Combinación de imágenes Raman y Análisis Multivariante para visualizar Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en el Muro de la Célula Vegetal

Summary

Este protocolo tiene como objetivo presentar un método general para visualizar la lignina, la celulosa y la hemicelulosa en las paredes celulares de las plantas usando imágenes Raman y análisis multivariante.

Abstract

La aplicación de la imagen Raman a la biomasa vegetal está aumentando porque puede ofrecer información espacial y composicional sobre soluciones acuosas. El análisis no suele requerir una preparación extensiva de la muestra; La información estructural y química se puede obtener sin etiquetado. Sin embargo, cada imagen Raman contiene miles de espectros; Esto plantea dificultades al extraer información oculta, especialmente para componentes con estructuras químicas similares. Este trabajo introduce un análisis multivariado para abordar esta cuestión. El protocolo establece un método general para visualizar los componentes principales, incluyendo lignina, celulosa y hemicelulosa dentro de la pared celular de la planta. En este protocolo, se describen procedimientos para la preparación de muestras, adquisición espectral y procesamiento de datos. Es altamente dependiente de la habilidad del operador en la preparación de la muestra y en el análisis de los datos. Mediante el uso de este enfoque, una investigación Raman puede ser realizada por un usuario no especialista paraH-calidad de datos y resultados significativos para el análisis de la pared celular de la planta.

Introduction

La biomasa vegetal es el recurso renovable más abundante de la Tierra; está compuesta principalmente de lignina, celulosa y hemicelulosa; y se considera una fuente atractiva de bioenergía y productos químicos de base biológica¹. Desafortunadamente, puede resistir la degradación y conferir estabilidad hidrolítica o robustez estructural a la pared celular de la planta. Dicha resistencia es atribuible al área de superficie accesible, el tamaño de partícula de biomasa, el grado de polimerización, la cristalinidad de la celulosa y la lignina protectora². Por lo tanto, una comprensión completa de la naturaleza estructural y química de la pared celular de la planta es importante desde el punto de vista de la biología y la química de las plantas, así como desde el de la utilización comercial. Los análisis de química húmeda de uso común, como la cromatografía, la espectrometría de masas y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, solo proporcionan datos de composición promedio de la muestra medida. Además, estos métodos son invasivos y destruyen la estructura original del tejido vegetal³.

La técnica de imagen Raman es una poderosa herramienta para la visualización no destructiva de información química resuelta espacialmente⁴. Utiliza una luz láser para causar una dispersión inelástica con un fotón y se basa en los cambios en la polarizabilidad que surgen de las vibraciones moleculares. En este caso, el agua provoca una dispersión Raman débil, lo que hace que este enfoque sea adecuado para investigaciones in situ de muestras biológicas⁵. La aplicación de la técnica de imagen Raman a la pared celular de la planta puede dilucidar la estructura y composición de las paredes celulares de la planta en su estado nativo, con la resolución a escala de la célula individual e incluso de las capas de la pared celular⁶. Un análisis de imágenes Raman típico de la pared celular de una planta generalmente consta de tres pasos: 1) preparación de la muestra, 2) adquisición espectral y 3) procesamiento de datos.

Aunque una de las principales ventajas de las imágenes Raman es la capacidad de lograr espectros sin etiquetas y no destructivos con una preparación mínima de la muestra, el corte físico de la muestra sigue siendo necesario para exponer la superficie de interés. Este proceso debe realizarse con cuidado para obtener una superficie plana, ya que la técnica depende de mantener el foco óptico⁷. La adquisición espectral requiere un equilibrio entre la calidad de la imagen y los tiempos de adquisición extensos⁸. El procesamiento de datos tiene como objetivo extraer eficazmente la información química de los datos de la imagen, especialmente para los componentes con estructuras químicas similares, como la celulosa y la hemicelulosa. Debido a la fuerte superposición espectral, los espectros exactos son difíciles de discernir. En este caso, el análisis multivariante es un enfoque sencillo para descubrir de manera efectiva la información estructural y química que se esconde⁹. Este trabajo presenta un protocolo general que describe el uso de imágenes Raman para visualizar los componentes principales en las paredes celulares de las plantas, incluyendo lignina, celulosa y hemicelulosa.

Protocol

1. Preparación de la muestra

1. Corte un pequeño bloque de tejido (aproximadamente 3 mm x 3 mm x 5 mm) de la muestra de la planta ( por ejemplo, un tallo de álamo).
2. Sumerja el tejido en agua desionizada hirviendo durante 30 min. Se transfiere inmediatamente a agua desionizada a temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Repita este paso hasta que el tejido se hunde en el fondo del recipiente, lo que indica que el aire en el tejido se ha eliminado y que el tejido se ha ablandado.
   Nota: Para las muestras que se hunden en el fondo antes de este paso, repita este ciclo generalmente 3-5 veces.
3. Preparar alícuotas de polietilenglicol (PEG) de 20, 50, 70, 90% (v / v) en agua desionizada, así como PEG puro y mantener las soluciones a 65 ° C.
4. Incube el tejido en una serie de baños graduados de PEG para desplazar el agua y permitir que el PEG se infiltre.
   Nota: Típicamente, se utiliza PEG con un peso molecular de 2.000 (PEG2000) para incrustar.
   1. Procesar el tejido con g(C) 70% de PEG durante 2 h, (d) 90% de PEG durante 2 h, y (b) 50% de PEG durante 1,5 h, (E) 100% de PEG durante 10 h.
5. Precalentar un casete a 65 ° C en un horno. Vierta el PEG que contiene el bloque en el casete y luego coloque el bloque de tejido en la posición deseada utilizando pinzas precalentadas o agujas.
6. Enfriar lentamente el cassette y almacenar el tejido a RT hasta su uso.
7. Diseccionar el bloque de PEG que contiene el tejido objetivo en un pequeño bloque (aproximadamente 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando una cuchilla de afeitar afilada y montarlo en el micrótomo.
8. Cortar secciones delgadas del bloque de PEG (típicamente 3-10 μm).
9. Enjuague la sección con agua desionizada en un cristal de reloj 10 veces para eliminar el PEG del tejido.
10. Sumergir las secciones con tolueno / etanol (2: 1, v / v) durante 6 h para eliminar los extractos. Preparar el líquido de reacción mezclando 65 ml de agua desionizada, 0,5 ml de ácido acético y 0,6 g de cloro sódicoRito en un vaso de precipitados. Añadir una sección y 3 ml de líquido de reacción a un vial de 5 ml. Atornille la parte superior del vial.
11. Calentar el vial en un baño de agua a 75 ° C durante 2 h para eliminar la lignina del tejido. Enjuague la sección con agua desionizada en un cristal de reloj 10 veces.
12. Transferir la sección no tratada / deslignificada a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Despliegue la sección cuidadosamente con pinceles o agujas. Retire el agua desionizada extra con papel de seda.
13. Sumergir la sección en D ₂ O. Cubrir la muestra con un protector de vidrio. Sellar el protector con esmalte de uñas para evitar la evaporación del D ₂ O.

2. Adquisición Espectral

1. Abra el software de operación del instrumento del microscopio Raman confocal. Encienda el láser (longitud de onda = 532 nm), enfoque en la superficie del silicio cristalino con un objetivo de microscopio 100X y haga clic en el botón de calibración para calibrar el instrumento.
2. Cambiar el instrumentoAl modo de microscopio óptico y encienda la lámpara del microscopio. Montar el portaobjetos del microscopio sobre el escenario, con el revestimiento de la cubierta frente al objetivo.
3. Ver la muestra con un objetivo de microscopio 20X y localizar el área de interés. Aplique aceite de inmersión a la cubreobjetos y cambie al objetivo del microscopio de inmersión (60X, apertura numérica NA = 1.35). Enfoque en la superficie de la muestra.
4. Cambie el instrumento al modo de prueba Raman y apague la lámpara del microscopio.
5. Elija un área de asignación mediante una herramienta rectangular. Alterar el tamaño del paso para determinar el número de espectros obtenidos.
   Nota: Tenga en cuenta el tamaño del paso (generalmente mayor que el diámetro del punto calculado por la apertura numérica del objetivo, teóricamente 1.22λ / NA). Los tamaños debajo de esto resultarán en sobremuestreo.
6. Establezca los parámetros espectrales óptimos para obtener la mejor relación señal-ruido (SNR) y calidad espectral en un tiempo de adquisición apropiado (generalmente <8 h), depeLa adecuación de la muestra. En general, introduzca los parámetros de imagen en el software del instrumento de la siguiente manera: láser (532 nm), filtro (100%), agujero (300), hendidura (100), espectrómetro (1.840 cm ^-1 ), ranuras (1200t) Aceite 60X) y tiempo de adquisición (2 s).
7. Guarde los datos espectrales antes de procesar los datos y convertirlos a un formato universal ( por ejemplo, archivos TXT).

3. Análisis de datos

1. Cargar los datos espectrales (archivos TXT) en el software de análisis de datos ( por ejemplo, Matlab). Aplicar una técnica de reducción de ruido en el conjunto de datos para mejorar la SNR ( por ejemplo, el algoritmo de Savitzsky-Golay o el algoritmo wavelet)
2. Utilice muestras no tratadas para producir las imágenes de lignina y polisacáridos. Para la obtención de imágenes de lignina, considere el pico espectral alrededor de 1.600 cm ^-1 debido a la vibración de estiramiento simétrica del anillo aromático. Para la obtención de imágenes de polisacáridos (incluyendo celulosa y hemicelulosa), utilice el pico espectral aAlrededor de 2.889 cm ^-1 debido a los tramos CH y CH ₂ .
3. Utilizar muestras deslignificadas para generar las imágenes de celulosa y hemicelulosa. Realizar la auto-modelación de la curva de resolución (SMCR) en los espectros adquiridos para discriminar los espectros de celulosa y hemicelulosa y la imagen de sus distribuciones.
4. Realizar análisis de componentes principales (PCA) y análisis de agrupamiento en los datos adquiridos para distinguir los espectros Raman de diferentes capas de pared celular.

Results

La Figura 1 presenta una visión general de un sistema micro-Raman típico para la imagen Raman de una pared celular de una planta. Como ejemplo, los espectros Raman originales del álamo ( Populus nigra L.) tienen deriva y espigas de línea de base significativas ( Figura 2a ). Después de realizar el método de preprocesamiento automático para el conjunto de datos de imágenes Raman (APRI), estos dos contaminantes espectrale...

Discussion

La pared celular de la planta es un compuesto que se organiza en varias capas, incluyendo la esquina de la celda (CC), la pared secundaria (SW, con las capas S1, S2 y S3) y la lámina central compuesta (CML, Pared), lo que hace difícil obtener una superficie plana durante la preparación de la muestra. Por lo tanto, las muestras de plantas, especialmente hierba, que tiene una estructura más complicada que la madera, a menudo necesitan solidificarse para permitir una sección fina. PEG es una matriz dura ideal para el corte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtomo	Thermo Scientific	Microm HM430
Microscopio Raman Confocal	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Horno	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040