene los embriones y colóquelo en una placa de Petri de 10 cm con HBSS completo helado.
Nota: A partir de este momento, mantenga todas las soluciones, embriones y cerebros en hielo. - Utilice un estereomicroscopio, fórceps con punta fina (recta,11 cm) y un par de tijeras Vannas Tübingen Spring (anguladas, longitud: 9,5 cm) para separar cada embrión del útero y transferirlo a otra placa de Petri que contenga HBSS completo helado.
- Haga una incisión a nivel del tronco cerebral y corte a lo largo de la línea media sagital. Despegue la piel y el cartílago que cubre el cerebro. Luego, corte el tronco cerebral justo detrás de los hemisferios y retire el cerebro del cráneo. Transferir el cerebro con una espátula de micro-cuchara (185 mm x 5 mm) a una placa de 12 pocillos que contenga HBSS completo helado. Recoja todos los cerebros de la litera en la placa de 12 pocillos.
- Utilice un estereomicroscopio fluorescente para examinar los cerebros en la placa de 12 pocillos para obtener brillo de fluorescencia así como el tamaño de la región electroporada. Seleccione de 2 a 4 cerebros con señales fluorescentes brillantes en la corteza somatosensorial presuntiva para su posterior procesamiento.
- Vierta la solución de agarosa LMP al 3% mantenida a 38 ° C en un molde de incrustación desechable desechable. EliminarE del cerebro de la placa de 12 pocillos con una espátula de micro-cuchara y drene cuidadosamente el exceso de HBSS completo alrededor del cerebro usando papel de seda fino.
- Colocar el cerebro suavemente en la solución de agarosa, empujarlo hasta el fondo del molde y ajustar cuidadosamente su posición usando una aguja de calibre 20. Para las secciones coronales, orientar el cerebro con los bulbos olfativos apuntando hacia arriba. Mantenga el molde sobre hielo hasta que la solución de agarosa se solidifique y continúe con la sección del cerebro.
- Sección de Vibratome y Cultura de Slice
- Retire el bloque de agarosa del molde y colóquelo en la tapa de una placa petri estéril. Corte el exceso de agarosa con una cuchilla de afeitar limpia dejando aproximadamente 2 a 3 mm por debajo de los bulbos olfativos y 1 mm de agarosa en los otros lados. Fijar el bloque de agarosa recortado con los bulbos olfativos apuntando hacia abajo a una etapa de muestra usando pegamento de cianoacrilato.
Nota: Esterilizar instrumentos y equipos con un 70% de etanoL antes de cortar. - Transferir la etapa de la muestra a la cámara de corte de un micrótomo de lámina vibrante que contiene HBSS completo helado y colocar el cerebro con su lado dorsal hacia la hoja. Cortar cortes cerebrales de 250 μm de grosor que contienen la región electroporada con una amplitud de baja a moderada de 0,9 mm y una velocidad de corte muy lenta de 0,09-0,12 mm / s. Usualmente se obtienen de 4 a 6 rebanadas con señal fluorescente brillante de cada cerebro con éxito electroporado.
- Con una espátula de cuchara micro doblada y fórceps con punta fina, transfiera cuidadosamente las rodajas de cerebro con la agarosa circundante a una placa de 6 pocillos que contenga HBSS completo helado.
Precaución: Tenga cuidado de no dañar el tejido cerebral tocando el borde de agarosa alrededor de las secciones con la pinza durante la transferencia. - Procesar todos los cerebros seleccionados como se describe en los pasos 2.8.1. A 2.8.3.
- Humedecer los insertos de membrana con 100 μL de HBSS completo antes de colocar el cerebro slHielo sobre las membranas para facilitar la colocación de las rebanadas. Se pueden colocar hasta 5 rebanadas en 1 inserto de membrana.
- Cuidadosamente transferir las rebanadas en las membranas con una espátula de cuchara micro curvada y fórceps con punta fina. Tire suavemente una rebanada en la espátula tocando solamente el borde de la agarosa con la pinza y empuje suavemente la rebanada de la espátula sobre la membrana. Coloque la rebanada con una pinza y continúe transfiriendo las rebanadas restantes. Quitar el exceso de HBSS completo con una pipeta.
Nota: No se superponen las rebanadas entre sí. - Con la ayuda de un fórceps, coloque cuidadosamente los insertos de membrana con las rebanadas en una placa de 6 pocillos que contenga 1,8 ml de medio de cultivo en lonchas (ver Paso 2.4.1) e incube a 37ºC y atmósfera de dióxido de carbono al 5% hasta un lapso de tiempo Imágenes
- Retire el bloque de agarosa del molde y colóquelo en la tapa de una placa petri estéril. Corte el exceso de agarosa con una cuchilla de afeitar limpia dejando aproximadamente 2 a 3 mm por debajo de los bulbos olfativos y 1 mm de agarosa en los otros lados. Fijar el bloque de agarosa recortado con los bulbos olfativos apuntando hacia abajo a una etapa de muestra usando pegamento de cianoacrilato.
3. Imagen de lapso de tiempo
- Configuración del microscopio
- Coloque una cámara climática en el escenario de unaMicroscopio confocal invertido a 37 ◦ C y atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Utilice un detector híbrido para reducir la intensidad del láser y mejorar la viabilidad celular. Para un análisis detallado, utilice una distancia de trabajo extra larga de 40X objetivo seco con una apertura numérica de 0,6 o superior.
Nota: Todos los componentes del microscopio necesitan ser precalentados a 37 ° C durante 2 - 3 h antes de la formación de imágenes para proporcionar un enfoque estable durante el proceso de formación de imágenes.
- Coloque una cámara climática en el escenario de unaMicroscopio confocal invertido a 37 ◦ C y atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Utilice un detector híbrido para reducir la intensidad del láser y mejorar la viabilidad celular. Para un análisis detallado, utilice una distancia de trabajo extra larga de 40X objetivo seco con una apertura numérica de 0,6 o superior.
- Slice Imaging
- Seleccione una rebanada de cerebro para obtener imágenes de la placa de 6 pocillos que contiene los insertos de membrana usando un microscopio de fluorescencia invertido.
Precaución: Evite el tiempo prolongado de exposición a la luz ultravioleta, ya que esto puede causar fotodigasión celular.
Nota: Seleccione una rebanada con neuronas simples brillantes en la SVZ superior que migran radialmente hacia la superficie pial de la rebanada. Los procesos fluorescentes finos de las células gliales radiales que abarcan todo el CP indican un andamio glial radial intacto, que se utilizaD por migración radial de neuronas corticales. - Transferir el inserto de membrana con la rebanada, que se seleccionó para la formación de imágenes en lapso de tiempo, en una placa de fondo de vidrio de 50 mm de diámetro que contiene 2 ml de medio de cultivo de rebanada con la ayuda de fórceps. Coloque el plato en la cámara climática del microscopio confocal.
- Establezca la resolución a 512 por 512 píxeles y aumente la velocidad de exploración de 400 Hz a 700 Hz con el fin de aumentar la velocidad de fotogramas de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 fotogramas por segundo, respectivamente. No utilice más de dos veces el promedio. Definir una pila z a través de la región electroporada (normalmente 400-100 μm) con un tamaño de paso de 1,5 μm. Colectivamente, estos ajustes permiten una resolución y un brillo suficientes de la imagen, manteniendo el fotodigráfico bajo durante la adquisición. Comience la serie time-lapse tomando una pila z cada 30 min.
Nota: La exposición prolongada de la rebanada a la luz láser inducirá el fotodamado reduciendo la viabilidad de las células. Ajustar la expOsure tiempo a la luz láser en consecuencia. - Analizar series de lapso de tiempo usando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) o equivalente.
- Seleccione una rebanada de cerebro para obtener imágenes de la placa de 6 pocillos que contiene los insertos de membrana usando un microscopio de fluorescencia invertido.
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Resultados
Anteriormente, hemos demostrado que la deleción genética de Bcl11a por electroporación in utero perjudica la migración radial de finales de nacido de capa superior de las neuronas de proyección [ 10] . La electroporación de un vector de plásmido de ADN que contiene Cre-IRES-GFP eliminó eficazmente Bcl11a en cerebros Bx11a flox / flox condicionales 11 . Cuando se analizaron los cerebros...
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Discusión
La migración radial es un proceso clave en el desarrollo del neocórtex. Mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de este proceso puede causar graves malformaciones corticales, incluida la lissencefalia y la materia blanca heterotopia [ 1 , 2] . Recientemente demostró que Bcl11a, que se expresa en jóvenes neuronas de proyección cortical migratorias, desempeña un papel en la migración radial. Utilizamos imágenes confocales de lapso de tiempo de las ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka y Matthias Toberer por su excelente asistencia técnica, así como a Victor Tarabykin por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por una concesión de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| isoflurano | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 351146 | |
| placa de 12 pocillos | Corning | 351143 | |
| sutura quirúrgica no absorbible | Ethicon | K890H | 3/8 círculo, 13 mm, punta cónica |
| Micro Adson Pinzas Fine | Science Tools | 11018-12 | dentado, longitud: 12 cm |
| tijeras finas | Fine Science Tools | 14063-09 | angulado hacia un lado, longitud: 9 cm |
| Portaagujas Mathieu Fine | Science Tools | 12510-14 | carburo de tungsteno, longitud: 14 cm |
| pinzas de punta fina | Fine Science Tools | 11370-40 | recta, 11 cm |
| Vannas Tü Tijeras de resorte bingen | Fine Science Tools | 15005-08 | en ángulo hacia arriba, |
| pinza de anillo | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3 mm, ID, 2,2 mm, longitud: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030081 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| suero de caballo | Gibco | ||
| capilares de vidrio de | BME Gibco | 41010026 | |
| Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm | |
| sistema de anestesia | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| cámara de anestesia | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| cartucho de filtro fluosorber | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| agarosa de bajo punto de fusión | Invitrogen | 16520100 | |
| micrótomo de cuchilla vibratoria | Leica | VT1200 S | |
| microscopio estereoscópico de fluorescencia | Leica | M205 FA | |
| microscopio estereoscópico | Leica | M125 | |
| microscopio de cultivo de tejidos de fluorescencia invertida | Leica | DM IL LED | |
| microscopio de barrido láser confocal | Detector híbrido Leica | TCS SP5II | |
| Objetivo | Leica | HyD | |
| , 40x/0.60 NA | 11506201 | ||
| Leica Life Imaging Services | Cube, Brick & Inserto | ||
| Millipore | PICM0RG50 | ||
| micromolinillo | Narishige | EG-45 uso de | ángulo de 38 grados para biselar |
| el microinyector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofeno | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Molde |
| emdedding | Polysciences | 18986-1 | |
| plásmido libre de endotoxinas maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminina | Sigma | L2020 | |
| poli-L-lisina | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucosa | Sigma | G6152 | |
| cloruro de calcio | Sigma | C7902 | |
| sulfato de magenio | Sigma | M2643 | |
| bicarbonato de sodio | Sigma | S6297 | |
| electroporador de onda cuadrada | Sonidel | CUY21EDIT | |
| pinzas con electrodos de disco de platino de 5 mm | Sonidel | CUY650P5 | |
| extractor de micropipetas | Sutter Instrument | P-97 | |
| caja de filamento | Sutter Instrument | FB255B | 2,5 mm x 2,5 mm |
| espátula de microcuchara | VWR | 231-0191 Plato con fondo de | 185 mm x 5 mm |
| , 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
Referencias
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
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