Este trabajo describe la estandarización de un método para obtener poblaciones de células germinales purificadas de tejido testicular de diferentes especies de mamíferos. Es un protocolo directo que combina la disociación mecánica de los testículos, la tinción con Hoechst-33342 y el yoduro de propidio, y la clasificación FACS, con amplias aplicaciones en estudios comparativos de la biología reproductiva masculina.
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Artículo de método
Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) ha sido uno de los métodos de elección para aislar las poblaciones enriquecidas de células germinales testiculares de mamíferos. Actualmente, permite la discriminación de hasta 9 poblaciones de células germinales murinas con alto rendimiento y pureza. Esta alta resolución en la discriminación y purificación es posible debido a cambios únicos en la estructura de la cromatina y la cantidad a lo largo de la espermatogénesis. Estos patrones pueden ser capturados por citometría de flujo de células germinales masculinas teñidas con colorantes fluorescentes de unión a ADN tales como Hoechst-33342 (Hoechst). En este documento se describe detalladamente un protocolo recientemente desarrollado para aislar células germinales testiculares de mamíferos. En pocas palabras, las suspensiones de células individuales se generan a partir de tejido testicular por disociación mecánica, se tiñen doblemente con Hoechst y yoduro de propidio (PI) y se procesan mediante citometría de flujo. Una estrategia de gating serie, incluida la selección de células vivas (PI negativo) con diferentes contenidos de ADN (Hoechst intensidad), iS utilizados durante la clasificación FACS para discriminar hasta 5 tipos de células germinales. Estos incluyen, con las correspondientes purezas medias (determinadas por la evaluación microscópica): espermatogonias (66%), espermatocitos primarios (71%) y secundarios (85%) y espermátides (90%), (87%) subpoblaciones. La ejecución de todo el flujo de trabajo es sencilla, permite el aislamiento de 4 tipos de células simultáneamente con la máquina FACS apropiada y se puede realizar en menos de 2 h. A medida que el tiempo de procesamiento es crucial para preservar la fisiología de las células ex vivo , este método es ideal para estudios de alto rendimiento a la baja de la biología de células germinales masculinas. Además, un protocolo estandarizado para la purificación multiespecies de células germinales de mamíferos elimina fuentes metodológicas de variables y permite un único conjunto de reactivos para diferentes modelos animales.
Introducción
Dada la ausencia de un sistema in vitro representativo de la progresión de la espermatogénesis y la presencia de gran heterogeneidad celular en los testículos, los estudios de la biología de células germinales masculinas requieren técnicas robustas para aislar poblaciones enriquecidas de tipos celulares específicos. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) ha sido ampliamente utilizada para este propósito 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , ya que proporciona alto rendimiento y pureza y supe....
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos a continuación cumplieron con las regulaciones del Comité de Estudios Animales de la Universidad de Washington en St. Louis.
1. Preparaciones para el Protocolo de Disociación Mecánica
- Pre-humedezca un cartucho de desagregación desechable desechable de 50 μm para disociar un testículo murino completo.
NOTA: Este cartucho de desagregación de tejido desechable contiene microcuchillas diseñadas para cortar tejidos y una malla de acero inmóvil con aproximadamente 100 orificios hexagonales. Se dispone de diferentes tamaños de malla para el cartucho de desagregación de tejidos....
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Resultados
Suspensiones de una sola célula por disociación mecánica de tejido testicular
La Figura 2 compara suspensiones de células individuales obtenidas por disociación mecánica de tejido testicular de ratón bajo diferentes condiciones. Las muestras obtenidas mediante el procesamiento de tejido fresco, sin teñir ( Figura 2A ) o teñidas con Hoechst ( Figura 2.......
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Discusión
Teniendo en cuenta la dinámica de la cromatina altamente conservada durante la espermatogénesis en los mamíferos, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para aislar las células germinales masculinas en distintas etapas de diferenciación de diferentes tejidos testiculares de mamíferos ( Figura 1 ). Uno de los principales obstáculos en la aplicación de un único flujo de trabajo a diferentes modelos animales es la necesidad de ajustes específicos de la especie, especialmente .......
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Divulgaciones
Todos los autores declaran que no hay intereses en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen al hospital animal de la ladera (St. Louis, MO) para los testículos del perro; Jason Arand y el laboratorio del Dr. Ted Cicero en la Universidad de Washington en St. Louis (WashU) por proporcionar testículos de rata y Tabers Brianne para ayudar con la colección; Jared Hartsock y el Dr. Salt's Lab en WashU para los testículos de cobaya; Y el Dr. Michael Talcott en la División de Medicina Comparada en WashU para el testículo de cerdo en miniatura. Los autores también reconocen Alvin J. Siteman Cancer Center en la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y Barnes-Jewish Hospital en St. Louis, MO, para el uso del Siteman Flow Cytometr....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldehído | VWR | #15710 | 4% PFA, Para la fijación de células clasificadas |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | Sistema para la disociación de los testículos |
| 1X Dulbecco modificado Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, para la disociación de testículos |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Cartucho de desagregación para la disociación de testículos |
| Suero fetal bovino | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, para la colección FACS Hoechst |
| 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, para la tinción FACS |
| 40 y micro; filtro de células m | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | Para disociación de testículos |
| 100x 15 mm placa de Petri | Falcon | #351029 | Para disección de testículos |
| 5 mL tubos de polipropileno de fondo redondo | Falcon | #352063 | Para la colección FACS |
| 1,5 mL Tubos Eppendorf | VWR | #20170-650 | Para la colección FACS |
| Jeringa innecesaria de 3 mL | BD Biosciences | #309657 | Para la disociación de los testículos |
| 50 mL tubo cónico | MIDSCI | Para la disociación de los testículos | |
| Yoduro de propidio | Invitrogen | #L7011 | PI, para tinción FACS |
| Clasificador de células MoFlo Legacy | Beckman Coulter | #ML99030 | para FACS |
| Summit Software de clasificación de células | Beckman Coulter | #ML99030 | para FACS |
| Solución salina tamponada con fosfato | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, para microscopía |
| Portaobjetos microscópicos de vidrio | Fisher Scientific | #12-544-4 | Para microscopía |
| Cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | #12-548-87 | Para microscopía |
| Pipeta de transferencia desechable (3 mL) | Samco Scientific | #225 | Para la disociación de testículos |
| DNasa I | Roche | #10104159001 | Para la disociación de testículos |
| Cuchilla quirúrgica de acero al carbono | Miltex | #4-111 | Para disección de testículos |
| Contador de células automatizado Countess | Invitrogen | #C10227 | Para el recuento automático de células |
| Solución de azul de tripán (0,4%) | Sigma | #T8154 | Para la tinción de viabilidad |
Referencias
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr ....
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Reimpresiones y permisos
